Ex Utero Electroporation og organotypiske Slice Culture of Mouse hippocampus Tissue

Introduction

Hippocampus spiller en viktig rolle i hukommelse og læring, og emosjonell adferd. En hovedfunksjon består av konsolideringen av korttidshukommelsen til langtidshukommelsen, som krever høy plastisitet av nervesystemet. Dentate gyrus av hippocampus fungerer som det primære gateway for inngangsinformasjon og er også en av to hjerneregioner med løpende nevrogenesen gjennom voksen ^1,2. Utviklingen av hippocampus struktur oppstår under sent embryogenese og spesielt i første 3 til 4 uker etter fødselen ^3. Under tidlig utvikling av dentate gyrus en stamcelle basseng er etablert nødvendig for postnatal samt voksen neurogenesis ^4. Utviklings nevroner passere gjennom ulike stadier, fra stamcelle gjennom flere stadier av stamceller til umoden og endelig moden nervecellen under fødselen, samt voksen neurogenesis. På ulike stadier av neurogenesis uttrykk forspesifikke gener som er nødvendig for å tillate modning og integrering av nye nerveceller i hippocampus kretsen ^5,6.

Ved å bruke musen genetikk og fenotype analyse ved immunhistokjemi samt molekylære metoder tillatt å definere uttrykket mønster og funksjon av mange av disse gener. I tillegg microarray analyse samt kromatin immunoprecipitation (chip) gitt informasjon om potensielle direkte og indirekte mål gener ^7,8. Men det er fortsatt mange åpne spørsmål om regulatoriske mekanismer for hippocampus utvikling, spesielt utviklingen av dentate gyrus. For å få ytterligere innsikt hvor spesifikke gener reguleres et system er nødvendig å tillate manipulering av et lite antall celler ved ned- eller opp-regulering av genet av interesse og / eller deres målgener og følge deres skjebne under utvikling. I utero elektroporering av shRNAs, cDNA av gener av interesse eller Cre recombinaSE gir et slikt verktøy. For å sikre nærvær av de ønskede DNA eller RNA små ekspresjonsplasmider skal brukes for elektroporering. Denne fremgangsmåten er svært vellykket implementert i å studere kortikal utvikling ^9,10, men er en mer utfordrende tilnærming å undersøke utviklingen av dentate gyrus på grunn av posisjonen av hippocampus strukturer i hjernen dypere lag.

Ex utero elektroporering fulgt av organotypic skive kultur er en tilnærming for å omgå dette problemet ^11,12. I motsetning til in utero elektroporering ikke hele embryoet, men bare den hode brukes slik derfor å plassere elektrodene i en mer fordelaktig måte å dirigere shRNA / DNA inn i hippocampus og dentate gyrus. Vår gruppe med hell anvendes ex utero elektroporering for å studere rollen til transkripsjonsfaktor Bcl11b under dentate gyrus utvikling ^8. Bcl11b har en dobbel rolle i dentate gyrus utvikling av regulating progenitor-celle proliferasjon, så vel som differensierings som ble demonstrert ved immunohistokjemi. For ytterligere å definere en mekanisme for Bcl11b involvering i disse prosessene, ble protokollene fra gruppen Polleux ^11,12 justert for å studere dentate gyrus, som beskrevet nedenfor i protokollinformasjonen. I en første tilnærming spørsmålet var adressert om Bcl11b er å regulere nervecelledifferensiering celle selvstendig. En annen tilnærming undersøkt om Desmoplakin, en direkte målgen av Bcl11b, er tilstrekkelig til å redde Bcl11b fenotype.

Protocol

MERK: Alle dyreforsøk ble utført i henhold til tysk lov og ble godkjent av regjeringskontorene i Tübingen.

1. Utarbeidelse av Mikropipetter, Løsninger og Membraner

1. Utarbeidelse av Mikropipetter
   1. Trekk glass mikropipetter bruker en mikropipette avtrekker med følgende program: Heat: 540, Pull: 125, Velocity: 20 og Pause: 140. Nålen lengde utgjør 5,5 cm.
   2. Skrå nåler bruker en microgrinder å skaffe en egnet spiss størrelse på 4 mm. Oppbevar nåler i en boks eller 15 cm petriskål for å hindre skade av tipsene.
2. Forberedelse av løsninger
   1. Plasmid DNA Løsning
      1. Forbered plasmid-DNA inneholdende det ønskede cDNA-konstruksjon ved hjelp av en Endotoksin fri Maxi-prep kit ifølge produsentens protokoll.
      2. Juster plasmid DNA oppløsning til en endelig konsentrasjon på 3 ug / ul (uten GFP pigg vektor) eller 4 ug /ul (med 1 ug av GFP pigg vektor) i endotoksin fri Tris-EDTA-buffer inneholdende Fast Grønn (sluttkonsentrasjon 0,05%).
   2. Laminin Stock løsning
      1. Oppløs 1 mg av laminin i sterilt vann til et sluttvolum på 1 ml. Forbered 100 ul porsjoner og oppbevar ved -80 ° C.
   3. Poly-L-lysin Stock Solution
      1. Oppløs 50 mg poly-L-lysin i 50 ml sterilt vann til en endelig konsentrasjon på 1 mg / ml. Forberede en ml deler og lagrer i -20 ° C.
   4. Complete Hank balanserte saltoppløsning (Complete HBSS)
      1. Forbered Complete HBSS ved å kombinere 100 ml 10 x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-buffer (pH 7,4), 30 ml 1 M D-glukose, 10 ml 100 mM _CaCl2, 10 ml 100 mM _MgSO4 og 4 ml 1 M _NaHCO3. Legg sterilt vann opp til en L og oppbevares ved 4 ° C.
         MERK: Autoklav alle løsninger forvente en M HEPES-buffer og 1M D-glukose, som er filter sterilisert.
   5. Slice Kultur Medium
      1. Forbered skive dyrkningsmedium ved tilsetning av 35 ml av Basal Medium Eagle, 12,9 ml av fullstendig HBSS (1.2.4), 1,35 ml av 1 M D-glukose, 250 ul av 200 mM L-glutamin, og 500 ul av penicillin-streptomycin til oppnå et sluttvolum på 50 ml. Legg hesteserum til en sluttkonsentrasjon på 5% og oppbevares ved 4 ° C.
   6. Lavt smeltepunkt (LMP) Agarose
      1. Tilbered en 4% LMP-agarose-løsning ved å tilsette 2 g av LMP-agarose til 50 ml komplett HBSS (1.2.4) etterfulgt av oppvarming i en mikrobølgeovn i 1-2 min ved høy effekt. Hold denne løsningen i et vannbad ved 37-39 ° C. Oppbevar løsningen ved 4 ° C og gjenbruk.
   7. Formaldehydet Solution
      1. I en avtrekkshette fremstille en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning ved å tilsette 4 g paraformaldehyd i 100 ml av 1 x PBS. Oppvarm løsningen til 60 ° C og tilsett noen dråper 1 N NaOH til løsningen blir cLear.
   8. Permeabilization Solution
      1. Oppløse 9 g BSA i 300 ml 1x PBS som inneholder 0,3% ernæring X-100 og oppbevares ved 4 ° C. Legg til 10% natriumazid for langtidslagring.
3. Belegg av Membran Setter
   1. Fortynn en aliquot av laminin stamløsning (1.2.2) og en målt andel av poly-L-lysin-stamløsning (1.2.3) i sterilt vann til et sluttvolum på 12 ml.
   2. Plasser membraninnsatser inn i 6-brønners plater med hver brønn inneholdende 2 ml sterilt vann. Tilsett 1 ml av beleggoppløsningen på toppen av membranen og inkuberes O / N ved 37 ° C i en 5% _{CO2-inkubator.}
   3. Etter inkubasjonen vaskes membranen setter tre ganger med 1 ml sterilt vann og tørk. Bruk belagt membran inserts på samme dag eller oppbevares ved 4 ° C i opp til fire uker i en tørr seks brønn plate.

2. DNA Injeksjon og Electroporation av E15.5 og E18.5 embryo

1. Avlive bevisstløs mus ved halshugging på embryonale dag (E) 15.5 eller 18.5. Dissekere livmoren inneholder embryoene ¹³ og plassere den i en petriskål som inneholder 15-20 ml kald komplett HBSS.
   MERK: Fra dette punktet og fremover, holde embryoene og vev på is.
2. Bruk en saks til å skille hver embryo fra livmor horn og sted inn i en andre petriskål som inneholder kald komplett HBSS.
3. Under et disseksjonsmikroskop, bryte livmormuskelen veggen og placenta ved hjelp av et par av fine tang (# 55) og sakser. Frigjør hånd embryo fra plommesekken.
4. Bruke et par av Bonn saks til decapitate embryoene like over forbein på en 60 ° vinkel. Hvis forsøket krever genotyping av embryoene, samle en vevsprøve for genomisk DNA (et lite stykke av halen).
5. Overfør hodet til en ren og tørr petriskål. På grunn av at hodet var blitt falt i en 60 ° vinkel, må hodet vippe til den ene siden når plassert med ryggsiden opp.
6. Plassere en nål nøye inn i midten av halvkulen nær til bregma (figur 1 A, B). Injisere ca. 2-3 ul (ved 3 eller 4 ug / ul) av DNA-løsningen ved å trå på pedalen av picospritzer III å bruke 30 pounds av trykket i løpet av 10 til 15 millisekunder per puls, å anvende 5-8 pulser. Varigheten og antallet av pulser er avhengig av diameteren av nålen åpningen med mindre åpninger som krever mer tid. Intervallet mellom hver puls utgjør 1 sek.
7. Før du plasserer elektrodene, påfør noen dråper komplett HBSS på hodet av embryo. Plassere elektrodene på en slik måte at den "negative" terminalen er på samme side som den injiserte ventrikkel og den "positive" elektrode på motsatt side av den injiserte ventrikkel under øret av embryoet hode (figur 1C, D). Påfør 5 pulser av 50 V.
   1. Bruke 3 mm elektroder for E 15.5 og 5 mm elektroder for E 18.5.

3. Disseksjon av Brain

1. Etter elektroporering, skrelle av huden fra hodet ved hjelp av et par fine tang. Ved hjelp av et par fjær saks foreta et lite snitt i midten av lillehjernen ved midtlinjen av skallen.
2. Sett våren saks i snittet og kuttet i lengderetningen langs sagittal sutur. Skrelle av skallen og koble hjernen fra skallen ved hjelp av fine tang. Overfør hele hjernen til 15-20 ml kald HBSS komplett løsning.
3. I mellomtiden, helle 4% LMP agarose,holdt ved 37-39 ° C i et vannbad, i en skall-løs form.
4. Ta hjernen ut av den komplette HBSS av et lite scoop slikkepott og drenere overflødig HBSS ved hjelp fint silkepapir eller Kimwipes.
5. Plasser hele hjernen forsiktig inn i agarose og justere sin posisjon med en tynn nål. Hold formen på is inntil agarose er størknet og blokken er seksjonert (for koronalsnitt olfactory pærer peker opp).

4. Vibratome Seksjonering og Slice Kultur

1. Trim LMP agarose blokker og lim dem til prøvestadiet bruke "superlim". Etter at limet er tørt overføring prøven scenen til bufferbrettet av vibratome og fyll med iskald full HBSS inntil blokken er nedsenket i løsningen.
   MERK: Steriliser alle instrumenter og utstyr til overflater med 70% etanol før seksjonering.
2. Forbered 250 mikrometer tykke vibratome seksjoner med et nytt blad som fulgte.
   1. Trimme blokken with følgende innstillinger; frekvens - 60 Hz, amplitude - 0,7 mikrometer, hastighet 16-18 mm / sek. Skjær avsnittene inneholder ønsket vev med innstillingene over på lav hastighet (9 mm / sek). Starte seksjonering fra hindbrain, samle 5-7 seksjoner fra storhjernen.
   2. Overfør seksjonene til en ren 6 brønners kulturskål inneholdende 5 ml iskald HBSS fullføre ved hjelp av en bøyd spatel og hold på is inntil alle seksjoner er samlet inn (figur 1E).
3. Fukt membranen i et kryss mote med 100 mL av komplett HBSS før du legger seksjonene på membranen, for å lette orienteringen av seksjonene.
4. Overfør delene med en bøyd slikkepott på membranen (plukke opp et hjørne av seksjonen med pinsett og dra på slikkepott og deretter bruke tang for å presse seksjonen ned på membranen). Plassere opptil fem seksjoner på en membran og ordne ved hjelp av tang (figur 1F). Ikke overlapper de deler med hverandre.
   1. Ta overskudd av HBSS av membranen ved hjelp av en pipette. De spesifikke membraner som brukes her er festet til en ramme og innsatt i vevskultur plate, som tillater vevet å være i kontakt, men ikke dekkes av mediet.
5. Plasser membraninnsatser i en 6-brønners plate inneholdende 1,8 ml av skive kulturmedium (1.2.5) (figur 1 G, H). Inkuber kulturskål ved 37 ° C med 5% _CO2 i 11 DIV eller 14 DIV. Endre halve medium (0,9 ml) annenhver dag.
   MERK: På dette stadiet, legge reagenser som bromdeoksyuridin (BrdU, 10 mikrometer endelig konsentrasjon) for merking voksende celler til media for første 20 timer av tiden kultur.

5. Festing av §§ Fulgt av Immunfluorescens Farging

1. Bruk en ren og skarp skalpell blad å klippe og trimme membraner avhengig av retningen påseksjonene.
2. Overfør seksjonene sammen med membranen til en 24-brønners plate inneholdende 1 ml av 4% PFA (1.2.7). Inkuber seksjoner i 1 time ved romtemperatur etterfulgt av 3 vaskinger med 1x PBS i 15 minutter hver. Inkuber seksjonene O / N med permeabilization løsning ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
3. Den følgende dag, inkuber seksjoner med egnede primære antistoffer, fortynnet i permeabilization løsning, O / N eller i 48 timer ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
4. Vask seksjonene 3 ganger i 15 minutter med 1 x PBS og inkuberes O / N ved 4 ° C med de passende sekundære antistoff fortynnet i permeabilization løsning.
5. Etter inkubasjon med sekundære antistoffer, vaskes en gang med seksjonene 1 x PBS i 15 minutter, etterfulgt av DAPI farging i 10 min.
6. Vask seksjonene 3 ganger med 1 x PBS i 15 minutter hver, og overføre til objektglass. Legg ImmunoMount og forsiktig plassere en dekkglass på toppen av seksjonene. Tørk lysbilder O / N ved 4 ° C og seal med neglelakk.
   MERK: Hold lysbildene alltid ved 4 ° C.
   1. Analyser skive kulturer ved konfokalmikroskopi (Figur 1I).

Representative Results

Ablasjon av transkripsjonsfaktoren Bcl11b fører til svekkelse av stamcelle spredning og nevronale differensiering resulterer i en redusert dentate gyrus størrelse og celle nummer. Videre mutante nevroner ikke klarer å integrere i hippocampus kretser forårsaker læring og hukommelse svekkes ^8. Å svare på spørsmål om reguleringsmekanisme (r) av Bcl11b i disse prosessene ex utero elektroporering ble ansatt.

Adressering spørsmålet om Bcl11b celle-autonomt regulerer nevronale celledifferensiering, mosaikk sletting av Bcl11b ble generert av ex utero elektroporering av en GFP- Cre rekombinase konstruere eller GFP alene ¹¹ inn Bcl11b ^{FLOX / FLOX} hippocampi på E15.5 fulgt av organotypic skive kultur opp til 18 dager etter elektroporering (Figur 2A, B, og dette tallet har blitt forandret fra ^8). Å avgjøre om Bcl11b regulerer differensiering av granule celler celle-autonomt immunfluorescens farging ble utført ved hjelp av spesifikke antistoffer som gjenkjenner NeuroD samt GFP. NeuroD er uttrykt i mitotiske stadier 2b / 3 og tidlig postmitotic celler ^14. Vi har vist tidligere at antall NeuroD positive celler er betydelig økt i Bcl11b betingede mutanter som indikerer en arrestasjon av neuronal differensiering ^8. Mens antallet av GFP-positive celler alene og GFP / NeuroD-positive celler ikke skiller seg i kontroll- og mutante celler en betydelig økning i NeuroD-positive celler ble observert i gyrus dentatus hvor cellene hadde fått Cre rekombinase (figur 2C, dette tallet er blitt modifisert fra ^8). Finne NeuroD-positive celler, ikke bare i celler som hadde mottatt Cre rekombinase, men også i villtype-celler antydet at indirekte mekanismer som er involvert i regulering av nevronal Bcl11b celledifferensiering. Fra disse data, men Additional celle-autonome funksjoner av Bcl11b kan ikke utelukkes.

Tidligere Desmoplakin ble bestemt som en direkte målgen av Bcl11b ^8. Det ble også vist at Desmoplakin er involvert i regulering av stamcelle proliferasjon og differensiering av keratinocytter ^15. For å demonstrere hvorvidt Desmoplakin er involvert i reguleringen av progenitor-celleformering og / eller neuronal differensiering av dentate gyrus plasmid-DNA som uttrykker GFP alene eller GFP og Desmoplakin under kontroll av CMV-promoteren ble elektroporert inn i kontroll- og Bcl11b mutante hjerne (figur 3A - C, og dette tallet har blitt forandret fra ^8). De hjerneskiver ble dyrket for det første 20 timer i nærvær av BrdU (10 pM sluttkonsentrasjon). Ved dag 11 etter elektroporering de skive kulturer ble fiksert fulgt av BrdU immunfarging og antall BrdU positive celler ble bestemt. Bcl11b mutant tissue elektroporert med GFP bare inneholdt signifikant færre BrdU positive celler når sammenlignet med kontrollvevet. Men co-elektroporering av GFP og Desmoplakin reddet antall BrdU positive celler for å kontrollere nivåer (Figur 3D, og dette tallet har blitt forandret fra ^8). Tatt sammen disse dataene videre bekrefte Desmoplakin som en direkte målgen av Bcl11b og dens rolle i reguleringen av stamcelle spredning.

Figur 1. Set-up av ex utero elektroporering og organotypic skive kultur på E15.5. (A) Injeksjon av DNA til en halvkule. (B) Skjematisk tegning av DNA injeksjon. (C) Posisjonering av elektrodene. (D) Skjematisk tegning av elektrodeplasseringen. (E) Vibratome seksjonering og handling av hjerneseksjoner. (F) Plassere hjerneseksjoner på bestemte membraner. (GI) Lys-feltet (G) og fluorescens (H, GFP) analyse av skive kulturer på dag 1 etter elektroporering. (I) Confocal bilde av dentate gyrus på dag 11 etter elektroporering hjelp DAPI og GFP farging. Stiplet linje angir dentate gyrus. Skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Mosaic sletting av Bcl11b av ex utero elektroporering og organotypic skive kultur (modifisert fra ^8). Electroporation av kontroll vektor pCIG2 alene (A) og pCIG2- Cre construct (B) inn i gyrus dentatus ved E15.5 fulgt av organotypic skive kultur i 18 dager. Seksjonene ble immunostained ved hjelp antistoffer som gjenkjenner GFP (grønt) og NeuroD (rød). Innfellinger viser GFP (grønt) og Bcl11b (rød) farging ved høyere forstørrelse for å påvise tap av Bcl11b-ekspresjon i celler som uttrykker Cre -recombinase. (C) Statistisk analyse av GFP, NeuroD og GFP / NeuroD-positive celler. Stiplede linjer angir dentate gyrus. t-test, * p <0,005; feilfelt, sd; n = 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Bcl11b fenotype blir reddet av re-introduksjon av Desmoplakin (modifisert fra ^8). GFP bare (A, B) samt GFP og Desmoplakin (C) ble elektroporert inn i dentate gyrus av kontroll (A) og mutant (B, C) ​​hjerner ved E15.5 fulgt av organotypic skive kultur i 11 dager. Snittene ble immunofarget ved anvendelse av antistoffer som gjenkjenner GFP (grønt) og BrdU (red). (D) Statistisk analyse av BrdU positive celler. Stiplede linjer angir dentate gyrus. Innfellinger vise Desmoplakin flekker (grønn) ved høyere forstørrelse. t-test, * p <0,01; error bar, sem; n = 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Ex utero elektroporering på E 18.5 fulgt av organotypic skive kultur.Injeksjon av DNA som uttrykker GFP til en halvkule, etterfulgt av farging på dag 16 etter elektroporering (A) DAPI farging,. (B) GFP-farging, (C) fusjonerte bilde. Stiplet linje angir dentate gyrus. Skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Hippocampus har en viktig funksjon i læring og hukommelse. Dentate gyrus er også en av to områder av hjernen hvor nevrogenesen oppstår ikke bare under utvikling, men også gjennom hele voksenlivet. Postnatal og voksne hippocampus nevrogenesen proveny på en lignende måte som involverer mange felles faktorer. Definere reguleringsmekanismer for disse faktorene vil være svært nyttig i å forstå nevrodegenerative sykdommer som i sin tur vil føre til nye behandlingsformer og forebyggende tiltak. For å få denne informasjonen man trenger et system for å manipulere enkeltceller og observere dem i sitt opprinnelige miljø som demonstrert av ex utero elektroporering fulgt av organotypic skive kultur.

Ex utero elektroporering ble først suksess i å studere cortex utvikling ^11,16. Til vår kunnskap undersøke hvilken rolle Bcl11b i hippocampus utvikling er den første som beskriver ex utero elektroporering av DNA inn dentate gyrus vev ^8. Vi baserte vår protokoll på metodene publisert av Polleux gruppen studere cortex utvikling ^11,12. For vellykket anvendelse av denne metoden for å studere dentate gyrus størrelsen og plasseringen av elektrodene måtte justeres. Plassere den negative elektrode ved cortex nær injeksjonsstedet, og den positive elektrode på den motsatte side under øret endres polariteten av elektroporering og lyktes i å introdusere DNA inn i celler av dentate gyrus. Plassere elektrodene fullstendig og påføring av en strøm på 0,06 til 0,08 mA viste seg å være svært avgjørende trinn for å oppnå tilfredsstillende resultater electroporation. For å oppnå de mest tilfredsstillende strøm avhenger hovedsakelig av den riktige plassering av elektrodene som beskrevet ovenfor. Andre kritiske trinnene i protokollen injiserer materialet inn i ventrikkelen, så vel som håndtering av skivene etter vibratome snitting. Hjernevevet ikke er fast gjennom hele prosedyren ogderfor vevet er veldig myk og lett ødelegges ved overføring fra vibratome på membranen for dyrking. Seksjoner må også håndteres med stor forsiktighet når du starter farging. Med disse modifikasjoner og betraktninger manipulasjoner av enkeltceller i dentate gyrus ble vellykket utført besvare spørsmål vedrørende Bcl11b regulering av tidlig hippocampus utvikling (figur 2 og 3, og dette tall er endret fra ^8).

Som nevnt ovenfor manipulere enkeltceller og observere deres skjebne er den store fordelen med ex utero elektroporering. En stor ulempe med ex utero tilnærming sammenlignet med i utero elektroporering er det begrenset tid til å holde skiver i kultur. Det er også mulig at ex utero dyrkingsforhold kan føre til en forsinkelse i utvikling. I våre forsøk så langt vi var i stand til å holde skivene i kultur up til 18 dager, noe som tilsvarer en alder av P14. Dyrking av organotypiske skiver utover denne tiden føre til oppløsningen av vev. En ytterligere ulempe ved den tidligere utero tilnærmingen er begrenset antall embryoer som kan elektroporerte per mor. I motsetning til i utero elektroporering hvor opp til åtte embryoer kan behandles dette antallet er begrenset til fire embryoene i ex utero tilnærming. Disseksjon av embryoer, elektroporering, vibratome seksjonering og overføring av skivene i dyrkningsforhold har som skal utføres i løpet av kort tid for å sikre vellykkede skive kulturer.

Fordi store begivenheter i dentate gyrus utvikling oppstå mellom P14 og P30 ville det være nødvendig å holde organotypiske skiver i kulturen i lengre tidsperioder. I et første forsøk på å forlenge tids electroporations kultur ble utført ved E 18.5 justere betingelsene i henhold til (figur 4, se protokoll). Electroporating på ther tidspunktet lar holde hjernen seksjoner i kultur opp til P17 eller 18. I tillegg hippokampalformasjonen videreutvikles på E 18,5 sammenlignet E 15.5, f.eks, er hippocampus strukturer allerede dannet og mer lett gjenkjennelig. I fremtiden ønsker vi å utføre ex utero elektroporering på selv senere tidspunkter, f.eks P0 til P4 for å undersøke endringer under dentate gyrus utvikling opp til P30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26