Ex Utero Elektroporering og organotypisk Slice kultur Mouse Hippocampal Tissue

Introduction

Hippocampus spiller en vigtig rolle i hukommelse og indlæring samt følelsesmæssig adfærd. En funktion vigtigste består i konsolideringen af ​​korttidshukommelsen i langtidshukommelsen, som kræver høj plasticitet af nervesystemet. Gyrus dentatus i hippocampus fungerer som den primære gateway for input information og er også en af to områder af hjernen med igangværende neurogenese gennem hele voksenlivet ^1,2. Udviklingen af hippocampus struktur sker under sen embryogenese og især i de første 3 til 4 uger efter fødslen ^3. I den tidlige udvikling af gyrus dentatus en stamcelle pool etableres nødvendig for postnatal samt voksen neurogenese ^4. Udvikling neuroner passerer gennem forskellige stadier, fra stamceller gennem flere stadier af stamceller til umodne og endelig den modne neuron under postnatal samt voksen neurogenese. På forskellige stadier af neurogenese udtryk forspecifikke gener er nødvendig for at gøre det muligt for modning og integration af nye neuroner i hippocampus kredsløb ^5,6.

Ved hjælp af musen genetik og fænotype-analyse ved immunohistokemi samt molekylære metoder tilladt definere ekspressionsmønster og funktion af mange af disse gener. Desuden microarray analyse samt kromatin immunoprecipitation (chip) givet oplysninger om potentielle direkte og indirekte målgener ^7,8. Men der er stadig mange åbne spørgsmål vedrørende de regulatoriske mekanismer hippocampal udvikling, især udviklingen af ​​gyrus dentatus. For at få yderligere indsigt hvordan specifikke gener reguleres et system kræves tillader manipulation af et lille antal celler ved ned- eller opregulering af genet af interesse og / eller dets målgener og følge deres skæbne under udvikling. I livmoderen elektroporation af shRNAs, cDNA af gener af interesse eller Cre recombinaSE giver et sådant værktøj. For at sikre tilstedeværelsen af ​​det ønskede DNA eller små RNA ekspressionsplasmider bør anvendes til elektroporation. Denne fremgangsmåde er meget gennemført med succes i at studere cortical udvikling ^9,10, men er en mere udfordrende tilgang undersøge udviklingen af gyrus dentatus grund af placeringen af de hippocampale strukturer i dybere hjerne lag.

Ex utero elektroporation efterfulgt af organotypisk skive kultur er en metode til at omgå dette problem ^11,12. I modsætning til in utero elektroporation ikke hele embryo, men kun hovedet anvendes tillader derfor at placere elektroderne i en mere gunstig måde at lede shRNA / DNA mod hippocampus og gyrus dentatus. Vores gruppe med held ex utero elektroporation at studere rollen af transkriptionsfaktoren Bcl11b under gyrus dentatus udvikling ^8. Bcl11b har en dobbelt rolle i tandede gyrus udvikling ved regulating progenitor celleproliferation samt differentiering som blev påvist ved immunhistokemi. For yderligere at definere en mekanisme til Bcl11b deltagelse i disse processer, er protokoller til Polleux gruppe ^11,12 justeres for at studere den tandede gyrus som beskrevet nedenfor i protokollen sektion. I en første tilgang til spørgsmålet var rettet, om Bcl11b regulerer neuronal celledifferentiering celle selvstændigt. En anden metode undersøgt desmoplakin, et direkte mål gen Bcl11b, er tilstrækkelig til at redde Bcl11b fænotype.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i henhold til den tyske lov og blev godkendt af offentlige kontorer i Tübingen.

1. Fremstilling af mikropipetter, løsninger og membraner

1. Fremstilling af Mikropipetter
   1. Træk glas mikropipetter ved hjælp af en mikropipette aftrækker med følgende program: Varme: 540, Pull: 125, Hastighed: 20 og Forsinkelse: 140. De nålelængde udgør 5,5 cm.
   2. Koniske nåle bruger microgrinder at opnå en passende spids størrelse på 4 mm. Opbevar nåle i en kasse eller 15 cm petriskål for at forhindre beskadigelse af spidserne.
2. Fremstilling af opløsninger
   1. Plasmid DNA-opløsning
      1. Forbered plasmid DNA indeholdende det ønskede cDNA konstrukt under anvendelse af et Endotoxin fri Maxi-prep kit ifølge producentens protokol.
      2. Juster plasmid DNA-opløsning til en endelig koncentration på 3 pg / pl (uden GFP spike vektor) eller 4 ug /pi (med 1 ug af GFP spike vektor) i endotoksinfrit Tris-EDTA-buffer indeholdende Fast Green (slutkoncentration 0,05%).
   2. Laminin Stamopløsning
      1. Opløs 1 mg laminin i sterilt vand til et slutvolumen på 1 ml. Forbered 100 pi prøver og opbevares ved -80 ° C.
   3. Poly-L-lysin Stock Solution
      1. Opløs 50 mg af poly-L-lysin i 50 ml sterilt vand til en slutkoncentration på 1 mg / ml. Forbered 1 ml portioner og opbevares i -20 ° C.
   4. Komplet Hanks Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
      1. Forbered Complete HBSS ved at kombinere 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-buffer (pH 7,4), 30 ml 1 M D-glucose, 10 ml 100 mM _CaCl2, 10 ml 100 mM _MgSO4 og 4 ml 1 M _NaHCO3. Tilføj sterilt vand op til 1 L og opbevares ved 4 ° C.
         BEMÆRK: Autoklave alle løsninger forventer 1 M HEPES-buffer og 1 M D-glucose, som er filter steriliseres.
   5. Slice Culture Medium
      1. Forbered skive dyrkningsmediet ved tilsætning af 35 ml Basal Medium Eagle, 12,9 ml komplet HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-glucose, 250 pi 200 mM L-glutamin og 500 pi penicillin-streptomycin til opnå et slutvolumen på 50 ml. Tilføj hesteserum til en endelig koncentration på 5% og opbevares ved 4 ° C.
   6. Med lavt smeltepunkt (LMP) Agarose
      1. Forbered en 4% LMP agaroseopløsning ved at blande 2 g LMP agarose til 50 ml komplet HBSS (1.2.4) efterfulgt af opvarmning i en mikrobølgeovn i 1-2 minutter ved høj effekt. Denne opløsning opbevares i et vandbad ved 37-39 ° C. Opløsningen opbevares ved 4 ° C og genbrug.
   7. Paraformaldehydopløsning
      1. I et stinkskab fremstille en 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning ved tilsætning af 4 g paraformaldehyd til 100 ml 1x PBS. Opvarm opløsningen til 60 ° C, og der tilsættes nogle få dråber 1 N NaOH, indtil opløsningen bliver cLear.
   8. Permeabilisering Solution
      1. 9 g BSA opløses i 300 ml 1x PBS indeholdende 0,3% næring X-100 og opbevares ved 4 ° C. Tilsæt 10% natriumazid til langtidsopbevaring.
3. Overfladebehandling af Membrane Inserts
   1. Fortyndes en alikvot af laminin stamopløsning (1.2.2), og en alikvot af poly-L-lysin-stamopløsning (1.2.3) i sterilt vand til et slutvolumen på 12 ml.
   2. Placer membran skær i 6 brøndsplader med hver brønd indeholdende 2 ml sterilt vand. Tilsæt 1 ml coatingopløsning på toppen af membranen og inkuberes O / N ved 37 ° C i en 5% CO _2-inkubator.
   3. Efter inkubation vaskes membranen indsætter tre gange med 1 ml sterilt vand og tør. Brug coatede membran skær på samme dag eller opbevares ved 4 ° C i op til fire uger på et tørt 6 brønde.

2. DNA-injektion og elektroporering af E15.5 og E18.5 embryoer

1. Aflive den ubevidste mus ved cervikal dislokation på embryonale dag (E) 15.5 eller 18.5. Dissekere livmoderen indeholder embryoner ¹³ og læg det i en petriskål indeholdende 15-20 ml kold komplet HBSS.
   BEMÆRK: Fra dette punkt og fremefter holde embryoner og væv på is.
2. Brug en saks til at adskille hvert embryo fra livmoderhorn og sted i en anden petriskål indeholdende kold komplet HBSS.
3. Under et dissektionsmikroskop, adskille uterine muskel væg og placenta anvendelse af et par fine tænger (# 55) og sakse. Slip forsigtigt embryo fra blommesækken.
4. Brug et par Bonn saks til decapitate embryonerne lige over forbenene på en 60 ° vinkel. Hvis forsøget kræver genotypning af embryonerne, indsamle en vævsprøve for genomisk DNA isolation (et lille stykke af halen).
5. Overfør hovedet til en ren og tør petriskål. Fordi hovedet var blevet halshugget i en 60 ° vinkel, bør hovedet vippe til den ene side, når de anbringes dorsalsiden op.
6. Sæt en nål forsigtigt ind i midten af halvkugle tæt på bregma (figur 1A, B). Sprøjt ca. 2-3 pi (ved 3 eller 4 pg / pl) af DNA-opløsning ved at træde på pedalen for picospritzer III ved hjælp af 30 pounds af pres for varigheden af ​​10-15 ms per impuls, anvende 5-8 pulser. Varigheden og antallet af impulser afhænger af diameteren af ​​nålens åbning med mindre åbninger, der kræver mere tid. Intervallet mellem hver puls svarer til 1 sek.
7. Før du placerer elektroderne, anvende et par dråber komplet HBSS på hovedet af den brodeyo. Anbring elektroderne på en sådan måde, at "negativ" terminal er på den samme side som den injicerede ventrikel og "positive" elektrode på den modsatte side af den injicerede ventrikel under øret af fosterets hoved (figur 1C, D). Anvend 5 impulser på 50 V.
   1. Brug 3 mm elektroder til E 15.5 og 5 mm elektroder til E 18.5.

3. Dissektion af hjernen

1. Efter elektroporation skrælle skindet fra hovedet ved hjælp af et par fine tænger. Anvendelse af et par af foråret saks lave et lille snit i midten af ​​cerebellum ved midterlinjen af ​​kraniet.
2. Sæt foråret saks i snittet og skåret på langs langs sagittale sutur. Træk kraniet og tag hjernen fra kraniet ved hjælp af fine pincet. Overfør hele hjernen i 15-20 ml kold komplet HBSS løsning.
3. I mellemtiden, hæld 4% LMP agarose,holdt ved 37-39 ° C i et vandbad, i en peel-away form.
4. Tag hjernen ud af det komplette HBSS med en lille skovl spatel og dræne overskydende HBSS ved hjælp fint silkepapir eller Kimwipes.
5. Placer hele hjernen forsigtigt ind i agarose og justere sin position med en fin nål. Hold formen på is, indtil agarose er størknet og blokken er opdelt (for kronafsnit de olfaktoriske pærer peger op).

4. Vibratome Sektionsinddeling og Slice Kultur

1. Trim LMP agarose blokke og lim dem med modellen scenen ved hjælp af "superlim". Efter limen er tør overføre modellen fase til den buffer bakke af vibratome og fyld med iskold komplet HBSS indtil blokken er nedsænket i opløsningen.
   BEMÆRK: Steriliser alle instrument og udstyr overflader med 70% ethanol før sektionering.
2. Forbered 250 um tykke vibratome sektioner ved hjælp af en ny klinge som følges.
   1. Trim blokken with følgende indstillinger; frekvens - 60 Hz, amplitude - 0,7 um, hastighed 16-18 mm / sek. Skær afsnittene indeholdende det ønskede væv med ovennævnte indstillinger ved lav hastighed (9 mm / sek). Start af sektionering fra baghjerne, indsamle 5-7 sektioner fra cerebrum.
   2. Overfør sektioner til et rent 6 godt dyrkningsskål indeholdende 5 ml iskold fuldføre HBSS ved hjælp af en bøjet spatel og holde på is indtil alle sektionerne opsamlet (figur 1E).
3. Fugt membranen indover mode med 100 ul komplet HBSS før du placerer afsnittene på membranen for at lette orienteringen af ​​sektionerne.
4. Overfør sektioner ved hjælp af en bøjet spatel på membranen (afhente et hjørne af afsnittet med pincet og træk på spatel og derefter bruge pincet til at skubbe afsnittet på membranen). Placere op til fem sektioner på en membran og arrangere ved hjælp af pincet (figur 1F). Du må ikke overlappe de sektioner med hinanden.
   1. Tag overskud af HBSS off membranen ved hjælp af en pipette. De specifikke membraner, der anvendes her, er fastgjort til en ramme og indsat i vævskulturplade, som giver det væv, der er i kontakt, men som ikke er omfattet af mediet.
5. Placer membran skær i en 6-brønds plade indeholdende 1,8 ml skive dyrkningsmedium (1.2.5) (figur 1G, H). Inkubér dyrkningsskålen ved 37 ° C med 5% CO ₂ for 11 DIV eller 14 DIV. Skift halvdelen medium (0,9 ml) hver anden dag.
   BEMÆRK: På dette tidspunkt tilsættes reagenser, såsom bromdeoxyuridin (BrdU; 10 uM slutkoncentration) til mærkning prolifererende celler til medierne for de første 20 timer af kulturen tid.

5. Fiksering af sektionerne Efterfulgt af immunfluorescensfarvning

1. Brug en ren og skarp skalpel til at skære og trim membranerne afhængigt af orienteringen afsektionerne.
2. Overfør sektionerne sammen med membranen til en 24-brønds plade indeholdende 1 ml 4% PFA (1.2.7). Inkuber sektionerne i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af 3 vaske med 1x PBS i 15 minutter hver. Inkuber afsnittene O / N med permeabilisering opløsning ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
3. Den følgende dag, inkuberes snittene med passende primære antistoffer fortyndet i permeabilisering opløsning, O / N eller i 48 timer ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
4. Vask sektionerne 3 gange i 15 minutter med 1 x PBS og inkuberes O / N ved 4 ° C med de passende sekundære antistoffer fortyndet i permeabilisering opløsning.
5. Efter inkubation med sekundære antistoffer, vaskes sektionerne gang med 1x PBS i 15 minutter efterfulgt af DAPI farvning for 10 min.
6. Vask afsnittene 3 gange med 1x PBS i 15 minutter hver og overføre til objektglas. Tilføj ImmunoMount og forsigtigt placere et dækglas oven på sektionerne. Tør slides O / N ved 4 ° C og SEal med neglelak.
   BEMÆRK: Hold dias altid ved 4 ° C.
   1. Analyser skivekulturer ved konfokal mikroskopi (figur 1I).

Representative Results

Ablation af transkriptionsfaktoren Bcl11b forårsager svækkelse af progenitor celleproliferation og neuronal differentiering resulterer i en reduceret gyrus dentatus størrelse og celleantal. Desuden mutant neuroner ikke at blive integreret i hippocampus kredsløb forårsager indlæring og hukommelse værdiforringelse ^8. For at besvare spørgsmål vedrørende reguleringsmekanisme (r) Bcl11b i disse processer ex utero elektroporation blev ansat.

Behandle spørgsmålet om, hvorvidt Bcl11b celle-selvstændigt regulerer neuronal celle differentiering, mosaik deletioner af Bcl11b blev genereret ved ex utero elektroporation af en GFP- Cre rekombinase konstruktion eller GFP alene ¹¹ i Bcl11b ^{FLOX / FLOX} hippocampi på E15.5 efterfulgt af organotypisk skive kultur op til 18 dage efter elektroporation (figur 2A, B, denne figur er blevet ændret fra ^8). For at bestemme om Bcl11B regulerer differentieringen af ​​granulerede celler celle-autonomt immunfluorescensfarvning blev udført under anvendelse af specifikke antistoffer, der genkender NeuroD samt GFP. NeuroD udtrykkes i mitotiske trin 2b / 3 og tidlige postmitotiske celler ^14. Vi har tidligere vist, at antallet af NeuroD positive celler er signifikant forøget i Bcl11b betingede mutanter indikerer en anholdelse af neuronal differentiering ^8. Mens antallet af GFP-positive celler alene og GFP / NeuroD positive celler ikke adskilte i kontrol- og mutantceller en betydelig stigning i NeuroD positive celler blev observeret i gyrus dentatus, hvor cellerne havde modtaget Cre-rekombinase (figur 2C; dette tal er blevet ændret fra ^8). Finde NeuroD positive celler ikke kun i celler, som havde modtaget Cre-rekombinase, men også i vildtypeceller foreslået, at indirekte mekanismer er involveret i Bcl11b regulering af neuronal celledifferentiering. Ud fra disse data imidlertid Additional celle-autonome funktioner Bcl11b kan ikke udelukkes.

Tidligere var desmoplakin bestemt som et direkte mål gen af Bcl11b ^8. Det blev også vist, at desmoplakin er involveret i reguleringen af progenitorcelle proliferation og differentiering af keratinocytter ^15. For at demonstrere, om desmoplakin er involveret i reguleringen af progenitorcelle proliferation og / eller neuronal differentiering af gyrus dentatus plasmid DNA, der udtrykker GFP alene eller GFP og desmoplakin under kontrol af CMV-promotoren blev elektroporeret i kontrol og Bcl11b mutant hjerner (figur 3A - C; dette tal er blevet ændret fra ^8). De hjerneskiver blev dyrket i de første 20 timer i nærværelse af BrdU (10 uM slutkoncentration). På dag 11 efter elektroporation skivekulturer blev fastsat efterfulgt af BrdU-immunfarvning og antallet af BrdU-positive celler blev bestemt. Bcl11b mutant tissue elektroporeret med GFP kun indeholdt væsentligt færre BrdU-positive celler i forhold til kontrol væv. Men co-elektroporation af GFP og desmoplakin reddet antallet af BrdU positive celler til kontrolniveauer (figur 3D, dette tal er blevet ændret fra ^8). Tilsammen disse data yderligere bekræfte desmoplakin som et direkte mål gen Bcl11b og dets rolle i reguleringen af ​​stamfader celleproliferation.

Figur 1. Set-up af ex utero elektroporation og organotypisk skive kultur ved E15.5. (A) Injektion af DNA i en halvkugle. (B) Skematisk tegning af DNA-injektion. (C) placering af elektroderne. (D) Skematisk tegning af elektrodeplacering. (E) Vibratome sektionering og hÅNDTERING af hjernesektioner. (F) anbringelse hjernesnit specifikke membraner. (GI) Bright-field (G) og fluorescens (H, GFP) analyse af skive kulturer på dag 1 efter elektroporering. (I) Konfokal billede af gyrus dentatus på dag 11 efter elektroporering ved anvendelse af DAPI og GFP-farvning. Stiplet linje angiver den tandede gyrus. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2. Mosaik sletning af Bcl11b af ex utero elektroporation og organotypisk skive kultur (modificeret fra ^8). Elektroporation af kontrol vektor pCIG2 alene (A) og pCIG2- Cre construct (B) i den tandede gyrus i E15.5 efterfulgt af organotypisk skive kultur i 18 dage. Snit blev immunfarvet ved anvendelse af antistoffer, der genkender GFP (grøn) og NeuroD (rød). Inlays vise GFP (grøn) og Bcl11b (rød) farvning ved højere forstørrelse for at demonstrere tab af Bcl11b ekspression i celler, der udtrykker Cre -recombinase. (C) Statistisk analyse af GFP, NeuroD og GFP / NeuroD positive celler. Stiplede linjer angiver den tandede gyrus. t-test, * p <0,005; fejlsøjler, sd; n = 5. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. Bcl11b fænotype reddet af re-introduktion af desmoplakin (modificeret fra ^8). Kun GFP (AB) samt GFP og desmoplakin (C) blev elektroporeret ind i gyrus dentatus fra kontrol (A) og mutant (B, C) ​​hjerner ved E15.5 efterfulgt af organotypisk skive kultur i 11 dage. Snit blev immunfarvet ved anvendelse af antistoffer, der genkender GFP (grøn) og BrdU (rød). (D) Statistisk analyse af BrdU-positive celler. Stiplede linjer angiver den tandede gyrus. Mellemværker vise desmoplakin farvning (grøn) ved højere forstørrelse. t-test, * p <0,01; error bar, sem; n = 4. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4. Ex utero elektroporation på E 18,5 efterfulgt af organotypisk skive kultur.Injektion af DNA, der udtrykker GFP i en halvkugle efterfulgt af immunfarvning på dag 16 efter elektroporation (A) DAPI-farvning;. (B) GFP-farvning; (C) fusioneret billede. Stiplet linje angiver gyrus dentatus. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Hippocampus har en vigtig funktion i indlæring og hukommelse. Den tandede gyrus er også en af ​​to hjerneområder, hvor neurogenese optræder ikke kun under udvikling, men også gennem hele voksenlivet. Fødselsdepression og voksne hippocampus neurogenese provenu på samme måde involverer mange lighedspunkter. Definition de regulatoriske mekanismer disse faktorer vil være meget nyttigt at forstå neurodegenerative sygdomme, hvilket igen vil føre til nye behandlingsformer og forebyggende foranstaltninger. For at få disse oplysninger en kræver et system til at manipulere enkelte celler og observere dem i deres oprindelige miljø som demonstreret ved ex utero elektroporation efterfulgt af organotypisk skive kultur.

Ex utero elektroporation blev først anvendt med succes i at studere cortex udvikling ^11,16. Til vores viden undersøge rolle Bcl11b i hippocampus udvikling er den første beskrivelse ex utero elektroporation af DNA i gyrus dentatus væv ^8. Vi baserede vores protokol om de metoder, der er offentliggjort af Polleux gruppen studere cortex udvikling ^11,12. For at kunne anvende denne metode til at studere gyrus dentatus størrelse og position af elektroderne skulle justeres. Lægger negative elektrode på cortex nær injektionsstedet og den positive elektrode på den modsatte side under øret ændres polariteten af ​​elektroporering og det lykkedes at indføre DNA i celler i gyrus dentatus. Placering af elektroderne korrekt og anvende en strøm på 0,06-0,08 mA viste sig at være meget afgørende skridt for at opnå tilfredsstillende elektroporation resultater. For at opnå den mest hensigtsmæssige strøm afhænger hovedsagelig af den korrekte placering af elektroderne som beskrevet ovenfor. Yderligere kritiske trin i protokollen er indsprøjtning af materiale ind i ventriklen samt håndtering af skiverne efter vibratome sektionering. Den hjernevæv er ikke fast under hele proceduren ogderfor vævet er meget blød og let destroyable ved overførsel fra vibratome på membranen til dyrkning. Sektioner også skal håndteres med stor forsigtighed ved start af immunfarvning. Med disse ændringer og overvejelser manipulationer af enkelte celler i den tandede gyrus blev positivt resultat besvare spørgsmål vedrørende Bcl11b regulering af tidlig hippocampus udvikling (figur 2 og 3, og dette tal er blevet ændret fra ^8).

Som nævnt ovenfor manipulere enkelte celler og observere deres skæbne er den største fordel ved ex utero elektroporation. En væsentlig ulempe ved ex utero fremgangsmåde i sammenligning med in utero elektroporation er begrænset tid til at holde skiverne i kultur. Det er også muligt, at ex utero dyrkningsbetingelser kan forårsage en forsinkelse i udviklingen. I vores forsøg hidtil var vi i stand til at holde skiverne i kultur up til 18 dage, hvilket svarer til en alder af P14. Dyrkning af organotypiske skiver ud over denne tid føre til nedbrydning af vævet. En yderligere ulempe ved ex utero tilgang er det begrænsede antal af embryoer, der kan elektroporeret pr mor. I modsætning til i utero elektroporation, hvor op til 8 embryoner kan behandles dette antal er begrænset til 4 embryoner i ex utero tilgang. Dissektion af embryonerne, elektroporation, vibratome sektionering og overførsel af skiverne i dyrkningsbetingelser skal udføres på kort tid at sikre en vellykket skive kulturer.

Fordi de store begivenheder i gyrus dentatus udvikling opstår mellem P14 og P30, det ville være nødvendigt at holde organotypiske skiver i kultur i længere perioder. I et første forsøg på at udvide dyrkningstiden elektroporeringer blev udført ved E 18.5 tilpasning af betingelserne tilsvarende (figur 4; se protokol). Elektroporere på ther tidspunkt tillader at holde hjernen sektioner i kultur op til P17 eller 18. Desuden hippocampusformationen er videreudviklet på E 18,5 sammenlignet med E 15,5, fx er hippocampus strukturer, der allerede er dannet, og mere let genkendelig. I fremtiden vil vi gerne udføre ex utero elektroporation ved selv senere tidspunkter, fx P0 til P4 for at undersøge ændringer under tandet gyrus udvikling frem til P30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26