Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Cancros são doenças progressivas marcados pela acumulação de mutações patológicas, exclusões e ganhos de cromossomos ao longo do tempo. Estas anormalidades genéticas pode afectar vários processos celulares que variam do ciclo celular, morte celular, no metabolismo energético e montagem do citoesqueleto de salientar as respostas, tais como a hipoxia. Assim, tumorigenesis reflete as ações coletivas de várias aberrações genéticas em toda uma gama de processos biológicos. Os recentes esforços de integração genômicas de investigação, incluindo a sequenciação do genoma inteiro, exome seqüenciamento, sequenciamento alvejado, o seqüenciamento de profundidade e estudos de associação do genoma, identificaram um número cada vez maior de alterações genéticas novos em praticamente todos os tipos de tumores ^1-4. Em muitos casos, as lesões genéticas ocorrem em conjunto de uma maneira não aleatória ^5-8, sugerindo a sua cooperação na patogénese da doença. Dissecando os papéis oncogênicos do grande variedade de genes expressos de maneira aberrante resultantes from essas lesões genômicas é necessário elaborar novas estratégias terapêuticas e para entender as respostas das células tumorais para esses agentes, mas isso provou ser uma tarefa difícil, que exige muito robustos sistemas de modelos animais para a realização de análise genômica funcional de alto rendimento em vivo.

Apesar de mamíferos, especialmente roedores, são modelos favorecidas em biologia do câncer, o peixe-zebra começou a atrair atenção considerável. O peixe-zebra teleósteos (Dario rerio) tem sido usada como um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento desde os anos 1960 e foi aplicado em primeiro lugar ao estudo da patogénese do tumor, em 1982, ^9-11. Facilidade de manutenção, tamanho pequeno corpo, e alta fecundidade fazer o peixe-zebra um modelo robusto para telas genéticos para a frente em larga escala para identificar mutações que conferem fenótipos anormais e patológicas ^10. A transparência óptica de embriões de peixes-zebra é outra característica fundamental apoiar uma maior utilização deste modelo de câncer, comoele permite que in vivo de imagens a serem realizadas para localizar o desenvolvimento do tumor em tempo real, ^9, um aplicativo que é relativamente difícil em roedores ^12. Recente análise genômica comparativa do genoma de referência do peixe-zebra (Zv9) revelou 26.206 genes codificadores de proteínas, com 71% tendo ort�ogos humanos, dos quais 82% são correlacionados com genes associados à doença no Online mendeliana Herança em Man (OMIM) do banco de dados ^{13, 14.} Por conseguinte, o peixe-zebra foi usado para modelar diversos tipos de cancros humanos, incluindo neuroblastoma ^8, de células T aguda leucemia linfoblástica (T-ALL), ^{15,16, 17,18} melanoma, sarcoma de Ewing, ^{19, 20,21} rabdomiossarcoma, carcinoma pancreático ^22, carcinoma hepatocelular e ²³ mielóide malignidades ^24,25, e foi selecionado como um modelo de câncer para o xenotransplante estuda ^11,26.

A transgênico estávelabordagem no peixe-zebra é comumente utilizada para estudar o efeito de ganho-de-função de genes no desenvolvimento normal ou patogénese da doença ^27,28. Para desenvolver tal um modelo (Figura 1A), um injecta uma construção de ADN contendo o gene de interesse accionado por um promotor específico de tecido para dentro de uma células de embriões de tipo selvagem. Três a quatro meses após a injeção, quando os embriões injetados atingir a maturidade sexual, eles são outcrossed com o tipo selvagem de peixe para a tela para os que apresentaram integração do DNA construir em sua linha germinativa, o que lhes licencia como fundador peixe. Muitos factores, tais como o número de cópias e sítio de integração do transgene, afectar a expressão do transgene em linhas transgénicas estáveis. Assim, para desenvolver um modelo de tumor transgénico, várias linhas transgénicas estáveis ​​que sobre-expressam um único oncogene tem que ser gerada em primeiro lugar e rastreados para a linha de expressar o transgene a um nível que pode levar à indução de tumores. No entanto, se a sobre-expressão de um candidato oncogene é tóxico para as células germinativas, que é difícil gerar uma linha estável por transgénico que sobre-expressam o transgene directamente ^29. Assim, esta abordagem pode ser demorado, com um elevado risco de falha para gerar um modelo de cancro adequado.

Aqui, ilustramos uma estratégia alternativa com base na transgénese transiente mosaico (Figura 1B) que oferece vantagens únicas sobre a transgénese estável tradicional para estudo genómica funcional in vivo. Nesta abordagem, uma ou mais construções de transgenes são injectados no estádio de uma célula de embriões transgénicos ou de tipo selvagem. As construções de DNA injetado contendo transgenes são então mosaically e aleatoriamente integrado no peixes injetados primário, resultando em genótipos mistos dentro de populações de células em vários peixes individuais ^30. Além disso, a co-injecção de ADN múltiplas construções de embriões unicelulares leva à co-integração na mesma célula em locais aleatórios, permitindo que um trace as células com expressão de transgenes e explorar as interações de diferentes genes durante a patogênese da doença nos animais mosaico ^31. Como prova de princípio, nós transitoriamente superexpressado ALK mutacionalmente ativado (F1174L) com gene repórter mCherry no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob o controle do hidroxilase dopamina beta (d βh) promotor de tipo selvagem e peixes transgênicos com superexpressão MYCN. ALK, que codifica um receptor da tirosina quinase, é o gene mais frequentemente mutado em alto risco neuroblastoma ^5-7,32,33. ALK (F1174L), como uma das mutações somáticas ativadoras mais frequentes e mais potentes, é sobre-representados em MYCN- amplificado pacientes neuroblastoma de alto risco e sinergia com MYCN superexpressão para acelerar neuroblastoma tumorigenesis em ambos os ratinhos transgénicos estáveis ​​e modelos de peixes-zebra transgénicos ^8,34,35. Por mosaicosobreexpressão transiente de ALK (F1174L) com mCherry nos peixes transgénicos MYCN, nós recapitulado a aceleração do aparecimento do tumor observada nos peixes transgénicos que sobre-expressam tanto estável ALK (F1174L) e MYCN, sugerindo que a estratégia de transgénese mosaico pode ser utilizado para rapidamente e eficientemente avaliar as contribuições relativas de vários oncogenes na iniciação do tumor in vivo.

Protocol

NOTA: Todos os estudos de peixe-zebra e manutenção dos animais foram feitas de acordo com a Mayo Clinic Institute IACUC-aprovado protocolo # A41213. 1. As construções de ADN para Transgénese Amplificar uma região do promotor de 5,2 kb da dopamina-beta-hidroxilase (d βh) 8, utilizando o clone de BAC CH211-270H11 (BacPac centro de recursos (BPRC)) como um molde de ADN. Usar um adequado sistema de PCR para a amplificação por PCR de comprimento e precisos …

Representative Results

Para investigar se a sobre-expressão de F1174L ALK mutacionalmente activado ou de tipo selvagem ALK pode colaborar com MYCN na indução de neuroblastoma, que sobre-expressa ou activada humana ou ALK-ALK humano do tipo selvagem sob o controlo do promotor d βh no PSNS de peixes transgénicos que sobre-expressam MYCN. Qualquer uma das seguintes construções, dβh – ALKF1174L ou dβh – ALKWT, foram co-injectado com dβh – …

Discussion

Neste estudo representativo, foi utilizado co-injecção transiente e co-expressão de LFA activado com o gene repórter mCherry em MYCN -expressing peixes transgénicos para mostrar que estes genes cooperar para acelerar significativamente o aparecimento de neuroblastoma, consistente com a nossa verificação anterior no composto estável coexpress� peixes transgénicos tanto ALK e MYCN ⁸ activada. Esta abordagem transgénica mosaico possui várias vantagens …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY