Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering av primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske vev og dyrking dem direkte på myke, elastiske Underlag for Traction Cytometry

doi: 10.3791/52532 Published: June 4, 2015

Abstract

Kreftceller svare til matrise mekanisk stivhet på en kompleks måte ved hjelp av en koordinert, hierarkisk mekanisk-kjemisk system bestående av adhesjonsreseptorer og assosierte proteiner signaltransduksjon membran, den cytoskeletal arkitektur, og molekylære motorer 1, 2. Mechanosensitivity av forskjellige kreftceller in vitro er undersøkt primært med udødeliggjorte cellelinjer eller murine stammer primærceller, ikke med primære humane kreftceller. Derfor lite er kjent om mechanosensitivity av primære humane tykktarmskreftceller in vitro. Her blir en optimal protokoll som er utviklet som beskriver isolering av primære humane tykktarmceller fra friske kirurgiske og cancerøse humane vevsprøver. Isolerte kolon celler blir deretter dyrket med hell på myke (2 kPa stivhet) og stiv (10 kPa stivhet) polyakrylamid hydrogel og stiv polystyren (~ 3,6 GPa stivhet) substrater funksjon av en ekstracellulær matriks (fibronectini dette tilfellet). Fluorescent microbeads er innebygd i myke gels nær cellekultur overflaten, og trekkraft analysen er utført for å vurdere cellulære kontraktile påkjenninger ved hjelp av gratis open access programvare. I tillegg immunfluorescens mikroskopi på forskjellige stivhets underlag gir nyttig informasjon om primær cellemorfologi, cytoskeleton organisasjon og vinculin inneholder fokale sammenvoksninger som en funksjon av underlaget stivhet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I de senere årene har det blitt stadig tydeligere at mekanisk mikro-miljø, i tillegg til bio-kjemiske faktorer, spiller en viktig rolle i å regulere celle funksjonalitet. Celler kan sanse og svare på underlaget stivhet som de er overholdt (som i 2D kultur) eller omgitt av (som i 3D kultur) 3-7. Ved å gjøre dette, kan cellene modulere deres differensiering 3, morfologi 4, migrasjon / motilitet 5, bio-fysiske egenskaper 6, vekst 7, og andre prosesser.

Kreftceller også svare på 2D og 3D matrix stivhet ved hjelp av en koordinert, hierarkisk mekanisk-kjemisk kombinasjon av adhesjonsreseptorer og assosierte proteiner signaltransduksjon membran, den cytoskeletal arkitektur, og molekylære motorer 1, 2. For eksempel melke epitelceller (MECS) danne normal acinar parenkym når de ble dyrket på 150 Pa substrater som er lik stivhetenav sunn brystvev. Interessant, de viser kjennetegnene til et utviklings svulst, både strukturelle og transkripsjons, når dyrket på stivere underlag (> 5000 Pa) som etterligner stivhet av en svulst stroma 8. I tillegg viser en annen eksperiment som bryst tumorigenesis er ledsaget av kollagen kryssbinding og ECM stivne 9. Nyere forsøk viser at human colon carcinoma (HCT-8) celler viser metastaser som fenotypen (MLP) når de dyrkes på 2D-substrater med fysiologisk relevant stivhet (20-47 kPa), men ikke på meget stiv (3,6 GPa) substrater 10- 12 .Disse celler første form tumor-liknende cellegrupper og deretter ta avstand fra hverandre, fra periferien. Ettersom dette epitelial til avrundet morfologisk (E til R overgang) endringen skjer, de sprer, redusere celle-celle og celle-ECM heft, og bli vandrende. HCT-8 celler dyrket på svært harde polystyren underlag ikke utviser dissemaligne egenskaper. Det har således blitt antatt at HCT-8 celler blir metastatisk på grunn av deres eksponering for passende mikromiljø. Det er verdt å merke seg at disse forsøkene er utført med immortaliserte kreftcellelinjer eller murine avledet primærceller, ikke med primære humane kreftceller.

En nylig studie foreslår at augmented cellulært trekkraft stress kan brukes som en potensiell biofysisk signatur for metastatiske celler 13 sikret studien omfatter måling av trekkraften for forskjellige humane kreftcellelinjer på polyakrylamidgeler. Det er funnet at metastatiske kreftceller kan utøve betydelig høyere trekkraft belastning sammenlignet med ikke-metastatiske celler i alle tilfeller 13. Men disse resultatene direkte motsier tidligere publiserte funn på muse avledet brystkreft cellelinjer 14. Dessuten fremhever en fersk undersøkelse bemerkelsesverdige forskjeller mellom immortaliserte og primære humane celler i deres cytoskeletal ombygging protein profilering og celleoverlevelse protein uttrykk 15. Derfor er det viktig å se mange av de biofysiske tester, inkludert trekkraft for primære humane kreftceller. Dette vil ta opp spørsmålet om de primære celler rekapitulere immortalisert kreftcellelinjer trekkraft trend.

Protokollen er beskrevet her er optimalisert for isolering av primære humane tykktarmceller (både friske og kreft), og for dyrking av dem på myke underlag (polyakrylamid hydrogeler) samt på Petri-skåler. Protokollen er basert på spaltning og påfølgende enzymatisk dissosiasjon av kirurgisk vevsprøve til en enkelt cellesuspensjon 16. Så vidt vi vet er dette den første demonstrasjonen av dyrking isolert primær kolon svulsten og normale celler direkte på myke hydrogel substrater med innebygd lysrør microbeads for trekkraft Cytometry. Gjennomsiktige gel underlag også tillate farging. Denne analysen avslørte forskjeller i F-aktin organisasjon ogfokale sammenvoksninger i primære humane kolon celler som substrat stivhet endringer. Denne cellekultur plattformen åpner opp muligheten for å utforske ulike biofysiske egenskapene primære humane celler som celle stivhet og trekkraft som parametere for kreft prognostics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen er beskrevet nedenfor følger retningslinjene for UIUC menneskelig forskningsetisk komité.

1. Innsamling og fordøyelse av kirurgisk Tissue Sample

  1. Samle svulsten vevsprøve rett etter kolon reseksjon (figur 1A og 1B). Samle vev fra et tilstøtende sunn området også.
  2. Overfør vevet umiddelbart til et 15 ml hetteglass inneholdende 12 ml HBSS oppløsning. Oppbevar hetteglasset på isen inne en isolert skum boks.
  3. Transportere vevet inneholder hetteglasset til en vev kultur hette for videre behandling innen 45 min. Hold hetteglasset på en isblokk på innsiden av panseret.
  4. Hell den medfølgende vevet inn i en 6-brønners plate som inneholder 6-7 ml HBSS løsning ved hjelp av en pipette.
    Merk: Mengde vev per brønn er ikke kritisk i dette rensetrinnet.
  5. Hold 6 brønn plate på en isblokk. Skyll vevet i HBSS oppløsning to ganger.
  6. Skjær vev rent inn atskilt seksjoner med sterile SCISsor. Hakke vev i mindre seksjoner som ikke er større enn 1-2 mm i størrelse 3 med en steril skalpell blad.
  7. Veie et merket 0,1% trypsin ampulle (1 ml inneholdende 0,1% trypsin-oppløsning) før overføring i vevet. Overfør ~ 20 mg vev inn i hver av 0,1% trypsin hetteglass med en pipette.
  8. Prøv å minimere overføring av HBSS inn i trypsin hetteglasset for å unngå ytterligere utvanning av trypsin.
  9. Veie trypsin ampuller etter vev overføring; dokumentere forskjell som vevmassen.
  10. Hell ~ 20 mg vev og 1 ml trypsin i hver brønn av en 24-brønners plate.
  11. Sett 24 brønners plate på shaker i kjøleskap ved 4 ° C i 16-20 timer. I løpet av denne venteperioden eller på et tidligere tidspunkt, forberede polyacrylamidgel underlag og functionalize dem med ECM proteiner som beskrevet i kapittel 3.

2. Enzymatisk Dissosiasjon av vevsprøve inn enkelt cellesuspensjon og dyrking isolerte celler på ECM funksjon Elastic substrates og Rigid polystyren Retter

  1. Etter 16-20 timers inkubering i trypsin vel ved 4 ° C på risteren, overfører vev fra 4 ° C trypsin til 4 ° C komplett vekstmedium ampulle (inneholdende 2-3 ml komplett vekstmedium) ved hjelp av en pipette. Sikre minimal overføring av trypsin i vekstmedier.
    Merk: Komplett vekstmedium formulering er som følger: RPMI 1640-medium supplert med basen hesteserum til en sluttkonsentrasjon på 10% og penicillin-streptomycin til 1% av den totale løsning.
  2. Plasser vev inneholdende medium ampulle i et varmt vannbad ved 37 ° C i 12-15 min.
  3. Overfør vevet til en 15 ml hetteglass med HBSS løsning ved hjelp av en pipette, rist forsiktig.
  4. Gjenta 2.3.
  5. Fjerne vev fra HBSS-oppløsning og overføring til 0,1% kollagenase-løsning (i HBSS) hetteglass inneholdende 1 ml oppløsning. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig miljø cellekulturinkubator. I løpet av venteperioden, varm growth media i en 15 ml flaske ved 37 ° C i vannbad.
  6. Trekk ut alle vevfragmenter inn pipette minimering kollagenase overføring. Eject bare vevfragmenter i forvarmet kultur medie ampuller.
  7. Plasser en 40 um godt innsats filter i hver brønn av en 6-brønn plate. Fukt filteret med en ml cellekulturmedier.
  8. Triturate vev i media med en 10 ml glass pipette flere ganger før vevet er fullstendig dissosiert.
  9. Opprett pipettespissen så nær som mulig til bunnen av ampullen.
  10. Deponere oppløsningen på filteret for å fjerne rusk og udissosiert deler.
  11. Sentrifuger filtrerte cellesuspensjon i mediet ved 150 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
  12. Fjern supernatanten og resuspender etterpå cellepelleten med 2 ml friskt kulturmedium.
  13. Tell cellene ved bruk av et hemocytometer (hvis nødvendig). Seed isolert primære celler på ekstracellulære matrix (ECM) funksjon gels og polystyren retter på ønsket konsentrasjon.

3. Utarbeidelse og funksjon av ulike Stivhet Polyakrylamid (PA) Gels og polystyren Underlag

Merk: For visuell demonstrasjon av § 3, seere / lesere er henvist til en fersk Journal of visualisert Experiments (Jove) artikkel 17.

  1. Adopterer publiserte protokoller 18, 19, aktiveres 12 mm to glass dekkglass for å sikre kjemisk kovalent binding av hydrogel.
    1. Først slips godbit glassdekselet med 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) for 7 min ved RT.
    2. Fjern ATS helt med DI vann skylling og behandle dekkglass med 0,5% Glutaraldehyd (fortynnet i PBS fra 70% Glutaraldehyd stamoppløsning) oppløsning i 30 min.
  2. Skaff 2 kPa gel-løsninger ved blanding av 5% vekt / volum akrylamid-løsning og 0,05% N, N'-metylenbisakrylamid (bis) løsning i 10 mM HEPES-bufret saltvann 20. Bruke 8% vekt / volum akrylamid og 0,13% N, N'-metylenbisakrylamid (bis) løsning i 10 mM HEPES-bufret saltvann for 10 kPa 20 gel.
    1. I begge tilfeller bruker 1: 200 ammoniumpersulfat (10% w / v) og 1: 2000 N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED) som initiator og katalysator for polymerisering prosessen, henholdsvis.
    2. Også, tilsett 100 mL fluoriserende perler til 2 kPa gel løsning som forvaltnings markører 21, 22.
  3. Deponere en dråpe på 20 ul pre-polymer PA gel løsning på 12 mm 2 aktivert glass dekkglass. Plasser en annen 12 mm 2 vanlig glass dekkglass på slipp. Sørg for at fallet sprer mellom dekkglass på grunn av kapillaritet. Snu sandwich til 2 kPa geler for å sikre at mesteparten av kulene kommer i nærheten av cellekulturoverflaten.
  4. Kurere PA gelen i 45 minutter ved RT.
  5. Skrelle av toppdekselet slip med en enkelt kant barberhøvel.
    Merk: Under peeling, fortsetter løsrivelse fra en kantav sandwich. Gelen forblir adherent til den aktiverte glass-slide.
  6. Oppbevar gelene i PBS-løsning før bruk.
  7. Funksjonalisere PA geler og glass med ECM-molekyler, humant fibronektin i en konsentrasjon på 50 mikrogram / ​​ml etter publiserte metoder 23.
    1. Kort, inkuber substrater med 2 ml ren hydrazinhydrat O / N.
    2. Fjern hydrazinhydrat og skyll underlag grundig med DI vann.
    3. Vask substrater med 5% eddiksyre i 30 min.
    4. Fjerne eddiksyre og skyll substratene grundig med DI vann.
    5. Hold underlag nedsenket i DI vann i 30 minutter.
    6. Inkuber substrater med oksidert fibronektin i 35 minutter ved en konsentrasjon på 50 ug / ml.
    7. Skyll substrater med PBS på rystemaskin ved lav rpm i 10 min.
    8. Inkuber alle substrater ved 37 ° C i 2-3 ml kulturmedium i 30 minutter før utplating av cellene.
      Merk: Plate celler i et tynt befolked måte (1000-3000 celler / cm2). Hver gel-dekket glass slip må være inneholdt i en 35 mm petriskål. La cellene få feste seg helt før noen mikroskopi (minst O / N).

4. trekkraft Mikros og immunfluorescens Mikros Analyser

  1. Traction Force Mikroskopi analysen
    1. Varm 0,25% trypsin-EDTA / 10% SDS-løsning ved 37 ° C i vannbad i 10 minutter før trek starter eksperimenter.
    2. Fjern en gel fra cellekulturinkubatoren på et tidspunkt og sted på fluorescerende invertert mikroskop scenen (32X forstørrelse).
    3. Finne en eneste celle i synsfeltet. Fjern petriskål lokket.
    4. Ta en fase kontrast bilde av cellen (for eksempel figur 3).
    5. Bytt bildemodus til fluorescens og velge riktig filter. Ikke flytt mikroskop scenen eller prøve i løpet av denne tiden.
    6. Ta et bilde av fluoriserende perler displaced av cellulær trekkraft (Figur 4C).
    7. Tilsett 1 ml trypsin / SDS løsning på petriskål for å løsne den cellen gel. Ikke flytt mikroskop scenen eller prøve i løpet av denne tiden. Også ta en kontroll bilde av cellen for å sikre fullstendig fjernelse fra gel.
    8. Ta en referanse (null kraft) bilde av kulene etter at cellen er fjernet.
    9. Gjenta trinn 4.1.2-4.1.8 for alle andre gels.
    10. Gjør en bildestakk hjelp ImageJ fra de to bildene ervervet i trinn 4.1.6 og 4.1.8 for hvert enkelt tilfelle. Å generere bildet stabelen, bruker følgende sekvens av kommandoer i ImageJ etter åpning bildene: Bilde → Stacks → Bilder å stable.
    11. For å oppnå forskyvningsfeltet og trekkraft, bruker ImageJ plugins følgende publiserte metoder 21, 22 Skaffe koder og detaljerte tutorials for disse plugins med følgende link:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Justere bildene i bunken ved hjelp av "Mal Matching 'plugin. Bruk følgende sekvens av kommandoer i ImageJ etter åpning av bildestakk generert i trinn 4.1.10: Plugins → Mal Matching → Juster Slices i Stack → OK. Lagre bildet stabelen følgelig. Bruk dette nye bildet stabelen i følgende trinn.
      2. Skaff forskyvningsfeltet ved hjelp av PIV (partikkel bilde velocimetry) plugin (Figur 4D). Bruk følgende sekvens av kommandoer etter åpning av bildestakk lagret i trinn 4.1.11.1: Plugins → PIV → iterativ PIV (Basic) → OK → Godta dette PIV og utgang → Ok. Redd PIV produksjonen i samme katalog som i det opprinnelige bildet stabelen. Bruk dette som input i neste trinn.
      3. Endelig bruke FTTC (Fourier transform trekkraft cytometri) plugin for å få trekkraft kartet (Figur 4E). Bruk følgende sekvens av kommandoer: Plugins → FTTC → Insert materialegenskaper, dvs. Youngs modul og Poissons tall fra PA gel → OK → Velg PIV utdatafilen lagret i trinn 4.1.11.2 → OK. Lagre FTTC resulterer i samme katalog som i bildestakk og PIV utgang.
  2. Immunfluorescens Mikros Analyser
    1. Ta underlag som skal immunostained til laminær panseret og ta av kulturmedier.
    2. Skyll substrater med PBS og fikser cellene med 4% paraformaldehyd i PBS i 20 min ved RT.
    3. Vask substrater med PBS for tre ganger (5 min hver gang). Følgelig inkubere substratene med 500 mL signal enhancer i 30 minutter og skylles med PBS.
    4. Inkuber cellene med monoklonale anti-vinculin antistoff ved en 1: 250 fortynning i PBS i 45 min ved RT. Vask substrater med PBS for tre ganger (5 min hver gang).
    5. Inkuber prøvene med sekundært antistoff Alexa Fluor 488 geit-anti-mus IgG ved en 1: 200-fortynningi PBS ved romtemperatur i 30 minutter. Vask substrater med PBS for tre ganger (5 min hver gang).
    6. Å visualisere F-aktin struktur, inkuberes cellene med TRITC phalloidin konjugater i en konsentrasjon 50 pg / ml i 45 minutter ved RT. Vask substrater med PBS for tre ganger (5 min hver gang).
    7. Bilde prøvene ved hjelp av konfokal scanning laser mikroskop (Figur 5A - 5D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen er beskrevet ovenfor er vellykket ansatt for flere vevsprøver (n = 12) fra fire forskjellige pasienter under retningslinjene for Institutional Review Board. Figur 1A illustrerer en representant kolorektal svulst rett etter operasjonen som vevssnittene for cellekulturer er oppnådd. En typisk vevet seksjon i HBSS oppløsning etter overføring til den laminære hette for videre behandling er vist i Figur 1B. Et skjematisk og enzymatisk fordøyelse av dissosiasjon av kirurgisk vevsprøve til en enkelt cellesuspensjon er vist i figur 2.

Etter vellykket vev dissosiasjon, er isolerte primære humane celler sådd på PA geleer og polystyren retter. Fasekontrastmikrografer (Figur 3A og 3B) illustrerer representative morfologi primære humane tykktarmskreft og normale celler som en funksjon av substrat stivhet. Det er åpenbart atprimære kolon celler (både sunne og kreft) spre mer på polystyren retter i forhold til PA gels (figur 3A og 3B).

Traction analysene er utført på ECM (fibronektinet) belagt myke 2 kPa gels etter bekreftelse av invasiv adenokarsinom fra patologisk H & E farging (figur 4A). PA geler er jevnt belagt med fibronektin, som vist i figur 4B. For å lette sammenligningen, må alle trek eksperimenter for tumor og friske tykktarmceller utføres samtidig. Figur 4C viser et øyeblikksbilde av nanoskala fluorescerende perler innbakt inne i gelen. Fra de fordrevne og referanse perle bilder, blir de fortrengnings feltene innhentet ved hjelp av ImageJ PIV plugin 21, 22. En representant perle forskyvningsfeltet generert av invasive tykktarmskreftceller på 2 kPa gel vises i figur 4D. Figur 4E viser trekkraft stress innhentet ved hjelp ImageJ FTTC plugin tilsvarer forskyvningsfeltet i figur 4D 21, 22.

Figur 5 viser F-aktin og vinculin inneholder fokale sammenvoksninger av primære humane kolon celler på myke 2 kPa geleer og stive polystyren underlag. Ingen aktin fiber var til stede i mindre spredning cellene på myke gels (figur 5A1 - 5A2). Punktat vinculin inneholder brennvoksn er til stede på myke gels (figur 5b1 - 5B2). Motsatt primære celler viser godt spredt morfologi, veldefinerte aktin stresset fiber og diskrete langstrakte fokale sammenvoksninger på stive polystyren underlag (Tall 5C - 5D).

Figur 1
Figur 1. (A) Tumor kolon etter reseksjon. (B) Vevssnitt fra svulsten for celle isolasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk av fordøyelsen og enzymatisk dissosiasjon av kirurgisk vevsprøve til én celle suspensjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Vellykket primære humane kolon cellekultur (både kreft og normal) på forskjellige stivhets gels og på polystyren fatet. Bilder fase kontrast vise tyPical morfologi (A) Kreftceller og (B) Normale celler på forskjellige stivhets underlag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. (A) H & E farging bekrefter invasiv adenocarcinoma. (B) Fibronectin farging viser at gelene er jevnt belagt med ECM-molekyler. (C) nanoskala perler innebygd i gel som forvaltnings markører. (D) Representant forskyvningsfeltet generert av tumorcelle på myke PA gel ved hjelp av PIV plugin i ImageJ som beskrevet i 4.1.11.2. (E) Traksjons belastning som utøves av tumorceller på en myk gel som tilsvarer forskyvningsfeltet i (D) oppnådd via FTTC plugg ii ImageJ som beskrevet i 4.1.11.3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Immunofluorescent farging av F-aktin og vinculin på myk gel og på harde underlag polystyren. Ingen aktin fiber var til stede i mindre spredning (A1) tumorcelle eller (A2) normal celle på 2 kPa myke geler. Punktat vinculin inneholder brennvoksn er til stede på myke gels (B1 - B2). Motsatt primære celler viser godt spredt morfologi, veldefinerte aktin stresset fiber (C1 - C2) og diskrete langstrakte fokale sammenvoksninger (D1 - D2) på stive polystyren underlag.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellular trekkraft stress har nylig dukket opp som en potensiell biofysisk indikator på metastatisk staten 13. Imidlertid finnes det ingen eksperimentelle grep data med primærtumorceller i litteraturen hittil. Dessuten er direkte dyrking av isolerte primærtykktarmceller på forskjellige stivhet polyakrylamidgeler ennå ikke rapportert. Derfor etablerer vi en optimalisert primære kolon cellekulturforhold på geleer og polystyren (figur 2). Fluorescent microbeads innkapsling nær cellekultur overflaten under myk gel forberedelse muliggjør måling av forskyvningsfeltet og trekkraft som genereres av primære humane celler (Figur 4C, 4D og 4E). I tillegg kan immunfluorescens analyser gi viktig informasjon om cytoskeleton organisasjon og fokale sammenvoksninger som substrat stivhets endringer (Figur 5A - 5D). Vær oppmerksom på at ulike kreft og normal udødelig cellelinjene også viser utvidet spredning, aktin stresset bunt dannelse og modnes langstrakte fokale sammenvoksninger med økt underlaget stivhet 4, 24-25.

Protokollen kan lett vedtatt / endret for isolering av primære celler fra kirurgiske vev av ulike organer eller andre dyr. Inkubasjonstiden av vev i dissosiasjonen agenter - trypsin og kollagenase - må optimaliseres empirisk for hver enkelt applikasjon. I tillegg er filterstørrelse for fjerning av produksjonsavfall og udissosiert vevsdeler også en viktig parameter for å velge basert på forventede maksimale cellestørrelse i suspendert tilstand (40 mikrometer i denne protokoll).

En begrensning av metoden er at noen myke gels kan mangle konsistent lokalisering av de fluoriserende perler nær overflaten cellekultur (punkt 3.3) som kan påvirke følgende trekkraft cytometry målinger (§ 4.1). Dette kan enkelt omgått ved å undersøkegeloverflaten for vulsten tetthet og fordeling ved hjelp av fluorescerende mikroskopi før cellekultur. Følgelig kan geler med relativt ikke-homogen vulst fordeling kastes. En annen tilnærming er å bruke en nylig foreslått fremgangsmåte som tillater nøyaktig lokalisering av perlene nær overflaten cellekultur 17.

Forsiktighet bør tas for å starte behandlingen de kirurgiske prøvene så snart de er mottatt, helst innen 45 minutter. Den mest kritiske trinn i protokollen er den optimale eksponeringstiden av vevet i trypsin og kollagenase-løsning for å oppnå isolasjonsutbytte, men beholdt tilstrekkelig celleviabilitet. Før dyrking av cellene på myke hydrogeler, trenger vulsten tetthet og fordeling til å bli bekreftet ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Dessuten trenger en null kraft bildet for å bli kjøpt opp etter å ha bekreftet at cellen er helt løsrevet fra gelen overflaten.

I sammendrag, er en protokoll som beskrevet retater dissosiert enkeltceller suspensjon fra kirurgiske kreft / normal vevsprøve. Denne isolering av enkeltprimærtumorceller fra operasjons prøver etterfulgt av sin kultur på myke og harde underlag gjør ulike nedstrøms biofysiske målinger, for eksempel, celle stivhet ved hjelp AFM, intracellulær rheology hjelp microinjected partikler, cellemigrasjon / motilitet og vesikkel dynamikk analyse. Disse målingene kan brukes til prognose kreft. Protokollen har blitt brukt til utvinning og kultur murine kardiomyocytter samt 26. Metoden som presenteres her, kan brukes til å isolere primære humane celler fra kirurgiske vev av forskjellige organer, og å dyrke dem direkte på forskjellig stivhet substrat for mechanobiology studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, (2), e32572 (2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8, (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5, (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97, (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35, (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39, (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5, (9), e12905 (2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
Isolering av primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske vev og dyrking dem direkte på myke, elastiske Underlag for Traction Cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).More

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter