مسألة كيفية المنظمين والدول لونين لونين تؤثر على الجينوم في الجسم الحي هو المفتاح لفهمنا لكيفية اتخاذ القرارات في وقت مبكر مصير الخلايا في الجنين النامية. رقاقة تسلسل-النهج الأكثر شعبية للتحقيق ميزات الكروماتين في-والمستوى العالمي المبينة هنا للأجنة القيطم.
The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.
The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency3. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes4. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)5. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes.
Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species—X. tropicalis and X. laevis—have now been released by the International Xenopus Genome Consortium6. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.
The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.
ويحدد بروتوكول لدينا كيفية جعل وتحليل الجينوم على نطاق ملامح لونين من أجنة القيطم. وهو يغطي كل خطوة من البروتينات عبر ربط مواضع الذاتية في الجسم الحي لمعالجة الملايين من يقرأ تمثل مواقع الجينومية المخصب في سيليكون. منذ أعدادا متزايدة من مسودات الجينوم متوفرة، وينبغي أن يكون هذا البروتوكول ينطبق على الكائنات الحية وغير نموذج نموذج الأخرى. قسم تجريبي أهم، والذي يحدد هذا البروتوكول بصرف النظر عن الأعمال السابقة 8،31،33،34، هو الإجراء بعد تثبيت لاستخراج النوى عبر ربط. فإنه يسهل كفاءة solubilisation لونين والقص وسهلة الارتقاء. جنبا إلى جنب مع كفاءة محسنة لإعداد مكتبة هذا البروتوكول يسمح بناء عالية التعقيد، المكتبات رقاقة وما يليها من نصف إلى مليوني الخلايا معربا عن حاتمة المصاحب لونين من الفائدة. للتجارب الشذرة-QPCR، وعدد قليل عشرة آلاف من هذه الخلايا تكون عادة كافيةللتحقق من تخصيب DNA في ستة مواضع ربما الجينومية متميزة. هذه الأرقام هي تقديرات متحفظة، ولكن قد تختلف اعتمادا على البروتين مستوى التعبير، وجودة الأجسام المضادة، عبر ربط الكفاءة، وحاتمة للمعاقين. كدليل، والقيطم جنين واحد يحتوي على حوالي 4،000 خلايا في مرحلة منتصف الأريمة (8.5 بعد Nieuwkoop وفابر 29)، 40،000 الخلايا في مرحلة متأخرة المعيدة (12) و 100،000 الخلايا في مرحلة tailbud في وقت مبكر (20).
الوقت المحدد لتثبيت مناعي فعال يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا عن طريق رقاقة-QPCR (المادة 10). بشكل عام، يطلب من الأوقات تثبيت أطول إذا كانت التجربة تتضمن X. المورق الأجنة، مراحل النمو المبكرة، وDNA خصائص ملزمة ضعيفة (أو غير المباشرة). ومع ذلك، فمن غير المستحسن تحديد القيطم الأجنة أطول من 40 دقيقة، أو تجهيز المزيد من الأجنة مما هو مذكور (القسم 3)، ويصبح لونين القص أقل كفاءة. ومن المهم عدملاستخدام أي الجلايسين بعد تثبيت وهذه الخطوة مشتركة لتبريد الفورمالديهايد يمكن أن تجعل استخراج النووي من أجنة صفار الغنية صعبة للغاية. حاليا، والسبب في ذلك غير معروف. فمن المتصور أن ناتج إضافة الفورمالديهايد جليكاين يتفاعل أكثر مع الأمينية مجموعات أو بقايا أرجينين 35 N-المحطة.
الجسم المضاد هو مفتاح أي تجربة الشذرة وتحتاج إلى ضوابط كافية لتنفيذها لإظهار خصوصيته لحاتمة ذات الاهتمام (انظر المبادئ التوجيهية التي كتبها Landt وآخرون 36). إذا لم يكن هناك الأجسام المضادة الشذرة الصف هو متاح، وإدخال الموسومة حاتمة البروتينات الانصهار المقابلة قد يكون بديلا مشروعا وهذه البروتينات يمكن أن تشغل endogeneous مواقع الربط 37. في هذه الحالة، الأجنة uninjected هي الأفضل لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية بدلا من رقاقة مع المصل غير محددة. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الاستراتيجية إذا يتم التعبير عن بروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة مما أدى إلى انتعاش الفقراء من ENRIDNA جنة التعليم العالي.
كما لصنع المكتبات رقاقة وما يليها، وذلك بسبب انخفاض كمية من الحمض النووي في الاستخدام، فمن المستحسن أن تختار لإجراءات التي تقلل من عدد من الخطوات التنظيف والجمع بين ردود الفعل للحفاظ على أي فقدان DNA كحد أدنى. محولات والاشعال يجب أن تكون متوافقة مع تسلسل متعدد ومنصة NGS (انظر الجدول مواد معينة / المعدات). إذا باستخدام Y-محولات (التي كانت تحمل أسلحة واحدة الذين تقطعت بهم السبل طويلة)، فمن الأهمية بمكان ما قبل تضخيم المكتبة مع 3-5 جولات من PCR قبل إدراج DNA-اختيار حجم (على سبيل المثال، من 100 إلى 300 بي بي) من قبل الكهربائي للهلام. الغايات واحدة الذين تقطعت بهم السبل تسبب شظايا الحمض النووي للهجرة بتباين. محاكمة يدير مع كميات مختلفة من الحمض النووي المدخلات (على سبيل المثال، 0.1، 0.5، 1، 2، 5، 10 و 20 نانوغرام) ينصح لتحديد العدد الإجمالي للدورات PCR (أقل من أو يساوي 18 دورات) المطلوبة لجعل حجم مكتبة -selected 100 إلى 200 نانوغرام. تقليل عدد دورات PCR يجعل تسلسل reduيقرأ أقل احتمالا ndant. المرحلة الصلبة الخرز تجميد عكسها جيدة تنظيف الكواشف لاسترداد بكفاءة DNA من الاهتمام وموثوق إزالة أي محولات حرة وdimers من ربط وردود الفعل PCR.
من حيث عدد ونوع وطول يقرأ، حول 20-30000000 نهاية واحدة يقرأ من 36 سنة مضت يكفي بالنسبة لمعظم التجارب رقاقة يليها لتغطية الجينوم القيطم كله مع عمق كاف. الآلات NGS الأكثر انتشارا هي قادرة بشكل روتيني لتلبية هذه المعايير. ومع ذلك، قد يكون من المفيد لزيادة عدد من يقرأ إذا كان من المتوقع لتوزيعات واسعة من يقرأ، كما لوحظ مع بعض التعديلات هيستون، بدلا من قمم حادة. بالنسبة للعديد من التجارب رقاقة وما يليها، من 4 إلى 5 مكتبات المفهرسة مختلفة يمكن تجميعها والتسلسل في تدفق واحد حارات خلية باستخدام آلة NGS عالية الأداء. أحيانا المستحسن أيضا لتمديد طول القراءة وتسلسل طرفي القالب الحمض النووي (إقران النهاية) لزيادة mappability ثالدجاجة تحليل لونين داخل المناطق الجينومية المتكررة.
وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح إلى مجموعة واسعة من الميزات لونين مثل عوامل النسخ، وسطاء الإشارات والتعديلات هيستون ما بعد متعدية. ومع ذلك، الأجنة تكتسب درجة متزايدة من عدم التجانس الخلوية لأنها تطوير وتصبح ملامح لونين من الصعب تفسير. وقد بذلت خطوات واعدة في نبات الأرابيدوبسيس وذبابة الفاكهة إلى المناظر الطبيعية لونين الأنسجة تحديدا لمحة عن طريق استخراج نوع محدد خلية نوى 38،39. ويتضمن بروتوكول لدينا خطوة استخراج النووية، التي يمكن أن تمهد الطريق لأنسجة محددة الشذرة تسلسل في الأجنة الأخرى.
The authors have nothing to disclose.
We thank Chris Benner for implementing the X. tropicalis genome (xenTro2, xenTro2r) into HOMER and the Gilchrist lab for discussions on post-sequencing analysis. I.P. assisted the GO term analysis. G.E.G and J.C.S. were supported by the Wellcome Trust and are now supported by the Medical Research Council (program number U117597140).
1/16 inch tapered microtip | Qsonica | 4417 | This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica. |
8 ml glass sample vial with cap | Wheaton | 224884 | 8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps. |
Adaptor | IDT or Sigma | NA | TruSeq universal adaptor,
AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C. |
b2g4pipe (software) | Blast2GO | non-commercial | http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip |
BLAST+ (software) | Camacho et al. | non-commercial | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download |
Bowtie (software) | Langmead et al. | non-commercial | http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml |
cisFinder (software) | Sharov et al. | non-commercial | http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ |
Chip for capillary electrophoresis | Agilent Technologies | 5067-1504 | Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C. |
Chip-based capillary electrophoresis system | Agilent Technologies | G2940CA | The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C. |
ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit) | Kapa Biosystems | KK8504 | Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C. |
ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit) | Rubicon Genomics | R40048 | Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C. |
Cluster3 (software) | de Hoon et al. | non-commercial | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster |
FastQC (software) | Simon Andrews | non-commercial | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc |
Fluorometer | life technologies | Q32866 | Qubit 2.0 Fluorometer |
Fluorometer reagents | life technologies | Q32851 | The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature. |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic. |
Gel (E-Gel EX agarose , 2%) | life technologies | G4010 | Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature. |
Gel electrophoresis system | life technologies | G6465 | E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries. |
Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice. |
HOMER (software) | Chris Benner | non-commercial | http://homer.salk.edu/homer/index.html |
Hybridization oven | Techne | FHB1D | Hybridizer HB-1D |
IGV (software) | Robinson et al. | non-commercial | http://www.broadinstitute.org/igv/home |
Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software) | Assaf Gordon | non-commercial | http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter |
Java TreeView (software) | Alok Saldanha | non-commercial | http://jtreeview.sourceforge.net |
Laboratory jack | Edu-Lab | CH0642 | This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication. |
Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N3231 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N3232 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes | life technologies | AM12450 | nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml |
MACS2 (software) | Tao Liu | non-commercial | https://github.com/taoliu/MACS |
Magnetic beads | life technologies | 11201D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic beads | life technologies | 11203D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic beads | life technologies | 10001D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic beads | life technologies | 10003D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic rack | life technologies | 12321D | DynaMag-2 magnet |
MEME | Bailey et al. | non-commercial | http://meme.nbcr.net/meme/ |
Na3VO4 | New England BioLabs | P0758 | Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C. |
NaF | New England BioLabs | P0759 | Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C. |
NGS machine | Illumina | SY-301-1301 | Genome Analyzer IIx |
NGS machine (high performance) | Illumina | SY-401-2501 | HiSeq |
Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2028 | Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
Nucleic acid staining solution | iNtRON | 21141 | Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature. |
Orange G | Sigma | O3756-25G | 1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C. |
PCR primers | e.g., IDT or Sigma | NA | Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28006 | for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature. |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9) | life technologies | AM9730 | Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible. |
Primer3 (software) | Steve Rozen & Helen Skaletsky | non-commercial | http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C. |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C. |
Proteinase K | life technologies | AM2548 | proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C. |
RNase A | life technologies | 12091-039 | RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature. |
Rotator | Stuart | SB3 | Rotator SB3 |
SAMtools (software) | Li et al. | non-commercial | http://samtools.sourceforge.neta |
Solid phase reversible immobilisation beads | Beckman Coulter | A63882 | The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C. |
Sonicator 3000 | Misonix/Qsonica | NA | Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin. |
Sound enclosure | Misonix/Qsonica | NA | optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure. |
Thermomixer | eppendorf | 22670000 | Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C. |