Introduction
5,8,10 - - 13,17,23またはRNA 7,22定期的な3,4,7、前の核酸の自己組立作業1-25は、DNA 2を含む複雑な構造の様々な成功構築につながっています22とアルゴリズム5二次元格子、リボン10,12およびチューブ4,12,13、3次元結晶17、多面体11と有限、2Dは7,8を整形します。 21,25 - 16,18 -特に効果的な方法は、単一の足場鎖が複雑な形状9,14を形成するために、多くの短い補助ステープルストランドによって折り畳まれることにより足場のDNA折り紙、です。
我々は最近、一本鎖のタイル（SST）を使用して、所定の2次元形状を有する個別のナノ構造を構築するための方法を報告し、DNA折り紙26に匹敵する複雑さを有する構造を示しました。このarticleは私達の初期の作品26の適応であり、正確に所定の寸 法（幅と長さ）および形態と洗練された有限の2次元形状に個別にアドレス指定するSSTを配置するための詳細なプロトコルを記述します。 SST方式の一つの重要な利点は、そのモジュール性です。構造体のすべてのコンポーネントのSSTアセンブリでモジュール構造単位として機能し、これらの海面水温の異なるサブセットは、異なる形状を作り出します。したがって、我々は短い、合成DNA鎖から所定の大きさや形状でナノ構造を構築するための一般的なプラットフォームを確立しました。
海面水温は、それぞれ10または11ヌクレオチド長の4つのドメイン（ 図1A）を含みます。海面水温は、その平行ヘリックスは、クロスオーバー結合によって一緒に保持されたDNA格子を作成するように結合します。各クロスオーバーは、リン酸が見やすくするための図で人為的に延伸されるドメイン2と3の間にリン酸塩です。クロスオーバーは、（離れて2ヘリカルターン（21塩基）を離間されています<強い>図1B）。複合長方形はヘリックスとヘリカル巻き数にそれらの寸法によって参照されます。たとえば、6ヘリックス幅で、8ヘリカルが長くなります長方形が8Tの長方形×6Hとして参照されます。海面水温は、取り残さ追加、またはその他の任意の形状と大きさ（ 図1C）の構造を作成するために再配置することができます。例えば、長方形のデザインは、所望の長さと半径（ 図1D）で管にロールバックすることができます。
あるいは、矩形SST格子はそれぞれ3 NMが7nmでによって、SSTの画素からなる分子キャンバスとみなすことができます。本研究では、310全長内部海面水温、左右の境界を構成する24の完全長海面水温、および上部と下部の境界を形成する28の半分の長さの海面水温の分子キャンバスを使用しています。キャンバスは、クロスオーバーによってリンクされた24の二重らせんを有し、各螺旋は28ヘリカルターン（294塩基）を含有し、したがってと呼ばれます28T矩形キャンバス×24H。 28Tキャンバス×24Hは、M13ファージの足場から作成されたDNA折り紙構造と同様の分子量を有します。
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Protocol
1. DNA配列設計
- 28Tキャンバス×24Hを作成するために、二重らせん、各二重らせんのための上部と下部の螺旋の長さの数、およびクロスオーバーパターンを指定することで、SST-有限構造を設計するためにUNIQUIMERソフトウェア27を使用してください。これらのパラメータを定義した後、全体的なアーキテクチャ（鎖組成および相補配列）は、プログラムにグラフで示されています。
- 相補配列と追加要件（もしあれば）を満たすために指定された構造の鎖のための配列を生成します。 （構造体の大部分の）配列の対称性28を最小化することにより、DNA配列を設計します。
- ヌクレオチド（A、C、GおよびT）1によってランダムに1を生成します。
- 塩基対形成の規則次の生成されたものと相補的なマッチヌクレオチド：TへのAおよびその逆; C Gへ、またその逆。
- 8または9ヌクレオチドを超えて繰り返しセグメントを使用しないでください。ときにこのような担当者反復セグメントの要件が満たされるまで、セグメントは、設計時に現れる食べ、最も最近に生成されたヌクレオチドを変異させます。
- 4つの連続したA、C、GまたはTの塩基を使用しないでください。
- 両方の場合、例えば （リンケージ点の周りに拠点をスライド避けるために（鎖のほとんどのために、それぞれ、第二十一及び第二十二のヌクレオチドとして、例えばTとGのために）一本鎖の結合点であらかじめ指定されたヌクレオチドを使用してください第二十一及び第二十二ヌクレオチドは、第二十二のヌクレオチド）が結合することになっていることを第二十一のヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合することが可能であった、Tでした。
- ストレプトアビジン標識、チューブに長方形の変換、異なる四角形と異なるスケール全体のチューブを形成するための手動のDNA配列を変更し、SSTの露出ドメインによって引き起こされる凝集を防止します。
- ポリT TRAとの分子キャンバスの境界上に露出したドメインを交換してくださいCTS。
- ストレプトアビジン標識のために、彼らは3 'ビオチン修飾を有する抗ハンドル鎖を収容することができるようにハンドルセグメント（例えば、抗ハンドル鎖として相補的な対応品と結合することができる成分鎖に付加された余分のセグメント）を設計。
- チューブに長方形の変換のために、四角形から上部と下部の行を削除し、その海面水温一番上の行の2番目と一番下の行に2番目の上の対応するタイルに特有の相補性を有する新しい行を挿入します。
- 異なる形状の露出一本鎖ドメインの場合、10〜11ヌクレオチドの長さのポリTセグメントと交換、または露出したドメインに相補的であり、10〜11ヌクレオチド長のポリTセグメントで終了エッジプロテクターによってカバーしています。
分子キャンバスの調製
- oligonucleotiからRNaseフリー水に溶解し、指定の配列のDNA成分鎖を得ます標準脱塩、10 nmolのスケールで合成されたオリゴヌクレオチドとV底96ウェルプレート中のデメーカー。遠心600×gで約10秒間、DNA鎖と、96ウェルプレート。
- ピペット2ミリリットル試験管にストランドあたり100μM（メーカー仕様）で28Tの長方形（ 図3A）×24HのためのDNA鎖と362ウェルのそれぞれから1μL。ストランドあたり200 nMの濃度で鎖混合物のストック溶液を作製するために2ミリリットル試験管に蒸留脱イオンH 2 Oの138μlを添加します。
- 0.2に鎖混合物の200 nMのストック溶液50μl、10×アニーリングバッファーA（50 mMトリス、pHが7.9、10mMのEDTA、250のMgCl 2）を10μl、および蒸留脱イオンH 2 O40μlのを追加します。 mlのPCRチューブ。これは、1×アニーリング緩衝液A（5 mMトリス、pHが7.9、1 mMのEDTA、25mMのMgCl 2を）における分子キャンバス100μlのサンプルになります。
- samplをアニール90°Cから25°Cに冷却し、サーマルサイクラーで17時間の電子。プログラムサーマルサイクラーとしては、次のとおりです。°Cあたり5分の一定速度で61℃まで90℃からランプダウン。 C°ごとに20分の一定速度で25℃まで60℃からランプダウン。試料をサーマルサイクラーから取り出すことができるまで4℃でインキュベートします。
- ネイティブの2％アガロースゲルを準備します。
- 600ミリリットルのビーカーにアガロースの2.4グラムを測定します。ビーカーに0.5×TBE緩衝液（44.5 mMトリス - ホウ酸、pHが8.3、1 mMのEDTA）および蒸留脱イオン水30mlを120mlのを追加します。
- 3分（ - 沸騰後60秒以上または40）のための電子レンジ。 2％アガロースゲル中の濃度を維持するのに役立つ水30mlの添加により蒸発中に失われた水分を補給。
- 冷水浴中で1分間、ビーカーの内容物を渦巻。 1.2 MのMgCl 2 1mlを（ゲル中の10mMのMgCl 2濃度を作るために）追加し、ゲルウィットを前染色SYBR安全色素のH 6μL（1：20,000）。
- 乾燥ゲルボックスにゲル溶液を注ぎ、厚さ1.5mmの12ウェルゲル電気泳動コームを挿入します。でも、プラットフォーム上で30分 - 溶液を15のために固化してみましょう。
- ゲルボックスにゲルランニングバッファー（44.5 mMトリス-ホウ酸、pHが8.3、1 mMのEDTA、および10mMのMgCl 2）を注ぎます。負荷2 - アガロースゲルのウェルに1キロバイトのDNAラダーを3μl。分子キャンバスのサンプル20μlの6Xのブロモフェノールブルー色素（0.25％ブロモフェノールブルー、5 mMトリス、1mMのEDTA、10mMのMgCl 2を、30％グリセロール）の4μLを混合し、ウェル別にソリューションをロードアガロースゲル。
- 氷水浴中で100 Vで2時間のネイティブ2％アガロースを実行します（それは時間を実行している場合は2時間が適切であることを指標とすることができるように青で示さブロモフェノールブルーは、速い成分の鎖よりも実行されます）。
- 画像ゲルをSYBR安全な染色（ 図2Bのための適切なフィルターを用いてゲルスキャナーを使用して、
- 青色光トランスイルミネーター上で、シャープなきれいなカミソリの刃を用いて、1 kbのDNAラダーの1,500塩基対のバンドに類似した移動度を有する支配的なバンドを切り出します。スピンカラムに所望のゲル片（複数可）を配置し、マイクロチューブ乳棒を用いて微細片にゲルを粉砕。 4℃で3分間、438×gで遠心分離します。
- 260nmでの紫外線分光光度計を用いてDNAの濃度を測定します。
- マシンを較正するためにブランクとして超純DNアーゼ/ RNaseフリー蒸留水2μLを使用してください。
- DNA濃度の推定値を得るためにスピンカラムから採取した試料の等量を使用してください。 260 nmでのUV吸収で得られた測定濃度値（ "" = NG /μl）を、AFMおよびTEMイメージングのための希釈係数を判断するのに役立ちます。
- b。次の「B」（nm）に「A」（ng /μLで）から測定された濃度=×10 6 /（330変換します＆＃215;ヌクレオチドの数）。
注：ヌクレオチドの分子量は330グラム/モルです。計算されたモル濃度値は、AFM及びTEMイメージングのために希釈係数を決定します。 60 ng /μLで - 28T矩形×24Hの場合については、精製された試料についての一般的な測定値は約10です。 12 nMの - そのような構造体のヌクレオチド数は14616 Daがあるので、モル濃度は約2です。最終濃度は、収集収率によって決定される - 遠心分離し、ゲルのバンドのボリュームから（〜20〜50％）（体積が大きいほど、より精製された試料を希釈）切り出し。
3.原子間力顕微鏡イメージング
- 平坦な表面を取得し、撮影台上に試料ディスクを配置するためにスコッチテープを使用して試料の金属板に取り付けられたマイカをはがし。
- 28T×24Hの精製試料の - （5 nMの2）5μlを、続いて1×アニーリング緩衝液Aの40μLを追加新鮮に切断雲母表面に長方形。混合物を約2分間沈降することができます。
- カンチレバーホルダーにAFM窒化シリコンカンチレバーチップを取り付けます。 C三角形のヒント（0 = 40共振周波数f、 - 75 kHzのを、ばね定数k = 0.24ナノメートル-1）イメージングのため。
- 画像流体タッピングモードのサンプル。 - 1ヘルツ（ 図2C）スキャン2μmのサイズ、解像度1024ライン、および0.5のスキャン速度：スキャンについては、次の撮像パラメータを使用してください。
- 必要に応じて、29を結合DNA、マイカの強度を増加させるために10μL以上の10mMののNiCl 2溶液を加えます。
ストレプトアビジン標識のため4.サンプル調製
- 手動で特定の位置にハンドルストランドが順番にstreptavidに結合することが可能であるビオチン修飾を有する抗ハンドル鎖に相補的であるように組み込まれているように、28Tの長方形×24Hを設計具体的で。
- 底部には一番上の行に14のタイルと14タイルにスペーサーとして二塩基配列（TT）で構成され、3 '17ヌクレオチドセグメントおよび15ヌクレオチドのハンドル（GGAAGGGATGGAGGA）を取り付けることにより、分子のキャンバスを変更長方形（ 図3A）の行は、境界を標識します。この配列は、3 'ビオチン修飾抗ハンドルストランド（TCCTCCATCCCTTCCビオチン）に相補的です。
- 内部標識のために、8つの内部のタイルと長方形（ 図4A）の6境界タイルに3 '17ヌクレオチドセグメントを接続します。
- 200 nMのストック溶液を作るために28Tの長方形（334ストランド）×24Hの成分の鎖の残りの部分とハンドル（境界標識）と28本の鎖を混ぜます。 200 nMのストック溶液を得るために、28Tの長方形（348ストランド）×24Hの成分の鎖の残りの部分とハンドル付き14ストランド（内部標識）を混ぜます。
- BOのためundaryラベリング、0.1に鎖の200 nMのストック溶液50μl、100μMのビオチン修飾抗ハンドルストランドの6μlを、10×アニーリング緩衝液A、および蒸留脱イオン水34μlに10μlを添加する - 0.2 mlのPCR試験管。成分鎖の最終濃度は100nMであり、抗ハンドルビオチン修飾された鎖の最終濃度は6,000 nMです。抗ハンドルビオチン修飾された鎖が結合が良好にするために、100％を超えているので、28T矩形×24Hに抗ハンドルビオチン修飾された鎖の結合の28分子ことに注意してください。
- 内部標識のために、0.1に鎖の200 nMのストック溶液50μl、100μMで内部抗扱うビオチン修飾された鎖の3μlを、10×アニーリング緩衝液Aを10μl、蒸留脱イオン水を37μlを添加します - 0.2ミリリットルPCR試験管。成分鎖の最終濃度は、100 nmおよび抗ハンドルビオチンMODIFIの最終濃度であります ED鎖は3,000 nMです。 28Tの長方形×24Hに対する抗扱うビオチン修飾された鎖の結合の14分子が非常に抗ハンドルビオチン修飾された鎖が結合が良好にするために、100％を超えていることに注意してください。
- 2.3で説明した手順を用いて、17時間、サーマルサイクラーに両方のサンプルをアニール。
- ステップ2.4で説明したように、ネイティブ2％アガロースゲルを準備します。
- ステップ2.5で説明したように、両方のサンプルを精製します。
- ステップ2.6で説明したように、所望のDNA構造の濃度を測定します。
ストレプトアビジン標識のための5原子間力顕微鏡
- イメージステップ3（ 図3Bおよび4B）に記載されるようにAFMを用いて、各サンプル。
- 撮影の最初のラウンドの後、サンプルミリリットルの10mg /でストレプトアビジン1μLのに続いて1×アニーリング緩衝液Aの40μlを添加します。混合物は、（ 図3Cおよび図4C）を再イメージングする前に、約2分間沈降することができます。
- 四角形に基づいてチューブを設計するためには、上部と下部の行以外の場所でのコンポーネント海面水温のすべてを保持します。その海面水温チューブ立体構造（ 図5A）に、元の四角形を環化するために、それぞれの列の最上部と最下部の半タイルを連結することによって設計された新しい行を導入します。
- 200 nMのストック溶液を得るために、上部と下部の行を除く28T矩形×24Hの成分ストランド（336ストランド）でストランドの新しい行（14ストランド）を混ぜます。
- 2.7（ 図5B） -ゲル精製は、2.2ステップに従ってください。
7.透過型電子顕微鏡イメージング
- 2％水性ギ酸ウラニル染色溶液を調製し、蒸留水3mlにウラニルギ0.06gのを秤量します。注射器に取り付けた0.2μmのフィルターを使用して、2％水溶液ウラニルギ染色液をフィルタリングします。
- の5μLを追加5 N NaOHをろ過染色溶液1mlに。簡単に説明すると20,000×gで溶液および遠心分離機をボルテックス。
- 25ミリアンペア、45秒、0.1バール、負のハイテンション極性：グロー次の設定で炭素被覆グリッドを（コーティングされた側を上に）放電します。
- エッジからのグロー放電処理されたグリッドをつかむために自己閉鎖鉗子を使用してください。
- 4分間のグリッド上のサンプルの3.5μLをピペット。側からグリッドに接触して濾紙にすることによって、サンプルをオフに吸い上げるために、フィルタ紙を使用してください。
- すぐに1分間のグリッド上に染色液の3.5μlを添加します。
- ウィック7.4のように汚れをオフし、1グリッドに対するろ紙ホールド - 2分。
- 10 Kから80 K（ 図5C）の範囲の倍率で80 kVので操作するJEOL JEM-1400を用いたTEM試料ホルダと、画像にグリッドを転送します。
8. Moleculを使用して任意の形状の構築ARキャンバス
- 形状を特定し、分子キャンバス上の形状に対応ストランドを選択します。例えば三角形状の場合、分子のキャンバスのための206 362うちストランドを選択します。
- 10ポリTセグメントと（つまり三角形の斜辺に沿って、ある）が露出ドメインを置換する- 11ヌクレオチドの長さ（ 図6Aの設計1）、または露出したドメインに相補的であるエッジプロテクターを追加し、それを終了します10 -凝集を防止するために、11ヌクレオチド長のポリTセグメント（ 図6Aの設計2）。
注：単純に（プロテクターストランドを使用せずに）三角形の画素に対応するSSTをアニールは、凝集、ゲル上の明確な生成物のバンドの形成につながります。それは多くのリソースが効率的であるように、様々な形状のため、エッジプロテクターのデザインを使用します。それはFIGUR（交換の設計でさらに14組に比べて、鎖の唯一の4つの追加セット（ 図6C）が必要ですE 6B）。 - コアセット（362 SSTキャンバス）、セット1 *（SSTのドメイン1に結合エッジプロテクター）を含む310ピクセル分子キャンバス、ドメイン2に結合するセット2 *（エッジプロテクターのための鎖ライブラリーを作成します。 SST）の、SSTのドメイン3に結合する3 *（エッジプロテクター）を設定し、設定は4 *（SSTのドメイン4）に結合するエッジプロテクターは1344エッジプロテクターの合計を与えるために。
- 約10秒ごとに異なるセットの96ウェルプレートを遠心します。ピペットうち、特定の形状のためのストック溶液を作製するために、プレートから所望の鎖。
- エッジプロテクター、ピペット2ミリリットルの遠心分離に1コアセットから206ストランドのμL、0セット1 *から、0セット2 *から、セット3 *から0とセット4 *から24ストランドと三角形の形状チューブ。 DNA鎖の400 nMのストック溶液を作製するために、チューブに蒸留脱イオン水20μlを加えます。
- DNAストラの400 nMのストック溶液50μlを追加します。 NDS、10×アニーリング緩衝液B（50 mMトリス、pHが7.9、10mMのEDTA、125のMgCl 2）ストック溶液および40μlの10μlを0.2ミリリットルのPCRチューブに、脱イオンH 2 Oを蒸留しました。これは、鎖当たり約200 nMの濃度のストランドと1Xアニーリング緩衝液B（5 mMトリス、pHが7.9、1 mMのEDTA、12.5のMgCl 2）中の三角形の100μlのサンプルになります。
- ステップ2.3で説明したように17時間のためのサーマルサイクラーで、混合物をアニール。
- ステップ2.4で説明したように、ネイティブ2％アガロースゲルを準備します。
- ステップ2.5で説明したように、サンプルを精製します。
- ステップ2.6で説明したように、DNAの濃度を測定します。
- 画像ステップ3で説明したようにAFM下でのサンプル（ 図7Cおよび7D）。
- ピックと同じ鎖ライブラリーを使用して異なる形状のためのストランドを混ぜます。さまざまなソリューションをアニールし、AFMイメージング時間を節約するために、異なる形状の精製されたサンプルを結合。
- 複雑な形状の設計を支援するために、カスタムのMATLABプログラムを使用します。
- ロボット液体ハンドラにピペッティング配列の形で指示を提供するためにソフトウェアを使用してください。選択して目標形状を構成するストランドを混合するためのロボット液体ハンドラを使用してください。
注：形状設計および鎖混合は、人的エラーを削減し、建設少ない労働集約するために自動化しました。
10.四角形とさまざまなスケールアクロスチューブ
- 単に平行ヘリックス（H）の数と螺旋巻き（T）の数を変えることによって異なるサイズの矩形（ 図10）を構築します。
- 特定の大きさの長方形のためのステップ3に従ってください。
- 特定のサイズのチューブのための手順6に従ってください。
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Representative Results
海面水温の自己集合（図1）は、図2に示すように、28T矩形×24Hをもたらす。別の海面水温のためのDNA配列は、ストレプトアビジン標識（図3及び4）の形質転換を可能にするように最適化/改変することができます様々なサイズのチューブや長方形を形成するためにチューブに長方形（ 図5）、海面水温のプログラム可能な自己集合（図10）、および分子キャンバス（図8）を使用して、任意の2次元形状の構造。溶液は、任意の形状（図7）の露出した領域に沿って凝集するように2つのデザイン（ドメイン代替設計およびエッジプロテクタ設計）を試験しました。どちらのデザインは、同等のゲルの収量および構造的完全性を有しているが、それは少数の補助種（図6）を必要とするため、エッジプロテクターのデザインは、よりコスト効果的です。図9に示すように、ストランドピッキングとの混合は、人的エラーを削減し、時間を節約するために、自動化することができます。
一本鎖のタイルを使用した分子形状の図1.自己集合。 （A）12から適合標準的なSSTモチーフ、（B）左と真ん中：組み立てられた海面水温の二つの描写。インナー海面水温は、42塩基の全長を持ち、境界海面水温は、21拠点を持っており、「L」とラベル付けされている間、「U」とラベル付けされています。左図では、色が異なるドメインを区別する。真ん中の図では、色が異なる鎖を区別します。右：SST構造のレンガの壁の図の概略図。厚いレンガフル海面水温と薄いレンガが境界海面水温されています。丸いエッジには、相補ペアリングを示さありません。真ん中の図のように、色は個々のタイルを区別します。すべてのDIAGでラム、各タイルは、ユニークな配列を有している。（C）は 、このような三角形（左）または矩形リングなど、さまざまな所望の形状を形成する際の図Bの結果に長方形のデザインを構成するSSTコレクションから鎖の適切な選択を源泉徴収します（右）。（D）所定の幅と長さのチューブのデザイン。（E）SST配列（上）の合成前のプールを考えると、任意の形状（下）はに鎖のサブセットを選択することによって設計することができます鎖混合物（ダークブルーピクセル）に使用し、残りの部分（水色ピクセル）を排除します。この図は、以前に公開された図26から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
28T長方形×24H図3.境界の標識。（A）特定のBIの模式図28T矩形×24Hをotin標識。青色で表示ストランドは、ハンドルストランドです。鎖は、3 'ビオチン（黒丸）で標識した抗ハンドルストランドである赤色で強調表示しました。ストレプトアビジンは、オレンジ色の球として示されている（B）AFM像は、ストレプトアビジン（スキャンサイズ：1ミクロン×1ミクロン）を添加する前に。。（C）AFM像ストレプトアビジン（走査サイズ：1ミクロン×1ミクロン）を添加した後。挿入図、成功の標識を示すの拡大表示。ストレプトアビジンは、それらの隆起した高さに白のドットやストライプのいずれかとして現れたことに注意してください。この図は、以前に公開された図26から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4の28T長方形 ×24Hのternalラベリング。 （A）28T矩形×特定のビオチン標識した24Hの模式図。青色で表示ストランドは、ハンドルストランドです。鎖は、3 'ビオチン（黒丸）で標識した抗ハンドルストランドである赤色で強調表示しました。ストレプトアビジンは、オレンジ色の球として示されている（B）AFM像は、ストレプトアビジン（スキャンサイズ：1ミクロン×1ミクロン）を添加する前に。。（C）AFM像ストレプトアビジン（走査サイズ：1ミクロン×1ミクロン）を添加した後。挿入図、成功の標識を示すの拡大表示。そのストレプトアビジンが上昇高さに起因する白点や縞模様のいずれかと思われた注意してください。この図は、以前に公開された図26から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図5.設計と28Tチューブ×24HのTEM像。 （A）28Tバレル×24Hの模式図。二つの上部にズームインしたビューと底面を示し、詳細なセグメントのID。なお、セグメントa24.x *（ 例えば、a24.13 *）とb24.x *（ 例えば、b24.12 *）a24.xセグメントに相補的である一番上の行の（ 例えば、a24.13）とb24.x （ 例えば、b24.12）一番下の行の。そのような相補性は、管状構造の形成をもたらすことが期待される。（B）2％天然アガロースゲル電気泳動。 U、未精製; （レーンUからゲル抽出により）で精製P、（C）バレル構造のTEM像（スケールバー：100nmで）。この図は、以前に公開された図26から変更されています。ighres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6.露出スティッキドメインによって発生防止アグリゲーションに2つのデザイン。 （A）が露出領域をカバーするために二つの方法のサイド·バイ·サイドのデモ。対になっていない粘着性のドメイン（ドメイン4）は、赤、破線のボックスで示されています。設計1は、対になっていないドメインが（赤と「T」と表示された中で示されている）、ポリT領域で置換されたドメインの代替設計です。デザイン2は、エッジプロテクター鎖と対になっていないドメインをカバーすることを含むエッジプロテクターの設計、である（赤で示され、「T-4 * "と名付けられました）。エッジプロテクター鎖が露出したドメインへのポリT部および補体から構成されている。ドメイン置換（デザイン1）に関連した（B）の異なる可能な境界設定を。（青色で表示）内部SSTが露出したドメインまたはドメインを残すことができる14種類の方法があります。適切な鎖置換は、それぞれの状況に赤色で示されている。（C）エッジプロテクター設計（デザイン2）。一つの内部SST（青）は、この設計を用いて露光領域をカバーする唯一の4つのエッジプロテクターストランド（赤）が必要です。この図は、以前に公開された図26から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
SSTトライアングル7. 2つの設計図。 （A）及び（B）は、それぞれ、図8の設計1（ドメインの置換）および設計2（エッジプロテクタ）に基づく回路図を示します。ポリT領域（図中のT10またはT11）は、以下のように描かれていますブロック図に丸みを帯びたコーナー。挿入図は、破線のボックスで示された構造の拡大図を示しています。スケールバーは100nm（C）及び（D）は AFM像です。この図は、以前に公開された図26から変更されています。
8.図と100異なる形状のAFM像を図。構造設計は、トップパネルに表示されます。ダークブルー着色は鎖が含ま示している水色の着色が混合物から左キャンバス鎖を示しています。明確にするために、エッジプロテクタストランドは省略する。各構造体の対応するAFM像は、その設計の下に表示されます。各画像は、エリア内の150ナノメートル×150 nmです。 100ユニークな形状があります。 10アラビア数字、ラテンアルファベットの26の大文字、23句読点とkeyboaも含まれています目のシンボル、10顔文字、9占星術のシンボル、6漢字、およびいくつかのその他のシンボル。この図は、以前に公開された図26から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図9.ロボットオートメーションフロー図。この図は、混合プロセスを自動化するために使用されるワークフローを示しています。まず、カスタムMATLABプログラムは、所望の形状を設計するために使用されます。再び、ダークブルーの長方形はストランドが混合物中に含まれることを示します。設計が完了すると、プログラムは、ロボット液体ハンドラのピペット操作命令のセットを出力します。ロボットはプラットにある特定の形状に適した鎖の正しい濃度をピペットEよく。混合物を次に、得られた形状のAFM画像化に続いてワンポットアニールを受けます。 （この図は、以前に公開された図26から変更されている）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
さまざまなスケールを越えた長方形やチューブの図10.自己組織化。 （A）（左から右へ）、以下の設計寸法のSSTの長方形のAFM像：4H×4T、6H×7T、10T、14T×12H、20T、28T×24H、および34T×36H×18H×10H（ B）構造体の分子量は、対数スケールです。アスタリスクは、基準のような典型的なM13 DNA折り紙構造の重量を示している。（C）TEM像177T×8H×28T、8H×55T、8H×84T、28T×24H、12Hおよび：（左から右へ）、以下の設計寸法のSST管の。すべてのスケールバーは100nmでを示しています。この図は、以前に公開された図26から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
構造形成工程では、自己組織化DNAナノ構造のDNA鎖の混合物（ 例えば 、15 mM）のマグネシウムカチオンの適切な濃度を維持することが重要です。同様に、アガロースゲル特性評価/精製工程では、ゲル電気泳動中にDNAナノ構造を保持するゲルランニング緩衝液中で、適切なマグネシウムカチオン濃度（ 例えば 、10ミリモル）を維持することが重要です。 28T矩形構造×24Hのために、我々は異なるのMg ++濃度でアニーリングをテストし、構造は典型的には10の範囲内に形成されたことがわかった- （約20 mMのMg ++を持つ最高の形成収率）を30mMのMg ++。
足場折り紙の構造とは異なり、SST構造はモジュラーアーキテクチャを採用しています。異なる形状は、SSTタイルの適切なサブセットを選択することにより、同一のキャンバスから設計することができます。さらに、SST構造があちこち組み立てられます短い合成DNA鎖をMと折り紙のアプローチで使用される長い足場を必要としません。したがって、SST構造のサイズは、利用可能な足場の長さによって制限されません。 DNA折り紙のアプローチは、多くの場合、折り畳まれた構造または折り畳まれていない単量体のいずれかを生成するように最適化することができるがしかし、SSTは、部分的に形成された構造になることがあり、したがって、その後の使用のためにゲル精製を必要とし得ます。また、原因足場鎖の欠如に、SSTの構造は、そのDNA折り紙の対応よりも「脆い」することができます。 SSTアプローチとDNA折り紙アプローチの両方が高速で進化していると、ユーザーは最高の彼または彼女の特定の機能のニーズに合った方法を選択することをお勧めします。
これは、SSTのアプローチによって示されるように、ローカルの結合相互作用によって媒介される小単量体の何百も、所定のグローバルな形状に自己組織化することができることが顕著です。 SSTアプローチ翔に示す基本原則DNA鎖、およびこの資料に記載された基本的な方法の横の材料に一般化することがULD、適切に変更した後、多様な材料から自己組織化複雑な構造の構成を有効にする必要があります。
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Acknowledgments
この作品は、米海軍研究若手研究プログラム賞N000141110914、海軍研究助成N000141010827のオフィス、NSFキャリアアワードCCF1054898、NIHディレクターの新イノベーター賞1DP2OD007292のオフィスと（PY）は生物学的にインスパイア工学部スタートアップ基金ウィス研究所によって資金を供給させました清華 - 北京（BW）はライフサイエンススタートアップ基金センター。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Strands | Integrated DNA Technology | Section 3.1 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | Section 3.4.2 |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | BIO-RAD | 731-6166 | Section 3.6 |
| Bruker's Sharp Nitride Lever Probes | Bruker AFM Probes | SNL10 | Section 4.3 |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | Section 3.6 |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428 000.414 | Section 3.6 |
| Transmission Electron Microscope | Jeol | Jem 1400 | Section 7.4 |
| Multimode 8 | Veeco | Section 4 | |
| Typhoon FLA 9000 Laser Scanner | GE Heathcare Life Sciences | 28-9558-08 | Section 3.5 |
| Ultrapure Distilled water | Invitrogen | 10977-023 | Section 3.7.1 |
| Mica disk | SPI Supplies | 12001-26-2 | Section 4.1 |
| Steel mounting disk | Ted Pella, Inc. | 16218 | Section 4.1 |
| carbon coated copper grid for TEM | Electron Microscopy Sciences | FCF400-Cu | Section 7.2 |
| tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 7.31 |
| glow discharge system | Quorum Technologies | K100X | Section 7.2 |
| DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler | BIO-RAD | PTC–0240G | Section 3.3 |
| Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | ThermoScientific | B2 | Section 3.4.3 |
| Seekam LE Agarose 500G | Lonza | 50004 | Section 3.4.1 |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp | ThermoScientific | SM1333 | Section 3.4.4 |
| Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer | ThermoScientific | Section 3.7 | |
| 0.2 um filter | Corning Inc. | 431219 | Section 7.1.2 |
References
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