Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

doi: 10.3791/52537 Published: May 28, 2015

Abstract

De hersenen bestaat uit vier primaire celtypen inclusief neuronen, astrocyten, microglia en oligodendrocyten. Hoewel zij niet het meest voorkomende celtype in de hersenen, neuronen de meest bestudeerde van deze celtypen gezien hun directe rol in gedrag beïnvloeden. Andere celtypen in de hersenen beïnvloeden ook neuronale functie en gedrag via de signaalmoleculen ze produceren. Neuroscientists moet de interactie tussen celsoorten inzicht in de hersenen beter begrijpen hoe deze interacties beïnvloeden neurale functie en ziekte. Tot op heden de meest voorkomende werkwijze voor het analyseren eiwit of genexpressie gebruikt de homogenisering van hele weefselmonsters, meestal bloed, en zonder acht te slaan celtype. Deze aanpak is een informatieve aanpak voor de behandeling van algemene veranderingen in gen of eiwit expressie die neurale functie en het gedrag kunnen beïnvloeden; echter, deze analysemethode leent zich niet tot een beter begrip van de cel-type-specifieke genexpressie en het effect van cel-tot-cel communicatie op neurale functie. Analyse van behavioral epigenetica heeft een oppervlakte van groeiende aandacht die wordt onderzocht is hoe wijzigingen van het desoxyribonucleïnezuur (DNA) structuur langetermijneffect genexpressie en gedrag; echter, deze informatie alleen relevant indien geanalyseerd in een celtype-specifieke wijze gezien de differentiële lijn en dus epigenetische markers die aanwezig zijn op bepaalde genen van afzonderlijke neurale celtypes kunnen zijn. De Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) techniek hierna beschreven is een eenvoudige en effectieve manier om afzonderlijke neurale cellen te isoleren voor daaropvolgende analyse van genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van DNA. Deze techniek kan ook worden gemodificeerd om specifiekere neurale celtypes te isoleren in de hersenen voor daaropvolgende celtype-specifieke analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neural Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628
Myelin Removal Beads II Miltenyi Biotec 130-096-733
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Nylon Mesh Sheet Amazon CMN-0074-10YD 40 inch width, 80 micron size mesh
Fc Block / anti-CD32 BD Biosciences BDB550270 reactivity for rat
APC-conjugated CD11b antibody Biolegend 201809 reactivity for rat
Rabbit anti-GLT1 Novus Biologicals NBP1-20136 reactivity for rat or human
PE-conjugated anti-rabbit secondary antibody eBioscience 1037259 secondary antibody for anti-GLT1
FITC-conjugated anti-rat CD90 (Thy1) mouse antibody Biolegend 202504 reactivity for rat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwarz, J. M., Smith, S. H., Bilbo, S. D. FACS analysis of neuronal-glial interactions in the nucleus accumbens following morphine administration. Psychopharmacology. 230, (4), 525-535 (2013).
  2. Schwarz, J. M., Hutchinson, M. R., Bilbo, S. D. Early-life experience decreases drug-induced reinstatement of morphine CPP in adulthood via microglial-specific epigenetic programming of anti-inflammatory IL-10 expression. J Neurosci. 31, (49), 17835-1523 (2011).
  3. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7, (7), 681-685 (2006).
  4. Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, (11), 4251-4259 (2011).
  5. Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, (1), 100-108 (2013).
  6. Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, (1), 173-185 (2013).
  7. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, (1), 10-18 (2012).
  8. Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33, (1), 72-86 (2000).
  9. Okana, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  10. Bogdanović, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, (5), 549-565 (2009).
  11. Iwamoto, K., et al. Neurons show distinctive DNA methylation profile and higher inter-individual variations compared with non-neurons. Genome Res. 21, (5), 688-696 (2011).
  12. Nishioka, M., et al. Neuronal cell-type specific DNA methylation patterns of the Cacna1c gene. Int J Dev Neurosci. 31, (2), 89-95 (2013).
  13. Kozlenkov, A., et al. Differences in DNA methylation between human neuronal and glial cells are concentrated in enhancers and non-CpG sites. Nucleic Acid Res. 42, (1), 109-127 (2014).
  14. Russo, S. J., et al. Nuclear factor kappa B signaling regulates neuronal morphology and cocaine reward. J Neurosci. 29, (11), 3529-3537 (2009).
  15. Bhatt, D., Ghosh, S. Regulation of the NF-κB-Mediated Transcription of Inflammatory Genes. Front Immunol. 5, 71 (2014).
  16. Okada, S., et al. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. J Cell Physiol. 226, (2), 552-558 (2011).
Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schwarz, J. M. Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (99), e52537, doi:10.3791/52537 (2015).More

Schwarz, J. M. Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (99), e52537, doi:10.3791/52537 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter