腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

癌は、経時的な病理学的突然変異、欠失、および染色体ゲインの蓄積によって特徴付けプログレッシブ疾患である。これらの遺伝的異常は、低酸素症応答を強調して細胞骨格の細胞周期、細胞死、エネルギー代謝および組立に至るまで多数の細胞プロセスに影響を与えることができる。したがって、腫瘍形成は、生物学的プロセスのスペクトルにわたって複数の遺伝子異常の集団行動を反映している。全ゲノムシーケンシング、exomeシーケンシング、目標とシーケンシング、深いシーケンシングおよびゲノムワイド関連解析を含む最近の統合的なゲノム研究の努力は、腫瘍^1-4の本質的にすべてのタイプの小説遺伝子変異の数が増えを同定した。多くの場合、遺伝的病変は、疾患の病因の協力を示唆し、非ランダム様式^5-8で一緒に起こる。 Fを生じた異常に発現する遺伝子の大規模な配列の発癌性の役割を解剖ロムこれらのゲノムの病変は、新たな治療戦略を考案すると、これらの薬剤に対する腫瘍細胞の応答を理解する必要があるが、これは困難な作業であることが判明している、 でハイスループット機能ゲノム解析を行うための非常に強固な動物モデル系を必要とする生体内 。

哺乳動物、特にげっ歯類は、癌生物学で好まモデルですが、ゼブラフィッシュは、かなりの注目を集め始めている。硬骨魚ゼブラフィッシュ（ ダリオフィッシュ ） は、1960年代から開発調査のためのモデル生物として使用されており、最初の1982年^9-11に腫瘍病因の研究に適用した。メンテナンス、小さなボディサイズ、および高い繁殖力やすさは、ゼブラフィッシュの大規模フォワード遺伝子スクリーニングのための堅牢なモデルは、異常なおよび病理学的表現型^10を付与する変異を同定することを可能にする。ゼブラフィッシュの胚の光透過性のように、この癌モデルの普及を支えるもう一つの重要な特徴であるそれは、リアルタイム⁹にげっ歯類¹²が比較的困難であるアプリケーションを、腫瘍の発達を見つけるために実施されるin vivoイメージングを可能にする。ゼブラフィッシュリファレンスゲノム（Zv9）の最近の比較ゲノム解析は、71％で82％が男性でのオンラインメンデル遺伝（OMIM）データベース¹³における疾患関連遺伝子と相関しているのヒトオルソログを有するとともに、26206タンパク質をコードする遺伝子を明らかにし^{、 14。}したがって、ゼブラフィッシュは、神経芽細胞腫⁸を含むヒトの癌、多様なタイプの、T細胞急性リンパ芽球性白血病^{（T-ALL）15,16、17,18}黒色腫、ユーイング肉腫^19、横紋筋肉腫^20,21、膵臓癌をモデル化するために使用されている^22、肝細胞癌²³および骨髄性悪性疾患^24,25を 、そして異種移植研究^11,26用癌モデルとして選択されている。

安定したトランスジェニックゼブラフィッシュにおけるアプローチは、一般的に、機能獲得正常な発生または疾患の病因^27,28における遺伝子の影響を研究するために使用される。このようなモデル（ 図1A）を開発するためには、一細胞の野生型胚に組織特異的プロモーターにより駆動される目的の遺伝子を含むDNA構築物を注入する。注入された胚は性的に成熟する際に3〜4ヶ月の注射後、それらは創設者の魚としてそれらをライセンス供与し、それらの生殖細胞、構​​築物のDNAの組込みを示すものをスクリーニングするために、野生型の魚と外部交配されている。そのようなコピー数および導入遺伝子の組み込み部位、などの多くの要因が、安定したトランスジェニック系統における導入遺伝子の発現に影響を​​与える。したがって、トランスジェニック腫瘍モデルを開発するために、単一の癌遺伝子を過剰発現する複数の安定したトランスジェニック系統を最初に生成し、腫瘍誘発につながるかもしれないレベルで導入遺伝子を発現する線についてスクリーニングされなければならない。しかし、候補oの過剰発現ncogene生殖細胞に対して毒性であり、直接導入遺伝子^29を過剰発現させることによって、安定したトランスジェニック系統を生成することは困難である。したがって、このアプローチは、適切な癌モデルを生成するために失敗のリスクが高いと、時間がかかること。

ここで、我々は、in vivoでの機能的ゲノム研究のための伝統的な安定した形質転換を介して独自の利点を提供するモザイク一過性遺伝子導入（ 図1B）に基づいて、別の戦略を示している。このアプローチでは、1つ以上の導入遺伝子構築物は、トランスジェニックまたは野生型の胚の1細胞期に注入される。導入遺伝子を含有する注入されたDNA構築物は、個々の魚³⁰内の複数の細胞集団内の混合遺伝子型をもたらし、その後、モザイク状にランダムに一次注入した魚に統合である。また、1細胞胚における複数のDNA構築物の同時注入は、TRAに1を許可する、ランダムな部位での同じ細胞に統合を共同につながる導入遺伝子の発現で細胞をCEとモザイク動物³¹における疾患の病因の間に異なる遺伝子の相互作用を探る。原理の証明として、我々は一過性に、野生型魚とMYCN過剰発現するトランスジェニック魚のドーパミンベータヒドロキシラーゼ（DのβH）プロモーターの制御下に末梢交感神経系（PSNS）にmCherryをレポーター遺伝子と突然変異的に活性化ALKを（F1174L）過剰発現さ。受容体チロシンキナーゼをコードするALK、高リスク神経芽^5-7,32,33において最も頻繁に変異している遺伝子である。ALK（F1174L）は 、活性化変異を最も頻繁に強力な体細胞の一つとして、で過剰表現されMYCN-高リスク神経芽腫患者を増幅し、安定したトランスジェニックマウスおよびトランスジェニックゼブラフィッシュモデル^8,34,35の両方で神経芽細胞腫腫瘍形成を加速するMYCNの過剰発現と相乗作用。モザイクによって、MYCN遺伝子導入魚におけるmCherryを持つALK（F1174L）の一過性の過剰発現は、私たちはモザイク遺伝子導入戦略が急速にかつ効率的に使用することができることを示唆し、ALK（F1174L）とMYCNの両方を過剰発現する安定したトランスジェニック魚で観察された腫瘍の発症の加速を再現したin vivoでの腫瘍の開始の複数の癌遺伝子の相対的な貢献を評価する。

Protocol

注：すべてのゼブラフィッシュの研究や動物の維持管理は、メイヨークリニック研究所IACUC承認されたプロトコル＃A41213と一致して行われた。 遺伝子導入のための1。DNA構築 DNAテンプレートとして（BACPACリソースセンター（BPRC）から）CH211-270H11 BACクローンを用いて5.2 kbのドーパミンβヒドロキシラーゼさ（dβH）プロモーター領域8を増幅する。 2分?…

Representative Results

変異により活性化したALKのF1174Lまたは野生型ALKの過剰発現が神経芽誘導にMYCNと共同作業できるかどうかを調べるために、我々はMYCNを過剰発現するトランスジェニック魚のPSNSでのDβHプロモーターの制御下で活性化されたヒトALKまたは野生型ヒトALKのいずれかを過剰発現さ。 ALKF1174LまたはDβH – -以下の構築物、DβHのどちらか<e…

Discussion

この代表的な研究では、これらの遺伝子が著しく化合物、安定したトランスジェニック魚の共発現における当社の以前の知見と一致、神経芽細胞腫の発症を加速するために協力することを示すためにトランスジェニック魚を発現性MYCNでmCherryをレポーター遺伝子で活性化ALKの一過性同時注入と同時発現を使用両方のALKとMYCN ^8を活性化した。このモザイ…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY