Mozaïek zebravis Transgenese voor Functioneel genomische analyse van de kandidaat-coöperatieve genen in Tumor Pathogenese

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Kankers zijn progressieve ziekten gekenmerkt door de accumulatie van pathologische mutaties, deleties en chromosoom winsten in de tijd. Deze genetische afwijkingen kunnen beïnvloeden meerdere cellulaire processen gaande van de celcyclus, celdood, energetische metabolisme en assemblage van het cytoskelet te antwoorden zoals hypoxie benadrukken. Vandaar het ontstaan ​​van tumoren weerspiegelt de collectieve acties van meerdere genetische afwijkingen over een spectrum van biologische processen. Recente integratieve genomische onderzoeksinspanningen, met inbegrip van whole genome sequencing, exoom sequencing, gerichte sequencing, deep sequencing en genoomwijde associatie studies, hebben een groeiend aantal nieuwe genetische veranderingen die in wezen alle soorten van tumoren ^1-4. In veel gevallen, de genetische laesies samen voorkomen in een niet-willekeurige wijze ^5-8, suggereert hun samenwerking pathogenese. Het ontleden van de oncogene rol van de grote reeks van afwijkend uitgedrukt genen resulteert from deze genomische afwijkingen is het noodzakelijk om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen en om de reacties van tumorcellen om deze middelen te begrijpen, maar dit bleek een hele klus zijn, die zeer robuust diermodel systemen voor het uitvoeren van high-throughput functionele genomische analyse in vivo.

Hoewel zoogdieren, vooral knaagdieren, zijn favoriete modellen in de biologie van kanker, heeft de zebravis begonnen om aandacht te trekken. De teleost zebravis (Dario rerio) is gebruikt als modelorganisme voor de ontwikkeling van onderzoek sinds de jaren 1960 en werd voor het eerst toegepast op de studie van de tumor pathogenese in 1982 ^9-11. Gemak van onderhoud, kleine lichaamsgrootte, en de hoge vruchtbaarheid maken de zebravis een robuust model voor grootschalige forward genetische screens om mutaties die abnormaal en pathologische fenotypes ¹⁰ verlenen identificeren. De optische transparantie van de zebravis embryo's is een ander belangrijk kenmerk ondersteunen ruimer gebruik van deze vorm van kanker model, zoalshet mogelijk in vivo beeldvorming worden uitgevoerd om tumorontwikkeling vinden in realtime ^9, een toepassing die in knaagdieren ¹² relatief moeilijk. Recente vergelijkende genomica analyse van de zebravis referentie-genoom (Zv9) onthulde 26.206 eiwit-coderende genen, met 71% hebben van de menselijke orthologa, waarvan 82% zijn gecorreleerd met ziekte-geassocieerde genen in de Online Mendeliaanse Inheritance in Man (OMIM) ^{database-13, 14.} Bijgevolg heeft de zebravis gebruikt om het model diverse typen menselijke kankers, zoals neuroblastoom ⁸ T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) ^{15,16, 17,18} melanoom, Ewing-sarcoom ^19, rhabdomyosarcoom ^20,21, pancreascarcinoom ^22, hepatocellulair carcinoom ²³ en myeloïde maligniteiten ^24,25, en is geselecteerd als een kanker model voor xenotransplantatie bestudeert ^11,26.

Een stabiele transgeneaanpak zebravis wordt vaak gebruikt om het effect van gain-of-functie van genen in normale ontwikkeling en pathogenese ^27,28 bestuderen. Om zo'n model (Figuur 1A) ontwikkelen een spuit een DNA construct dat het gen van belang aangestuurd door een weefselspecifieke promoter in een cel wildtype embryo. Drie tot vier maanden na injectie, wanneer de geïnjecteerde embryo geslachtsrijp zijn ze outcrossed met wildtype vis te screenen op diegenen die de integratie van het DNA construct in de kiemlijn, die ze als grondlegger vis licenties. Vele factoren, zoals het aantal kopieën en de integratieplaats van het transgen invloed expressie van het transgen in stabiele transgene lijnen. Dus, om een ​​transgeen tumor model te ontwikkelen, verschillende stabiele transgene lijnen overexpressie één oncogen moeten eerst worden gegenereerd en gescreend op de expressie brengt het transgen op een niveau dat kan leiden tot tumor inductie. Indien overexpressie van een kandidaat oncogene is giftig voor kiemcellen, is het moeilijk om een stabiele transgene lijn genereren door direct overexpressie transgen ^29. Daarom kan deze benadering tijdrovend, met een hoog risico van het niet geschikt Cancer genereren.

Hier, illustreren we een alternatieve strategie gebaseerd op mozaïek voorbijgaande transgenese (Figuur 1B) dat unieke voordelen biedt ten opzichte van traditionele stabiele transgenese voor functionele genomische studie in vivo. In deze benadering worden één of meer transgene constructen geïnjecteerd in de één-cel fase van transgene of wildtype embryo. Het geïnjecteerde DNA constructen bevattende transgenen Dan mosaically en willekeurig geïntegreerd in de primaire ingespoten vissen, waardoor gemengde genotypes in verschillende celpopulaties in afzonderlijke vis ^30. Bovendien co-injectie van meerdere DNA-constructen in een cel embryo leidt tot co-integratie in dezelfde cel willekeurig plaatsen, zodat men trace de cellen met expressie van transgenen en de interactie van verschillende genen ontdekken tijdens ziekte pathogenese in het mozaïek dieren ^31. Als bewijs van principe, we tijdelijk tot overexpressie mutationeel geactiveerd ALK (F1174L) met mCherry reportergen in de perifere sympathische zenuwstelsel (PSNS) onder controle van de dopamine beta hydroxylase (d βh) promotor in wildtype en transgene vis vis overexpressie MYCN. ALK, die een receptor tyrosine kinase codeert, is de meest frequent gemuteerde gen hoog risico neuroblastoom ^5-7,32,33. ALK (F1174L), als één van de meest voorkomende en krachtige somatische activerende mutaties, oververtegenwoordigd in MYCN- versterkt neuroblastoom patiënten met een hoog risico en synergie met MYCN overexpressie aan neuroblastoom het ontstaan ​​van tumoren te versnellen, zowel in stabiele transgene muizen en transgene zebravismodellen ^8,34,35. Door het mozaïekvoorbijgaande overexpressie van ALK (F1174L) met mCherry in de MYCN transgene vis, we recapituleerde de versnelling van de tumor ontstaan ​​waargenomen in de stabiele transgene vis overexpressie zowel ALK (F1174L) en MYCN, wat suggereert dat het mozaïek transgenese strategie om snel en efficiënt kan worden gebruikt De relatieve bijdragen van meerdere oncogenen in tumorinitiatie in vivo.

Protocol

OPMERKING: Alle zebravis studies en het onderhoud van de dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Mayo Clinic Instituut IACUC-goedgekeurde protocol # A41213. 1. DNA-constructen voor Transgenese Versterken van een 5.2-kb dopamine-beta hydroxylase (d βh) promotor gebied 8 met behulp van de CH211-270H11 BAC-kloon (van BacPac middelen centrum (BPRC)) als een DNA-template. Gebruik een PCR systeem geschikt voor lange en nauwkeurige PCR amplificatie van lan…

Representative Results

Om te onderzoeken of overexpressie van mutationeel geactiveerd ALK F1174L of wildtype ALK kan samenwerken met MYCN in neuroblastoom inductie, we ofwel geactiveerde humane ALK of wild type humaan ALK overexpressie gebracht onder controle van de d βh promoter in de PSNS van transgene vis overexpressie MYCN. Een van de volgende constructies, dβh – ALKF1174L of dβh – ALKWT, werden gecoïnjecteerd met dβh – mCh…

Discussion

In deze representatieve studie, gebruikten we transiënte co-injectie en co-expressie van geactiveerde ALK de mCherry reportergen in MYCN -expressie transgene vis te tonen dat deze genen samenwerken om het begin van neuroblastoom, in overeenstemming met onze eerdere bevindingen in verbinding stabiele transgene vis co-expressie aanzienlijk versnellen zowel geactiveerd ALK en MYCN ^8. Dit mozaïek transgene aanpak bezit een aantal verschillende voordelen ten opzichte …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY