Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.
Den exceptionella affinitet, specificitet och selektivitet av antikroppar gör dem utomordentligt attraktiva vektorer för tumörinriktade PET radioaktiva läkemedel. På grund av deras flera dagar biologisk halveringstid, måste antikroppar märkas med positron-emitterande radionuklider med relativt långa fysiska sönderfallshalveringstider. Traditionellt positron-emitterande isotoper 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 tim), och 64 Cu (t 2/1 = 12,7 tim) har använts för att märka antikroppar för PET-avbildning. På senare tid har dock fältet bevittnat en dramatisk ökning av användningen av positron-emitterande radiometall 89 Zr i antikroppsbaserade PET imaging agenter. 89 Zr är en nästan perfekt radioisotop för PET avbildning med immunkonjugat, eftersom den har en fysisk halvan -Livet (t 2/1 = 78,4 tim) som är kompatibel med de in vivo farmakokinetiken för antikroppar och avger en relativt låg -enRGY positron som producerar högupplösta bilder. Vidare kan antikroppar rakt märkta med 89 Zr använder siderofor-härledda kelator desferrioxamin (DFO). I detta protokoll kommer prostataspecifikt membranantigen inriktning antikropps J591 användas som ett modellsystem för att illustrera (1) i biokonjugering av bifunktionella kelator DFO-isotiocyanat till en antikropp, (2) den radiosynthesis och rening av en 89 Zr- DFO-mAb radioimmunoconjugate, och (3) in vivo PET avbildning med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate i en musmodell av cancer.
På grund av deras anmärkningsvärda känslighet, affiniteten och selektiviteten har antikroppar länge ansetts lovande vektorer för leverans av radioisotoper till cancerceller. Dock har deras tillämpning i positronemissionstomografi (PET) avbildning hämmats av bristen på en lämplig positron-emitterande radioisotop för sin märkning. 1-3 En av de mest kritiska överväganden vid utformningen av radioimmunoconjugates är att matcha den fysiska förfall halv- liv av radioisotopen till de vivo farmakokinetiken av antikroppen i. Mer specifikt antikroppar har ofta relativt långa, flerdagars biologiska halveringstider och därför måste märkas med radioisotoper med jämförbara fysiska halveringstider. För PET bildprogram, har antikroppar traditionellt varit radioaktivt med 64 Cu (t 1/2 = 12,7 tim), 86 Y (t 1/2 = 14,7 tim), eller 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 Men var och en avDessa radioisotoper besitter betydande begränsningar som hämmar deras lämplighet för klinisk avbildning. Medan radioimmunoconjugates märkta med 86 Y och 64 Cu har visat lovande prekliniska undersökningar, båda isotoper besitter fysiska halveringstider som är för kort för att vara effektiv för avbildning i människor. 124 Jag, däremot, har en nästan perfekt fysikalisk halveringstid för avbildning med antikroppar, men det är dyrt och har suboptimala sönderfallsegenskaper som leder till relativt låg upplösning kliniska bilder. Vidare kan 124 I-märkt radioimmunoconjugates vara föremål för dehalogenering in vivo, en process som kan sänka tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden. 6,7
Satsningen på att hitta en positron-emitterande radioisotop att ersätta 64 Cu, 86 Y och 124 jag i radioimmunoconjugates har underblåst den senaste tidens uppsving i forskningen på 89 Zr-märkta antikroppar. 8-12 THan skäl för tillkomsten av 89 Zr är enkel: den radiometall besitter nästan perfekt kemiska och fysikaliska egenskaper för användning i diagnostiska PET radioimmunoconjugates 13 89 Zr produceras via 89 Y (p, n) 89 Zr reaktion på en cyklotron med hjälp av en. kommersiellt tillgängliga och 100% naturligt rikligt 89 Y mål. 14,15 Den radiometall har en positron avkastning på 23%, sönderfaller med en halveringstid på 78,4 timmar, och avger positroner med relativt låg energi av 395,5 keV (Figur 1). 13,16,17 Det är viktigt att notera att 89 Zr avger också en hög energi, 909 keV γ-stråle med 99% effektivitet. Även om detta utsläpp inte stör energiskt med de utsända 511 keV fotoner, det kräver extra hänsyn när det gäller transporter, hantering och dosimetri. Trots denna varning, dessa sönderfallsegenskaper innebär i slutändan att 89 Zr har inte bara en mer gynnsam half-liv för avbildning med antikroppar än 86 Y och 64 Cu men kan också ge högre upplösning än 124 I, som avger positroner med högre energier 687 och 975 keV samt ett antal fotoner med energier inom 100-150 keV av de 511 keV positron-skapade fotoner. 13 Dessutom är 89 Zr också säkrare att hantera, billigare att tillverka, och residualizes i tumörer mer effektivt än dess radiojod motsvarighet. 18,19 En potentiell begränsning av 89 Zr är att den inte har en terapeutisk isotopologue, t.ex., 86 Y (PET) vs 90 Y (terapi). Detta utesluter byggandet av kemiskt identiska, surrogat agenter avbildnings som kan användas som dosimetriska scouter för sina terapeutiska motsvarigheter. Som sagt, utredningar tyder på att 89 Zr-märkta antikroppar har potential som avbildnings surrogat för 90 Y- och 177 Lu-märkta immunkonjugat.20,21
Ur kemisk synpunkt, som en grupp IV metall, existerar 89 Zr som +4 görs i vattenlösning. Den Zr 4+ jon mycket laddad, relativt stora (effektiv jonradie = 0,84 Å), och kan klassificeras som en "hård" katjon. Som sådan uppvisar den en preferens för ligander som bär upp till åtta hårda, anjoniska syredonatorer. Lätt den vanligaste kelator användes i 89 Zr-märkta radioimmunoconjugates är desferrioxamin (DFO), en siderofor härledd, acykliska chelator bär tre hydroxamat grupper. Den liganden samordnar stabilt Zr 4+ katjon snabbt och snyggt vid RT på biologiskt relevanta pH-nivåer, och den resulterande Zr-DFO komplex förblir stabil under loppet av flera dagar i saltlösning, blodserum, och helblod. 22 Computational studier tyder starkt att DFO bildar en hexacoordinate komplex med Zr 4+ i vilken metallkärnan är koordinerad till tre Neutral och tre anjoniska syre givare av liganden samt två exogena vattenligander (Figur 2). 23,24 In vivo beteende radioimmunoconjugates utnyttjar 89 Zr-DFO konjugering klätterställning har generellt varit utmärkt. Men i vissa fall har bildbehandling och akuta biodistributionsstudier avslöjade förhöjda aktivitetsnivåer i benen av möss som injicerats med 89 Zr-märkta antikroppar, data som tyder på att osteophilic 89 Zr 4+ katjon frigörs från kelator in vivo och därefter mineralizes i benet. 25 Nyligen speciellt ligander ett antal utredningar i utvecklingen av nya 89 Zr 4+ kelatorer med åtta syredonatorer har dykt upp i litteraturen. 24,26,27 Ändå närvarande DFO är den mest sysselsatta kelator i 89 Zr-märkta radioimmunoconjugates med bred marginal. En mängd olikabiokonjugering strategier har använts för att fästa DFO till antikroppar, inklusive bioorthogonal klick kemi, reaktionen av tiolreaktivt DFO-konstruktioner med cysteiner i antikroppen, och reaktionen av aktiverad ester bärande DFO-konstruktioner med lysiner i antikroppen. 4,28- 30 Lätt den vanligaste strategin har dock varit användningen av ett isotiocyanat bärande derivat av DFO, DFO-NCS (Figur 2). 22 Detta kommersiellt tillgängliga bifunktioneli kelator robust och tillförlitligt bildar stabila, kovalenta tiokarbamid kopplingar till lysinema av antikropp (Figur 3).
Under de senaste åren har ett stort antal 89 Zr-DFO-märkta radioimmunoconjugates rapporterats i litteraturen. Prekliniska undersökningar har varit särskilt riklig, med antikroppar som sträcker sig från de mer välkända cetuximab, bevacizumab, och trastuzumab till mer esoteriska antikroppar såsom CD105-inriktning TRC105 och fPSA-targeting 5A10. 30-36 På senare tid har ett litet antal tidiga fas kliniska prövningar med 89 Zr-DFO-märkta antikroppar uppstått i litteraturen. Specifikt har grupper i Nederländerna publicerade studier som sysselsätter 89 Zr-DFO-cmAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, och 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Dessutom en rad andra kliniska prövningar med 89 ZR-märkta radioimmunoconjugates pågår, inklusive undersökningar här på Memorial Sloan Kettering Cancer Center med hjälp av PSMA-targeting 89 Zr-DFO-J591 för prostatacancer avbildning och HER2-targeting 89 Zr-DFO-trastuzumab för bröstcancer avbildning. 23, 30 Dessutom medan radiomärkta antikroppar fortfarande de vanligaste 89 Zr-märkta radiofarmaka, den radiometall har också allt varit anställd med andra vektorer, inklusive peptider, proteiner och nanomaterial. 38-43 </sup>
Modularitet detta 89 Zr-DFO märkningsmetod är en enorm tillgång. Repertoaren av biomarkörer inriktning antikroppar är ständigt expanderande, och intresset för att utföra in vivo PET avbildning med dessa konstruktioner växer i snabb takt. Som ett resultat, tror vi att utvecklingen av mer standardiserade metoder och protokoll kan dra nytta fältet. En utmärkt skriven försöksprotokoll för DFO-NCS konjugering och 89 Zr radiomärkning har redan publicerats av Vosjan, et al. 22 Vi anser att den visuella demonstrationen från detta arbete ytterligare kan hjälpa utredarna nya till dessa tekniker. I protokollet till hands, kommer prostataspecifikt membranantigen inriktning antikropps J591 användas som ett modellsystem för att illustrera (1) i biokonjugering av bifunktionella kelator DFO-isotiocyanat till en antikropp, (2) den radiosynthesis och rening av 89 ZR-DFO-mAb radioimmunoconjugate,och (3) in vivo PET avbildning med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate i en musmodell av cancer. 23,44,45
Medan bygg-, radiomärkning, och avbildning av 89 Zr-DFO-labled radioimmunoconjugates är i allmänhet ett ganska enkelt förfarande, är det viktigt att hålla några viktiga överväganden i åtanke under varje steg i processen. Till exempel, kanske den mest sannolika orsaken till oro under konjugering steg i proceduren är sammanläggning av antikroppen under konjugeringsreaktionen. Detta problem är oftast en produkt av dålig blandning av konjugeringsreaktionen efter tillsats av DFO-NCS stamlösning. <su…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Prof. Thomas Reiner, Dr Jacob Houghton, och Dr. Serge Lyaschenko för hjälp konversationer.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
p-SCN-Bn-DFO | Macrocyclics | B-705 | Store at -80 °C |
[89Zr]Zr-oxalate | Various, including Perkin-Elmer | – | Caution: Radioactive material |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Store at room temperature |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC805024 | Store at room temperature |
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper | Agilent Technologies | SGI0001 | Cut into strips 0.5 cm wide |