Introduction
الحصين يلعب دورا هاما في الذاكرة والتعلم وكذلك السلوك العاطفي. وتتكون واحدة تتمثل المهمة الرئيسية للتوحيد الذاكرة القصيرة الأمد إلى ذاكرة طويلة الأمد، الأمر الذي يتطلب مرونة عالية في الجهاز العصبي. التلفيف المسنن من الحصين بمثابة بوابة رئيسية لإدخال المعلومات وهي أيضا واحدة من مناطق الدماغ مع اثنين من تكوين الخلايا العصبية المستمر طوال فترة البلوغ 1،2. تطوير البنية الحصين يحدث خلال أواخر مرحلة التطور الجنيني وخاصة خلال أول 3 إلى 4 أسابيع بعد الولادة 3. خلال التنمية في وقت مبكر من التلفيف المسنن يتم تأسيس تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لبعد الولادة وكذلك تكوين الخلايا العصبية الكبار 4. الخلايا العصبية تطوير تمر عبر مراحل مختلفة، من الخلايا الجذعية من خلال عدة مراحل من الخلايا الاصلية لغير ناضجة، وأخيرا الخلايا العصبية الناضجة خلال بعد الولادة، فضلا عن تكوين الخلايا العصبية الكبار. في مراحل مختلفة من الخلايا العصبية التعبير عنمطلوب جينات معينة للسماح للنضوج والتكامل من الخلايا العصبية الجديدة في قرن آمون الدوائر 5،6.
باستخدام الماوس علم الوراثة وتحليل النمط الظاهري من قبل المناعية وكذلك الأساليب الجزيئية يسمح تحديد نمط التعبير وظيفة العديد من هذه الجينات. وبالإضافة إلى ذلك تحليل ميكروأري وكذلك مناعي لونين (رقاقة) قدمت معلومات عن الجينات المحتملة المباشرة وغير المباشرة المستهدفة 7،8. ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن الآليات التنظيمية للتنمية قرن آمون، وخاصة تطوير التلفيف المسنن. للحصول على مزيد من التبصر كيف يتم تنظيم الجينات المحددة نظاما مطلوب والسماح للتلاعب من عدد صغير من الخلايا أسفل-أو ما يصل التنظيم من الجين من الفائدة و / أو الجينات المستهدفة ومتابعة مصيرهم خلال التنمية. في الرحم Electroporation لل من shRNAs، كدنا] من الجينات في المصالح أو لجنة المساواة العرقية recombinaتوفر حد ذاتها مثل هذه الأداة. لضمان وجود الحمض النووي المطلوب أو الرنا صغيرة البلازميدات التعبير ينبغي أن تستخدم ل electroporation. ويتم تنفيذ هذا النهج بنجاح كبير في دراسة تطوير القشرية 9،10، ولكن هو نهج أكثر تحديا دراسة تطوير التلفيف المسنن بسبب الموقف من الهياكل قرن آمون في الدماغ طبقات أعمق.
السابقين الرحم بعد Electroporation للثقافة شريحة عضوي النمط هو نهج واحد للتحايل على هذه المشكلة 11،12. وعلى النقيض من في الرحم Electroporation لللا الجنين كله ولكن فقط الرأس ويستخدم يسمح بالتالي لوضع الأقطاب الكهربائية بطريقة أكثر ملاءمة لتوجيه shRNA / DNA نحو الحصين والتلفيف المسنن. مجموعتنا يعمل بنجاح السابق الرحم Electroporation لللدراسة دور عامل النسخ Bcl11b خلال تطوير التلفيف المسنن 8. Bcl11b لها دور مزدوج في التنمية التلفيف المسنن التي كتبها regulating السلف تكاثر الخلايا وكذلك التمايز كما يتضح من المناعية. لزيادة تحديد آلية لمشاركة Bcl11b في هذه العمليات، تم تعديل بروتوكولات للمجموعة Polleux 11،12 لدراسة التلفيف المسنن كما هو موضح أدناه في قسم البروتوكول. في النهج الأول تم تناول مسألة ما إذا كان Bcl11b وتنظيم الخلايا العصبية خلية تمايز الخلايا بشكل مستقل. فحص والنهج الثاني سواء Desmoplakin، جين هدفا مباشرا للBcl11b، كافية لانقاذ النمط الظاهري Bcl11b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون الألماني وتمت الموافقة من قبل المكاتب الحكومية في توبنغن: ملاحظة.
1. إعداد بال micropipettes، حلول والأغشية
- إعداد بال micropipettes
- سحب بال micropipettes الزجاج باستخدام مجتذب ممص مكروى مع البرنامج التالي: الحرارة: 540، سحب: 125، السرعة: 20 والتأخير: 140. المبالغ طول الإبرة إلى 5.5 سم.
- الإبر شطبة باستخدام microgrinder للحصول على حجم غيض مناسب من 4 مم. تخزين الإبر في مربع أو 15 سم طبق بتري لمنع ضررا من النصائح.
- إعداد حلول
- البلازميد DNA الحل
- إعداد DNA البلازميد التي تحتوي على بناء كدنا] المطلوب باستخدام عدة المجانية-ماكسي الإعدادية الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- ضبط حل DNA البلازميد إلى تركيز النهائي من 3 ميكروغرام / ميكرولتر (بدون ناقلات GFP ارتفاع) أو 4 ميكروغرام /ميكرولتر (مع 1 ميكروغرام من GFP ارتفاع ناقلات) في الذيفان الداخلي سراح تريس، EDTA العازلة التي تحتوي على الأخضر السريع (تركيز النهائي 0.05٪).
- Laminin سهم الحل
- حل 1 ملغ من laminin في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 1 مل. إعداد 100 مكل وتخزينها في -80 ° C.
- بولي-L-ليسين محلول المخزون
- حل 50 ملغ من بولي-L-يسين في 50 مل من الماء المعقم إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. إعداد 1 مل مأخوذة وتخزينها في -20 ° C.
- استكمال محلول الملح هانك المتوازن (كامل HBSS)
- إعداد كاملة HBSS من خلال الجمع بين 100 مل من 10X HBSS 2.5 مل من 1 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة)، 30 مل من 1 M D-الجلوكوز، 10 مل من 100 ملي CaCl 2، 10 مل من 100 ملي MgSO 4، و 4 مل من 1 M NaHCO 3. إضافة الماء المعقم تصل إلى 1 L وتخزينها في 4 ° C.
ملاحظة: الأوتوكلاف جميع الحلول يتوقعون 1 M HEPES العازلة و 1 M D-الجلوكوز، والتي هي سن الفيلثالثا تعقيمها.
- إعداد كاملة HBSS من خلال الجمع بين 100 مل من 10X HBSS 2.5 مل من 1 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة)، 30 مل من 1 M D-الجلوكوز، 10 مل من 100 ملي CaCl 2، 10 مل من 100 ملي MgSO 4، و 4 مل من 1 M NaHCO 3. إضافة الماء المعقم تصل إلى 1 L وتخزينها في 4 ° C.
- الثقافة شريحة متوسطة
- إعداد شريحة مستنبت بإضافة 35 مل من بصل متوسطة النسر، 12.9 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، 1.35 مل من 1 M D-الجلوكوز، 250 ميكرولتر من 200 ملي L-الجلوتامين، و 500 ميكرولتر من البنسلين، الستربتومايسين ل الحصول على الحجم النهائي من 50 مل. إضافة مصل الحصان إلى تركيز النهائي من 5٪ وتخزينها في 4 ° C.
- نقطة المنخفض الانصهار (LMP) الاغاروز
- إعداد 4٪ LMP الاغاروز حل عن طريق إضافة 2 غرام من LMP الاغاروز إلى 50 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، يليه التدفئة في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة في عالية الطاقة. الحفاظ على هذا الحل في حمام مائي عند 37-39 درجة مئوية. تخزين الحل في 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها.
- امتصاص العرق الحل
- في غطاء الدخان إعداد محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وذلك بإضافة 4 غرام من بارافورمالدهيد إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح الحل جلير.
- Permeabilization الحل
- حل 9 غرام من BSA في 300 مل من 1X PBS تحتوي على 0.3٪ Trition X-100 وتخزينها في 4 ° C. إضافة 10٪ أزيد الصوديوم للتخزين على المدى الطويل.
- البلازميد DNA الحل
- طلاء من غشاء إدراجات
- تمييع قسامة واحدة من محلول المخزون laminin (1.2.2) وقسامة واحدة من بولي-L-يسين حل سهم (1.2.3) في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 12 مل.
- ضع إدراج الغشاء إلى 6 لوحات جيدا مع بعضها يحتوي كذلك 2 مل من الماء المعقم. إضافة 1 مل من محلول طلاء على رأس الغشاء واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- بعد مرور فترة الحضانة غسل غشاء إدراج ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المعقم وجافة. استخدام إدراج غشاء المغلفة في نفس اليوم أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع في الجافة 6 لوحة جيدا.
2. حقن الحمض النووي و Electroporation من E15.5 وE18.5 الأجنة
- الموت ببطء الماوس فاقد الوعي من قبل خلع عنق الرحم في يوم الجنينية (E) 15.5 18.5 أو. تشريح الرحم التي تحتوي على أجنة 13 ووضعه في طبق بتري تحتوي على 15-20 مل من البرد الكامل HBSS.
ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، والحفاظ على الأجنة والأنسجة على الجليد. - استخدام زوج من مقص للفصل بين كل الجنين من قرن الرحم ومكان في طبق بيتري الثاني تحتوي على البارد الكامل HBSS.
- تحت المجهر تشريح، قطع الجدار عضلة الرحم والمشيمة باستخدام زوج من ملقط غرامة (رقم 55) ومقص. الإفراج بعناية الجنين من الكيس المحي.
- استخدام زوج من مقص بون إلى decapitatالبريد الأجنة فقط فوق الأمامية في زاوية 60 درجة. إذا كانت التجربة يتطلب التنميط الجيني للأجنة، وجمع عينة الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني (قطعة صغيرة من الذيل).
- نقل الرأس إلى طبق بتري نظيف وجاف. لأن رئيس قد مقطوعة الرأس في زاوية 60 درجة، ينبغي للإمالة الرأس إلى جانب واحد عند وضعها حتى الجانب الظهري.
- وضع إبرة بعناية في منتصف ختام نصف الكرة إلى bregma (الشكل 1A، B). حقن حوالي 2-3 ميكرولتر (في 3 أو 4 ميكروغرام / ميكرولتر) من محلول الحمض النووي من قبل داس على دواسة من picospritzer III باستخدام 30 رطلا من الضغط لمدة 10-15 ميللي ثانية لكل نبضة، وتطبيق 5-8 البقول. مدة وعدد من النبضات تعتمد على قطر افتتاح إبرة مع فتحات صغيرة تتطلب المزيد من الوقت. الفاصل الزمني بين كل نبضة يصل إلى 1 ثانية.
- قبل وضع الأقطاب، وتطبيق بضع قطرات من كامل HBSS على رأس EMBRيو. وضع أقطاب كهربائية في مثل هذه الطريقة أن 'السلبية' المحطة هو على الجانب نفس البطين حقن والقطب "إيجابي" على الجانب الآخر من البطين حقن أسفل الأذن رأس الجنين (الشكل 1C، D). تطبيق 5 نبضات من 50 V.
- استخدام 3 مم أقطاب لE 15.5 و 5 مم أقطاب لE 18.5.
3. تشريح الدماغ
- بعد Electroporation لل، تقشر الجلد من الرأس مع مساعدة من زوج من ملقط غرامة. باستخدام زوج من مقص الربيع إجراء شق صغير في منتصف المخيخ في خط الوسط من الجمجمة.
- إدراج مقص الربيع في شق وقطع طولي على طول الدرز السهمي. تقشر الجمجمة وفصل الدماغ من الجمجمة باستخدام ملقط غرامة. نقل الدماغ كله الى 15-20 البارد مل حل HBSS كاملة.
- وفي الوقت نفسه، صب 4٪ LMP الاغاروز،أبقى في 37-39 درجة مئوية في حمام مائي، في قالب قشر بعيدا.
- خذ الدماغ من HBSS الكامل من جانب ملعقة مغرفة صغيرة واستنزاف فائض من HBSS باستخدام المناديل الورقية أو الغرامة، أو Kimwipes.
- وضع الدماغ كله برفق في الاغاروز وضبط موقفها مع إبرة رفيعة. الحفاظ على العفن على الجليد حتى الاغاروز هو طدت ومقطوع كتلة (لأقسام الاكليلية بصيلات الشم وتشير متابعة).
4. Vibratome باجتزاء والثقافة شريحة
- تقليم الكتل الاغاروز LMP ويوحدهم إلى مرحلة العينة باستخدام 'الغراء عظمى ". بعد الغراء هو نقل الجاف المرحلة العينة إلى علبة عازلة للvibratome وملء مع الثلج الباردة استكمال HBSS حتى يتم مغمورة كتلة في الحل.
ملاحظة: تعقيم جميع الأسطح أداة والمعدات مع الايثانول 70٪ قبل باجتزاء. - إعداد 250 ميكرون أقسام سميكة vibratome باستخدام شفرة جديدة النحو التالي.
- تقليم واي كتلةعشر الإعدادات التالية. تردد - 60 هرتز، سعة - 0.7 ميكرون، والسرعة 16-18 ملم / ثانية. قطع المقاطع التي تحتوي على الأنسجة المطلوب مع الإعدادات أعلاه بسرعة بطيئة (9 ملم / ثانية). بدء باجتزاء من الدماغ المؤخر، وجمع 5-7 المقاطع من المخ.
- نقل المقاطع لطبق ثقافة 6 جيدا نظيفة تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة استكمال HBSS بمساعدة ملعقة عازمة والحفاظ على الجليد حتى يتم جمع جميع الأقسام (الشكل 1E).
- ترطيب الغشاء بطريقة الصليب مع 100 ميكرولتر من HBSS كاملة قبل وضع المقاطع على الغشاء، لتسهيل التوجه للأقسام.
- نقل أقسام باستخدام ملعقة عازمة على الغشاء (التقاط زاوية من القسم مع ملقط وسحب على ملعقة وثم استخدام ملقط لدفع القسم على الغشاء). وضع ما يصل إلى خمسة أقسام على غشاء واحد وترتيب باستخدام ملقط (الشكل 1F). لا تتداخل الأقسام مع بعضها البعض.
- تأخذ الفائض من HBSS قبالة غشاء باستخدام ماصة. وترد الأغشية المحددة المستخدمة هنا إلى إطار وإدراجها في لوحة زراعة الأنسجة، والتي تسمح الأنسجة لتكون على اتصال ولكن لا تغطيها المتوسط.
- ضع إدراج الغشاء إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.8 مل من ثقافة شريحة المتوسطة (1.2.5) (الشكل 1G، H). احتضان الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 11 أو 14 DIV DIV. تغيير نصف المتوسط (0.9 مل) كل يوم الثاني.
ملاحظة: في هذه المرحلة، إضافة الكواشف مثل Bromodeoxyuridine (BrdU، و 10 ميكرومتر تركيز النهائي) لوصفها تكاثر الخلايا إلى وسائل الإعلام للساعة 20 الأولى من الوقت الثقافة.
5. التثبيت من أقسام تلاه سهم المناعي تلطيخ
- استخدام شفرة مشرط نظيفة وحادة لقطع وتقليم الأغشية اعتمادا على التوجه للالأقسام.
- نقل أقسام جنبا إلى جنب مع غشاء لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من 4٪ PFA (1.2.7). احتضان أقسام لمدة 1 ساعة على RT تليها 3 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما. احتضان أقسام O / N مع حل permeabilization في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
- في اليوم التالي، واحتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة، مخففة في حل permeabilization، O / N أو لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
- غسل أقسام 3 مرات لمدة 15 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مخففة في حل permeabilization.
- بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل أقسام مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة تليها دابي تلطيخ لمدة 10 دقيقة.
- غسل أقسام 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما ونقل إلى شرائح المجهر. إضافة ImmunoMount ووضع بلطف ساترة على أعلى من أقسام. تجفيف الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية وحد ذاتهاآل بطلاء الأظافر.
ملاحظة: الحفاظ على الشرائح دائما في 4 درجات مئوية.- تحليل الثقافات شريحة بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 1I).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الاجتثاث من عامل النسخ Bcl11b يتسبب في انخفاض قيمة تكاثر الخلايا الاصلية وتمايز الخلايا العصبية مما أدى إلى انخفاض حجم التلفيف المسنن وعدد الخلايا. وعلاوة على ذلك تفشل الخلايا العصبية متحولة إلى الاندماج في الدوائر قرن آمون مما تسبب في التعلم والذاكرة ضعف 8. للإجابة على الأسئلة بشأن الآلية التنظيمية (ق) من Bcl11b في هذه العمليات كان يعمل Electroporation للالرحم السابقين.
معالجة مسألة ما إذا كان Bcl11b-مستقل خلية ينظم تمايز الخلايا العصبية، تم إنشاؤها الحذف الفسيفساء من Bcl11b التي كتبها السابق الرحم Electroporation للمن recombinase بناء GFP- لجنة المساواة العرقية أو GFP وحدها 11 في Bcl11b flox / flox الحصين في E15.5 تليها ثقافة شريحة عضوي النمط يصل إلى 18 أيام بعد Electroporation لل(الشكل 2A، B، لقد تم تعديل هذا الشكل من 8). لتحديد ما إذا Bcl11ب تنظم تمايز الخلايا الحبيبية خلية مستقلة تم تنفيذ تلطيخ المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة الاعتراف NeuroD وكذلك GFP. وأعرب عن NeuroD في مراحل الإنقسامية 2B / 3 والخلايا تالية للتفتل في وقت مبكر 14. لقد أظهرنا في وقت سابق ان عدد الخلايا إيجابية NeuroD يزداد بشكل ملحوظ في Bcl11b المسوخ الشرطي مما يشير إلى إلقاء القبض على تمايز الخلايا العصبية 8. في حين أن عدد الخلايا إيجابية GFP وحده، وGFP / NeuroD خلايا إيجابية لم تختلف التحكم في الخلايا ومتحولة لوحظ وجود زيادة كبيرة في الخلايا إيجابية NeuroD في التلفيف المسنن حيث خلايا تلقت لجنة المساواة العرقية recombinase (الشكل 2C، لقد تم تعديل هذا الرقم من 8). العثور على خلايا إيجابية NeuroD ليس فقط في الخلايا التي تلقت لجنة المساواة العرقية recombinase ولكن أيضا في الخلايا من النوع البري اقترح أن تشارك آليات غير مباشرة في تنظيم Bcl11b من تمايز الخلايا العصبية. من هذه البيانات، ومع ذلك، الخالا يمكن استبعاد وظائف خلايا مستقلة IONAL من Bcl11b.
سابقا، كان مصمما Desmoplakin باسم الجينات هدفا مباشرا للBcl11b 8. وقد تبين أيضا أن Desmoplakin هو المشاركة في تنظيم تكاثر الخلايا الاصلية وتمايز الخلايا الكيراتينية 15. لإثبات ما إذا كانت Desmoplakin ويشارك في تنظيم تكاثر الخلايا الاصلية و / أو تمايز الخلايا العصبية من الحمض النووي التلفيف المسنن بلازميد معربا عن GFP وحده أو كان electroporated GFP وDesmoplakin تحت سيطرة المروج CMV في السيطرة وBcl11b العقول متحولة (الشكل 3A - C، وقد تم تعديل هذا الرقم من 8). وكانت شرائح الدماغ مثقف للساعة 20 الأولى في وجود BrdU (10 ميكرومتر تركيز النهائي). في يوم 11 بعد Electroporation للتم إصلاحها اتباع الثقافات شريحة من BrdU المناعية وتم تحديد عدد الخلايا إيجابية BrdU. Bcl11b TISSU متحولةالبريد electroporated مع GFP يتضمن فقط خلايا إيجابية BrdU أقل بكثير بالمقارنة مع الأنسجة السيطرة. ومع ذلك، وشارك في Electroporation للمن GFP وDesmoplakin انقاذ عدد الخلايا إيجابية BrdU للسيطرة على مستويات (الشكل 3D، لقد تم تعديل هذا الرقم من 8). معا هذه البيانات مزيد من تأكيد Desmoplakin باسم الجينات هدفا مباشرا للBcl11b ودورها في تنظيم تكاثر الخلايا الاصلية.
الشكل 1. تعيين المتابعة السابقين الرحم Electroporation للوثقافة شريحة عضوي النمط في E15.5. (A) حقن الحمض النووي في نصف الكرة الأرضية واحد. (B) الرسم التخطيطي لحقن الحمض النووي. (C) لتحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية. (D) تخطيطي الرسم من وضع قطب كهربائي. (E) Vibratome باجتزاء وحandling من أقسام الدماغ. (F) وضع أقسام الدماغ على الأغشية محددة. (GI) مشرق الميدان (G) ومضان (H، GFP) تحليل الثقافات شريحة في يوم 1 بعد Electroporation لل. (I) صورة متحد البؤر من التلفيف المسنن في يوم 11 بعد Electroporation للاستخدام دابي وGFP تلطيخ. خط متقطع يدل على التلفيف المسنن. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الفسيفساء حذف Bcl11b التي كتبها السابقين Electroporation للالرحم وثقافة شريحة عضوي النمط (معدلة من 8). Electroporation للمن مكافحة النواقل pCIG2 وحدها (A) وpCIG2- لجنة المساواة العرقية يخدعالبنية (B) في التلفيف المسنن في E15.5 تليها ثقافة شريحة عضوي النمط لمدة 18 يوما. و immunostained أقسام باستخدام الأجسام المضادة الاعتراف GFP (الخضراء) وNeuroD (الحمراء). عرض إدراجات GFP (الخضراء) وBcl11b (الحمراء) تلطيخ في أعلى التكبير لإثبات فقدان Bcl11b التعبير في الخلايا معربا عن لجنة المساواة العرقية -recombinase. (C) التحليل الإحصائي للGFP، NeuroD وGFP / NeuroD خلايا إيجابية. الخطوط المتقطعة تشير إلى التلفيف المسنن. اختبار t * p <0.005. أشرطة الخطأ، والتنمية المستدامة. ن = 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
هو انقاذ الشكل 3. Bcl11b النمط الظاهري من خلال إعادة إدخال من Desmoplakin (معدلة من 8). GFP فقط (A، B)، وكذلك تم electroporated GFP وDesmoplakin (C) في التلفيف المسنن السيطرة (A) ومتحولة (B، C) العقول في E15.5 تليها ثقافة شريحة عضوي النمط لمدة 11 يوما. و immunostained أقسام باستخدام الأجسام المضادة الاعتراف GFP (الخضراء) وBrdU (الحمراء). (D) التحليل الإحصائي للخلايا إيجابية BrdU. الخطوط المتقطعة تشير إلى التلفيف المسنن. إدراجات عرض Desmoplakin تلطيخ (الأخضر) في أعلى التكبير. اختبار t * p <0.01. شريط الخطأ، ووزارة شؤون المرأة. ن = 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. مثال الرحم Electroporation للفي E 18.5 تليها ثقافة شريحة عضوي النمط.حقن الحمض النووي التعبير عن GFP في نصف الكرة احدة تليها المناعية في يوم 16 بعد Electroporation لل(A) دابي تلطيخ؛ (ب) GFP تلطيخ، (C) دمج الصورة. خط متقطع يشير التلفيف المسنن. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحصين له وظيفة هامة في التعلم والذاكرة. التلفيف المسنن هي أيضا واحدة من منطقتين في الدماغ حيث يحدث تكوين الخلايا العصبية، ليس فقط خلال تطوير ولكن أيضا في جميع أنحاء مرحلة البلوغ. بعد الولادة والكبار عائدات تكوين الخلايا العصبية قرن آمون بطريقة مماثلة تنطوي على العديد من العوامل المشتركة. وتحديد الآليات التنظيمية لهذه العوامل أن تكون مفيدة جدا في فهم الأمراض الاعصاب والتي بدورها سوف تؤدي إلى علاجات جديدة واتخاذ تدابير وقائية. الحصول على هذه المعلومات احدة يتطلب نظاما لمعالجة الخلايا واحد ومراقبة لهم في بيئتهم المحلية كما يتضح من السابقين الرحم بعد Electroporation للثقافة شريحة عضوي النمط.
وكان أول تطبيق السابقين الرحم Electroporation للبنجاح في دراسة تطور القشرة 11،16. على حد علمنا دراسة دور Bcl11b في التنمية قرن آمون هو أول واصفا Electroporation للالسابق الرحم من DNA في التلفيف المسنن الأنسجة 8. نحن مقرها بروتوكول لدينا على الطرق التي نشرتها مجموعة Polleux دراسة تطوير القشرة 11،12. لتطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة التلفيف المسنن زيارتها حجم وموضع من الأقطاب الكهربائية إلى تعديل. وضع القطب السالب في القشرة بالقرب من موقع الحقن والقطب الموجب في موقع المعاكس أسفل الأذن غيرت قطبية Electroporation للونجح في إدخال الحمض النووي في خلايا التلفيف المسنن. وضع الأقطاب بشكل صحيح وتطبيق تيار 0،06-0،08 تحولت مللي أمبير إلى أن تكون خطوات حاسمة للغاية لتحقيق نتائج مرضية Electroporation لل. للحصول على التيار الأنسب يعتمد بشكل رئيسي على وضع الصحيح من الأقطاب كما هو موضح أعلاه. الخطوات الحاسمة إضافية للبروتوكول وحقن المواد إلى البطين وكذلك التعامل مع شرائح vibratome بعد باجتزاء. لم يتم إصلاح أنسجة المخ في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ووبالتالي فإن النسيج لينة جدا وللتحطيم بسهولة عند نقل من vibratome على الغشاء للزراعة. يكون أقسام أيضا ليتم التعامل معها بقدر كبير من العناية عند بدء تشغيل المناعية. مع هذه التعديلات والاعتبارات التلاعب من الخلايا واحد من التلفيف المسنن تم بنجاح أديت الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتنظيم Bcl11b التنمية الحصين في وقت مبكر (الشكل 2 و 3؛ تم تعديل هذه الأرقام من 8).
وكما ذكر أعلاه التلاعب الخلايا واحد ومراقبة مصيرهم هو الميزة الرئيسية لElectroporation للالرحم السابقين. والعيب الرئيسي للنهج السابق الرحم مقارنة مع في الرحم Electroporation للهو الوقت المحدود للحفاظ على شرائح في الثقافة. ومن الممكن أيضا أن ظروف زراعة الرحم السابقين قد يسبب تأخير في عملية التنمية. في تجاربنا حتى الآن تمكنا من الحفاظ على شرائح في الثقافة شص إلى 18 يوما والتي تتطابق مع سن P14. زراعة شرائح عضوي النمط بعد هذا الوقت تؤدي إلى تفكك الأنسجة. وضع غير موات إضافي للنهج السابق الرحم هو عدد محدود من الأجنة التي يمكن electroporated لكل أم. وعلى النقيض من داخل الرحم حيث Electroporation للما يصل إلى 8 الأجنة يمكن علاج هذا العدد يقتصر على 4 أجنة في النهج السابق الرحم. تشريح الأجنة، Electroporation لل، vibratome باجتزاء ونقل الشرائح في ظروف التربية والتي يتعين القيام بها في وقت قصير لضمان الثقافات شريحة ناجحة.
لأن الأحداث الرئيسية للتنمية التلفيف المسنن تحدث بين P14 P30 وسيكون من الضروري للحفاظ على شرائح عضوي النمط في الثقافة لفترات زمنية طويلة. في أول محاولة لتوسيع ثقافة أجريت electroporations الوقت في E 18.5 ضبط الأوضاع وفقا لذلك (الشكل 4؛ انظر بروتوكول). Electroporating في الونقطة زمنية يسمح الحفاظ على أقسام الدماغ في ثقافة ما يصل الى P17 أو 18. وبالإضافة إلى ذلك يتم وضع تشكيل الحصين مرة أخرى في E 18.5 بالمقارنة مع 15.5 E، على سبيل المثال، يتم تشكيل هياكل الحصين بالفعل والتعرف عليها أكثر سهولة. في المستقبل نود أن أداء السابق الرحم Electroporation للفي وقت لاحق حتى نقطة زمنية، على سبيل المثال، لP0 P4 لدراسة التغييرات خلال تنمية التلفيف المسنن حتى P30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flaming/ Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments Company (USA) | P-97 | |
| Fine Glass Pipettes | Warner Instruments | G100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige, Japan | EG-44 | |
| Anesthetic Bracket unit | Harvard Apparatus | PY2 34-0412 | |
| Halovet Vaporizer | Harvard Apparatus | PY2 34-0398 | |
| Fluovac System | Harvard Apparatus | PY2 34-0387 | |
| IMS Fluosorber | Harvard Apparatus | PY2 34-0415 | |
| Anesthetizing Chamber | Harvard Apparatus | PY2 34-0460 | |
| Electroporator | BEX Company | CUY21 EDIT | |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P3 | 3 mm electrodes for E15.5 |
| Tweezers with disk electrodes | BEX Company | LF650P5 | 5 mm electrodes for E18.5 |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | P/N 052-0500-900 | |
| HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V | Thermo Scientific | 920120 | |
| Dissection Microscope | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Stemi SV8 | |
| Inverted Microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Confocal Microscope | Leica | Sp5II | |
| 6 well dish | BD Falcon | #353502 | |
| 6 well dish | CELLSTAR | #657160 | |
| Tissue culture inserts | BD Falcon | #353090 | |
| Fast Green | Sigma | F7252 | |
| Laminin | Sigma | #L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | #P5899 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Dumont #55 | 11255-20 Inox | |
| HBSS 10x | Life Technology | 14180-046 | |
| BME | Life Technology | 41010-26 |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
- Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
- Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
- Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
- Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
- Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
- Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
- Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
