Den biokonjugering och radiosynthesis av⁸⁹ Zr-DFO-märkta antikroppar

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

Den exceptionella affinitet, specificitet och selektivitet av antikroppar gör dem utomordentligt attraktiva vektorer för tumörinriktade PET radioaktiva läkemedel. På grund av deras flera dagar biologisk halveringstid, måste antikroppar märkas med positron-emitterande radionuklider med relativt långa fysiska sönderfallshalveringstider. Traditionellt positron-emitterande isotoper ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 tim), och ⁶⁴ Cu (t _2/1 = 12,7 tim) har använts för att märka antikroppar för PET-avbildning. På senare tid har dock fältet bevittnat en dramatisk ökning av användningen av positron-emitterande radiometall ⁸⁹ Zr i antikroppsbaserade PET imaging agenter. ⁸⁹ Zr är en nästan perfekt radioisotop för PET avbildning med immunkonjugat, eftersom den har en fysisk halvan -Livet (t _2/1 = 78,4 tim) som är kompatibel med de in vivo farmakokinetiken för antikroppar och avger en relativt låg -enRGY positron som producerar högupplösta bilder. Vidare kan antikroppar rakt märkta med ⁸⁹ Zr använder siderofor-härledda kelator desferrioxamin (DFO). I detta protokoll kommer prostataspecifikt membranantigen inriktning antikropps J591 användas som ett modellsystem för att illustrera (1) i biokonjugering av bifunktionella kelator DFO-isotiocyanat till en antikropp, (2) den radiosynthesis och rening av en ⁸⁹ Zr- DFO-mAb radioimmunoconjugate, och (3) in vivo PET avbildning med en ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate i en musmodell av cancer.

Introduction

På grund av deras anmärkningsvärda känslighet, affiniteten och selektiviteten har antikroppar länge ansetts lovande vektorer för leverans av radioisotoper till cancerceller. Dock har deras tillämpning i positronemissionstomografi (PET) avbildning hämmats av bristen på en lämplig positron-emitterande radioisotop för sin märkning. ^1-3 En av de mest kritiska överväganden vid utformningen av radioimmunoconjugates är att matcha den fysiska förfall halv- liv av radioisotopen till de vivo farmakokinetiken av antikroppen i. Mer specifikt antikroppar har ofta relativt långa, flerdagars biologiska halveringstider och därför måste märkas med radioisotoper med jämförbara fysiska halveringstider. För PET bildprogram, har antikroppar traditionellt varit radioaktivt med ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 tim), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 tim), eller ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d). ^{4, 5} Men var och en avDessa radioisotoper besitter betydande begränsningar som hämmar deras lämplighet för klinisk avbildning. Medan radioimmunoconjugates märkta med ⁸⁶ Y och ⁶⁴ Cu har visat lovande prekliniska undersökningar, båda isotoper besitter fysiska halveringstider som är för kort för att vara effektiv för avbildning i människor. ¹²⁴ Jag, däremot, har en nästan perfekt fysikalisk halveringstid för avbildning med antikroppar, men det är dyrt och har suboptimala sönderfallsegenskaper som leder till relativt låg upplösning kliniska bilder. Vidare kan ¹²⁴ I-märkt radioimmunoconjugates vara föremål för dehalogenering in vivo, en process som kan sänka tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden. ^6,7

Satsningen på att hitta en positron-emitterande radioisotop att ersätta ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y och ¹²⁴ jag i radioimmunoconjugates har underblåst den senaste tidens uppsving i forskningen på ⁸⁹ Zr-märkta antikroppar. ^8-12 THan skäl för tillkomsten av ⁸⁹ Zr är enkel: den radiometall besitter nästan perfekt kemiska och fysikaliska egenskaper för användning i diagnostiska PET radioimmunoconjugates ^{13 89} Zr produceras via ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ Zr reaktion på en cyklotron med hjälp av en. kommersiellt tillgängliga och 100% naturligt rikligt ⁸⁹ Y mål. ^14,15 Den radiometall har en positron avkastning på 23%, sönderfaller med en halveringstid på 78,4 timmar, och avger positroner med relativt låg energi av 395,5 keV (Figur 1). ^13,16,17 Det är viktigt att notera att ⁸⁹ Zr avger också en hög energi, 909 keV γ-stråle med 99% effektivitet. Även om detta utsläpp inte stör energiskt med de utsända 511 keV fotoner, det kräver extra hänsyn när det gäller transporter, hantering och dosimetri. Trots denna varning, dessa sönderfallsegenskaper innebär i slutändan att ⁸⁹ Zr har inte bara en mer gynnsam half-liv för avbildning med antikroppar än ⁸⁶ Y och ⁶⁴ Cu men kan också ge högre upplösning än ¹²⁴ I, som avger positroner med högre energier 687 och 975 keV samt ett antal fotoner med energier inom 100-150 keV av de 511 keV positron-skapade fotoner. ¹³ Dessutom är ⁸⁹ Zr också säkrare att hantera, billigare att tillverka, och residualizes i tumörer mer effektivt än dess radiojod motsvarighet. ^18,19 En potentiell begränsning av ⁸⁹ Zr är att den inte har en terapeutisk isotopologue, t.ex., ⁸⁶ Y (PET) vs ⁹⁰ Y (terapi). Detta utesluter byggandet av kemiskt identiska, surrogat agenter avbildnings som kan användas som dosimetriska scouter för sina terapeutiska motsvarigheter. Som sagt, utredningar tyder på att ⁸⁹ Zr-märkta antikroppar har potential som avbildnings surrogat för ⁹⁰ Y- och ¹⁷⁷ Lu-märkta immunkonjugat.^20,21

Ur kemisk synpunkt, som en grupp IV metall, existerar ⁸⁹ Zr som +4 görs i vattenlösning. Den Zr ⁴⁺ jon mycket laddad, relativt stora (effektiv jonradie = 0,84 Å), och kan klassificeras som en "hård" katjon. Som sådan uppvisar den en preferens för ligander som bär upp till åtta hårda, anjoniska syredonatorer. Lätt den vanligaste kelator användes i ⁸⁹ Zr-märkta radioimmunoconjugates är desferrioxamin (DFO), en siderofor härledd, acykliska chelator bär tre hydroxamat grupper. Den liganden samordnar stabilt Zr ⁴⁺ katjon snabbt och snyggt vid RT på biologiskt relevanta pH-nivåer, och den resulterande Zr-DFO komplex förblir stabil under loppet av flera dagar i saltlösning, blodserum, och helblod. ²² Computational studier tyder starkt att DFO bildar en hexacoordinate komplex med Zr ⁴⁺ i vilken metallkärnan är koordinerad till tre Neutral och tre anjoniska syre givare av liganden samt två exogena vattenligander (Figur 2). ^23,24 In vivo beteende radioimmunoconjugates utnyttjar ⁸⁹ Zr-DFO konjugering klätterställning har generellt varit utmärkt. Men i vissa fall har bildbehandling och akuta biodistributionsstudier avslöjade förhöjda aktivitetsnivåer i benen av möss som injicerats med ⁸⁹ Zr-märkta antikroppar, data som tyder på att osteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ katjon frigörs från kelator in vivo och därefter mineralizes i benet. ²⁵ Nyligen speciellt ligander ett antal utredningar i utvecklingen av nya ⁸⁹ Zr ⁴⁺ kelatorer med åtta syredonatorer har dykt upp i litteraturen. ^24,26,27 Ändå närvarande DFO är den mest sysselsatta kelator i ⁸⁹ Zr-märkta radioimmunoconjugates med bred marginal. En mängd olikabiokonjugering strategier har använts för att fästa DFO till antikroppar, inklusive bioorthogonal klick kemi, reaktionen av tiolreaktivt DFO-konstruktioner med cysteiner i antikroppen, och reaktionen av aktiverad ester bärande DFO-konstruktioner med lysiner i antikroppen. ^{4,28- 30} Lätt den vanligaste strategin har dock varit användningen av ett isotiocyanat bärande derivat av DFO, DFO-NCS (Figur 2). ²² Detta kommersiellt tillgängliga bifunktioneli kelator robust och tillförlitligt bildar stabila, kovalenta tiokarbamid kopplingar till lysinema av antikropp (Figur 3).

Under de senaste åren har ett stort antal ⁸⁹ Zr-DFO-märkta radioimmunoconjugates rapporterats i litteraturen. Prekliniska undersökningar har varit särskilt riklig, med antikroppar som sträcker sig från de mer välkända cetuximab, bevacizumab, och trastuzumab till mer esoteriska antikroppar såsom CD105-inriktning TRC105 och fPSA-targeting 5A10. ^30-36 På senare tid har ett litet antal tidiga fas kliniska prövningar med ⁸⁹ Zr-DFO-märkta antikroppar uppstått i litteraturen. Specifikt har grupper i Nederländerna publicerade studier som sysselsätter ⁸⁹ Zr-DFO-cmAb U36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, och ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 Dessutom en rad andra kliniska prövningar med ⁸⁹ ZR-märkta radioimmunoconjugates pågår, inklusive undersökningar här på Memorial Sloan Kettering Cancer Center med hjälp av PSMA-targeting ⁸⁹ Zr-DFO-J591 för prostatacancer avbildning och HER2-targeting ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab för bröstcancer avbildning. ^{23, 30} Dessutom medan radiomärkta antikroppar fortfarande de vanligaste ⁸⁹ Zr-märkta radiofarmaka, den radiometall har också allt varit anställd med andra vektorer, inklusive peptider, proteiner och nanomaterial. ^38-43 </sup>

Modularitet detta ⁸⁹ Zr-DFO märkningsmetod är en enorm tillgång. Repertoaren av biomarkörer inriktning antikroppar är ständigt expanderande, och intresset för att utföra in vivo PET avbildning med dessa konstruktioner växer i snabb takt. Som ett resultat, tror vi att utvecklingen av mer standardiserade metoder och protokoll kan dra nytta fältet. En utmärkt skriven försöksprotokoll för DFO-NCS konjugering och ⁸⁹ Zr radiomärkning har redan publicerats av Vosjan, et al. ²² Vi anser att den visuella demonstrationen från detta arbete ytterligare kan hjälpa utredarna nya till dessa tekniker. I protokollet till hands, kommer prostataspecifikt membranantigen inriktning antikropps J591 användas som ett modellsystem för att illustrera (1) i biokonjugering av bifunktionella kelator DFO-isotiocyanat till en antikropp, (2) den radiosynthesis och rening av ⁸⁹ ZR-DFO-mAb radioimmunoconjugate,och (3) in vivo PET avbildning med en ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate i en musmodell av cancer. ^23,44,45

Protocol

Alla de in vivo djurförsök beskrivna utfördes enligt ett godkänt protokoll och under de etiska riktlinjerna i Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). 1. Konjugering av DFO-NCS till J591 I en 1,7 ml mikrocentrifugrör, förbereda en 2-5 mg / ml lösning av J591 i en ml av antingen 1x fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) eller 0,5 M HEPES-buffert (pH 7,4). Lös DFO-NCS i torr DMSO vid en koncentration…

Representative Results

Det första steget i detta protokoll konjugering av DFO-NCS till antikroppen är typiskt ganska robust och tillförlitlig. Generellt kan det renade, kelator modifierade immunkonjugat erhållas i> 90% utbyte, och med användning av 3 molekvivalenter DFO-NCS i initial konjugeringsreaktionen kommer att ge en grad-av-märkning av kelatorn av ungefär 1,0-1,5 DFO / mAb. De 89 Zr radiomärkning och reningssteg i förfarandet är också enkelt. Vid koncentrationerna anges i protokollet ovan, radiomärkning utbyte…

Discussion

Medan bygg-, radiomärkning, och avbildning av ⁸⁹ Zr-DFO-labled radioimmunoconjugates är i allmänhet ett ganska enkelt förfarande, är det viktigt att hålla några viktiga överväganden i åtanke under varje steg i processen. Till exempel, kanske den mest sannolika orsaken till oro under konjugering steg i proceduren är sammanläggning av antikroppen under konjugeringsreaktionen. Detta problem är oftast en produkt av dålig blandning av konjugeringsreaktionen efter tillsats av DFO-NCS stamlösning. <su…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide