Den Bioconjugation og radiosynthesis av⁸⁹ Zr-DFO-merkede antistoffer

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

Den eksepsjonelle affinitet, spesifisitet og selektivitet av antistoffer gjør dem svært attraktive vektorer for tumormålrettet PET radiofarmasøytika. På grunn av deres multi-dagers biologisk halveringstid, må antistoffene merkes med positron-emitterende radionuklider med relativt lange fysisk råte halveringstider. Tradisjonelt har positron-emitterende isotoper ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 timer) og ⁶⁴ Cu (t _todel = 12,7 timer) har blitt brukt til å merke antistoffer for PET billeddiagnostikk. I den senere tid har imidlertid feltet vært vitne til en dramatisk økning i bruken av positron-emitterende radiometall ⁸⁹ Zr i antistoffbaserte PET-avbildningsmidler. ⁸⁹ Zr er en nesten ideell radioisotop for PET-avbildning med immunkonjugater, som det har en fysisk halv -livet (t _1/2 = 78,4 t) som er kompatibel med de in vivo farmakokinetikken av antistoffer og avgir en relativt lav eneRGY positron som produserer bilder med høy oppløsning. Videre kan antistoffer bli oversiktlig merket med ⁸⁹ Zr hjelp av siderofor-avledet chelator desferrioksamin (DFO). I denne protokollen vil prostata-spesifikt membran antigen antistoff rettet J591 brukes som et modellsystem for å illustrere (1) bioconjugation av det bifunksjonelle chelateringsmiddel DFO-isotiocyanat til et antistoff, (2) den radiosynthesis og rensing av en ⁸⁹ Zr- DFO-mAb radioimmunkonjugat, og (3) in vivo PET avbildning med en ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunkonjugat i en murin modell av kreft.

Introduction

På grunn av deres bemerkelsesverdige følsomhet, affinitet og selektivitet, har antistoffer lenge vært ansett som lovende vektorer for levering av radioisotoper til kreftceller. Imidlertid har sin søknad i positronemisjonstomografi (PET) bildebehandling blitt hemmet av mangel på et passende positron-emitting radioisotop for deres merking. ^1-3 En av de mest kritiske betraktninger i utformingen av radioimmunoconjugates er samsvar den fysiske forfallet halv- levetiden av radioisotopen til de in vivo farmakokinetikk til antistoffet. Mer spesifikt antistoff har ofte forholdsvis lange, flere dager biologiske halveringstider og må derfor være merket med radioisotoper med sammenlignbare fysikalske halveringstider. For PET bildebehandlingsprogrammer, har antistoffer tradisjonelt vært radiomerket med ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 timer), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 timer), eller ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d). ^{4, 5} Imidlertid, for hvertdisse radioisotoper besitter betydelige begrensninger som hindrer deres egnethet for klinisk imaging. Mens radioimmunoconjugates merket med ⁸⁶ Y og ⁶⁴ Cu har vist seg lovende i prekliniske undersøkelser, begge isotoper har fysiske halveringstider som er for kort til å være effektive for avbilding hos mennesker. ¹²⁴ I, i motsetning til dette har en nesten ideell fysisk halveringstid etter avbildning med antistoffer, men det er dyrt og har suboptimale falltidskarakteristikk som fører til forholdsvis lav oppløsning kliniske bilder. Videre kan ¹²⁴ I-merket radioimmunoconjugates være gjenstand for dehalogenering in vivo, en prosess som kan redusere tumor-til-bakgrunnsaktivitetsforhold. ^6,7

Stasjonen for å finne et positron-emitting radioisotop å erstatte ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y, og ¹²⁴ jeg i radioimmunoconjugates har drevet siste økningen i forskning på ⁸⁹ ZR-merkede antistoffer. ^8-12 THan årsak til ankomsten av ⁸⁹ Zr er enkel: radiometall besitter nesten ideelle kjemiske og fysikalske egenskaper for anvendelse i diagnostiske PET radioimmunoconjugates ^{13 89} Zr blir dannet via ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ Zr reaksjon på en syklotron ved hjelp av en. kommersielt tilgjengelige og 100% naturlig rikelig ⁸⁹ Y målet. ^14,15 Den radiometall har et positron utbytte på 23%, avtar med en halveringstid på 78,4 timer, og slipper ut positroner med forholdsvis lav energi på 395,5 keV (figur 1). ^13,16,17 Det er viktig å merke seg at ⁸⁹ Zr avgir også en høy energi 909 keV γ-stråle med 99% effektivitet. Mens dette utslippet ikke forstyrrer energimessig med de slippes ut 511 keV fotoner, krever det ekstra hensyn med hensyn til transport, håndtering, og dosimetri. Til tross for dette forbeholdet, disse falltidskarakteristikk til slutt føre til at ⁸⁹ Zr har ikke bare en mer gunstig hAlf-liv for avbildning med antistoffer enn ⁸⁶ y og ⁶⁴ Cu, men kan også frembringe bilder med høyere oppløsning enn ¹²⁴ I, som sender ut positroner med høyere energier av 687 og 975 keV, samt et antall fotoner med energier innenfor 100 til 150 keV i på 511 keV positron-laget fotoner. ¹³ Dessuten er ⁸⁹ Zr også sikrere å håndtere og mindre kostbart å produsere, og residualizes i tumorer mer effektivt enn dens motstykke radiojod. ^18,19 En mulig begrensning av ⁸⁹ Zr er at det ikke trenger et terapeutisk isotopologue, f.eks, ⁸⁶ Y (PET) vs. ⁹⁰ Y (terapi). Dette utelukker bygging av kjemisk identiske, surrogatkontrastmidler som kan brukes som dosimetriske speidere for sine terapeutiske kolleger. Når det er sagt, undersøkelser tyder på at ⁸⁹ ZR-merkede antistoffer har potensial som bildebehandlings surrogater for ⁹⁰ Y- og ¹⁷⁷ Lu-merket immunkonjugater.^20,21

Fra et kjemisk standpunkt, som et gruppe IV-metall, ⁸⁹ Zr eksisterer som en 4-kation i vandig oppløsning. Zr ⁴⁺ ion er sterkt belastet, relativt stor (effektiv ionisk radius = 0.84 Å), og kan klassifiseres som en "hard" kation. Som eksempel, oppviser det en preferanse for ligander som bærer opp til åtte harde, anioniske oksygengivere. Lett den vanligste chelator brukt i ⁸⁹ Zr-merket radioimmunoconjugates er desferrioksamin (DFO), en siderofor-avledet, asyklisk chelator peiling tre hydroksamat grupper. Liganden stabilt koordinerer Zr ⁴⁺ kation raskt og rent ved RT i biologisk relevante pH-nivåer, og den resulterende Zr-DFO kompleks forblir stabil i løpet av flere dager i saltvann, blodserum, og fullblod. ²² Beregnings studiene tyder DFO som danner et kompleks med hexacoordinate Zr ⁴⁺ hvor metallet senter er koordinert til tre neutral og tre anioniske oksygen giverne av liganden samt to eksogene vann ligander (Figur 2). ^23,24 In vivo oppførsel av radioimmunoconjugates ansette den ⁸⁹ Zr-DFO konjugering stillaset har generelt vært utmerket. Men i noen tilfeller har bildebehandling og akutte biofordelingsstudier avslørt forhøyede aktivitetsnivå i beina i mus injisert med ⁸⁹ ZR-merkede antistoffer, data som tyder på at osteophilic ^{89 4+} kasjon Zr frigjøres fra chelatoren in vivo og senere mineralizes i beinet. ²⁵ Nylig, spesielt ligander en rekke undersøkelser i utviklingen av romanen ⁸⁹ Zr ⁴⁺ chelatorene med åtte oksygen givere har dukket opp i litteraturen. ^24,26,27 Likevel, i dag, DFO er den mest utbredte ansatt kelator i ⁸⁹ Zr-merket radioimmunoconjugates med god margin. En rekke forskjelligebioconjugation strategier har blitt anvendt for å feste DFO til antistoffer, inkludert bioorthogonal klikk kjemi, omsetning av tiol-reaktive DFO konstruksjoner med cysteiner i antistoffet, og omsetning av aktivert ester bærende DFO konstruksjoner med lysiner i antistoffet. ^{4,28- 30} Det mest vanlige strategien har imidlertid vært bruken av et isotiocyanat bærende derivat av DFO, DFO-NCS (figur 2). ²² Det kommersielt tilgjengelige bifunksjonell chelator robust og pålitelig danner stabile, kovalente bindinger med thiourea lysinene i antistoff (figur 3).

I løpet av de siste årene, har et bredt utvalg av ⁸⁹ Zr-DFO-merket radioimmunoconjugates blitt rapportert i litteraturen. Prekliniske undersøkelser har vært spesielt rikt, med antistoffer som strekker seg fra den mer kjente cetuximab, bevacizumab, og trastuzumab til mer esoteriske antistoffer som CD105-targeting TRC105 og fPSA målretting 5A10. ^30-36 Mer nylig har et lite antall av tidlig-fase kliniske forsøk med ⁸⁹ Zr-DFO-merkede antistoffer dukket opp i litteraturen. Spesielt har grupper i Nederland publiserte studier som syssels ⁸⁹ Zr-DFO-cmAb U36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomabtiuksetan, og ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 I tillegg er en rekke andre kliniske studier med ⁸⁹ ZR-merkede radioimmunoconjugates er for tiden i gang, inkludert undersøkelser her på Memorial Sloan Kettering Cancer Center ved hjelp av PSMA målretting ⁸⁹ Zr-DFO-J591 for prostatakreft bildebehandling og HER2-targeting ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab for brystkreft imaging. ^{23, 30} I tillegg, mens radiomerkede antistoffer forbli de vanligste ⁸⁹ Zr-merket radiofarmaka, radiometall har også i økende grad blitt benyttet med andre vektorer, inkludert peptider, proteiner og nanomaterialer. ^38-43 </sup>

Den modularitet av dette ⁸⁹ Zr-DFO merking metodikk er en enorm ressurs. Repertoaret av biomarkør-targeting antistoffer er stadig voksende, og interessen i å utføre in vivo PET avbildning ved hjelp av disse konstruksjonene vokser i raskt tempo. Som et resultat, tror vi at utviklingen av mer standardiserte rutiner og protokoller kan være til nytte feltet. En utmerket skrevet eksperimentell protokoll for DFO-NCS konjugering og ⁸⁹ Zr radiomerking har allerede blitt publisert av Vosjan, et al. ²² Vi føler at visuell demonstrasjon levert av dette arbeidet ytterligere kan hjelpe etterforskerne nye til disse teknikkene. I protokollen for hånden, vil prostata-spesifikt membran antigen antistoff rettet J591 brukes som et modellsystem for å illustrere (1) bioconjugation av det bifunksjonelle chelateringsmiddel DFO-isotiocyanat til et antistoff, (2) den radiosynthesis og rensing av det ⁸⁹ Zr-DFO-mAb'et radioimmunkonjugat,og (3) in vivo PET avbildning med en ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunkonjugat i en murin modell av kreft. ^23,44,45

Protocol

Alle de in vivo dyreforsøk beskrevet ble utført i henhold til godkjent protokoll og under de etiske retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Bøyning av DFO-NCS til J591 I et 1,7 ml mikrosentrifugerør, forberede en 2-5 mg / ml oppløsning av J591 i 1 ml av enten 1 x fosfatbufret saltløsning (pH 7,4) eller 0,5 M HEPES-buffer (pH 7,4). Oppløse DFO-NCS i tørr DMSO i en konsentrasjon mel…

Representative Results

Det første trinnet i denne protokollen konjugering av DFO-NCS til antistoffet er vanligvis ganske robust og pålitelig. Vanligvis kan det rensede, chelator-modifisert immunkonjugatet oppnås i et utbytte> 90%, og ved hjelp av tre molare ekvivalenter av DFO-NCS i den innledende konjugeringsreaksjonen vil gi en grad-av-merking av chelator på omtrent 1,0 til 1,5 DFO / mAb'et. De 89 radiomerkings Zr og rensetrinn av fremgangsmåten er likeledes enkel. Ved de konsentrasjoner som er beskrevet i protokollen…

Discussion

Mens bygging, radiomerking, og avbildning av ⁸⁹ Zr-DFO-stemplet radioimmunoconjugates er generelt en ganske enkel prosedyre, er det viktig å holde noen viktige hensyn i tankene under hvert trinn i prosessen. For eksempel, kanskje den mest sannsynlige årsak til bekymring i konjugasjon trinn i prosedyren er aggregering av antistoffet under konjugeringsreaksjonen. Dette problemet er oftest et produkt av dårlig blanding av konjugeringsreaksjonen etter tilsetningen av den DFO-NCS stamløsning. ²² Nå…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide