Summary

Mosaic Zebrafish genmodifiering för Funktionell Genomic analys av kandidat Kooperativa gener i tumör Patogenes

Published: March 31, 2015
doi:

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Cancer är progressiva sjukdomar präglas av ansamling av patologiska mutationer, deletioner och kromosomvinster över tid. Dessa genetiska avvikelser kan påverka flera cellulära processer som sträcker sig från cellcykeln, celldöd, energisk metabolism och montering av cytoskelettet betona svar såsom hypoxi. Därför speglar tumorigenes de gemensamma åtgärder av flera genetiska avvikelser över ett spektrum av biologiska processer. Senaste integrativa iska forskningsinsatser, inklusive hela genom sekvensering, Exoma sekvense, riktad sekvensering, djupa sekvensering och genomtäckande associationsstudier, har identifierat ett växande antal nya genetiska förändringar i stort sett samtliga typer av tumörer 1-4. I många fall, de genetiska skador förekommer tillsammans i ett icke slumpvis sätt 5-8, vilket tyder sitt samarbete i sjukdoms patogenes. Dissekera onkogena roller stort utbud av abnormt uttryckta gener resulte from dessa iska lesioner är nödvändig för att utarbeta nya behandlingsstrategier och förstå svaren från tumörceller till dessa medel, men det har visat sig vara en svår uppgift, som kräver mycket robusta djurmodellsystem för genomförandet av hög genomströmning funktionell genomisk analys vivo.

Även däggdjur, särskilt gnagare, är gynnade modeller i cancerbiologi, har zebrafisk börjat locka stor uppmärksamhet. Den teleost zebrafisk (Dario rerio) har använts som modellorganism för utvecklingsstudie sedan 1960-talet och var först appliceras på studier av tumör patogenes 1982 9-11. Enkelt underhåll, mindre kroppsstorlek, och hög fruktsamhet gör zebrafisk en robust modell för storskaliga framåt genetiska skärmar för att identifiera mutationer som ger onormala och patologiska fenotyper 10. Den optiska insyn i zebrafisk embryon är en annan viktig funktion som stöder en bredare användning av denna cancer modell, somdet tillåter in vivo imaging att genomföras för att lokalisera tumörutveckling i realtid 9, ett program som är relativt svårt i gnagare 12. Senaste komparativ genomik analys av zebrafisk referens genomet (Zv9) avslöjade 26.206 proteinkodande gener, med 71% som har mänskliga ortologer, varav 82% är korrelerade med sjukdomsassocierade gener i Online Mendels ärftlighetslagar i Man (OMIM) databas 13, 14. Följaktligen har zebrafisk använts för att modellera olika typer av humana cancerformer, inklusive neuroblastom 8, T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewings sarkom 19, rhabdomyosarkom 20,21, pankreaskarcinom 22, hepatocellulär cancer 23 och myeloida maligniteter 24,25, och har valts ut som en cancermodell för xenotransplantation studerar 11,26.

En stabil transgentillvägagångssätt i zebrafisk används ofta för att studera effekten av förstärkningen-of-funktionen hos gener i normal utveckling eller sjukdom patogenes 27,28. Att utveckla en sådan modell (Figur 1A), injicerar en en DNA-konstruktion som innehåller genen av intresse drivs av en vävnadsspecifik promotor i en-cell av vildtyp embryon. Tre till fyra månader efter injektionen, när de injicerade embryona blir könsmogna, de utparade med vildtyp fisk att screena för de som visar integration av DNA-konstruktionen i deras könsceller, som licensierar dem som grundare fisk. Många faktorer, såsom kopietalet och integrationsstället i transgenen, påverkar expression av transgenen i stabila transgena linjerna. Således, för att utveckla en transgen tumörmodell, multipla stabila transgena linjer som överuttrycker ett enskilt onkogen måste genereras först och screenas för den linje som uttrycker transgenen på en nivå som skulle kunna leda till tumörinduktion. Men om överuttryck av en kandidat oncogene är toxisk för bakterieceller, är det svårt att generera en stabil transgen linje genom att direkt överuttrycker transgen 29. Därför kan denna metod vara tidskrävande, med en hög risk för misslyckande för att generera en lämplig cancermodell.

Här visar vi en alternativ strategi baserad på mosaik gående genmodifiering (Figur 1B) som ger unika fördelar jämfört med traditionella stabil genmodifiering för funktionell genomisk studie in vivo. I detta tillvägagångssätt, är en eller flera transgenstrukturerna injiceras i en-cells stadiet av transgena eller vildtyp embryon. De injicerade DNA-konstruktioner som innehåller transgener är sedan mosaically och slumpmässigt integrerade i den primära injicerade fisk, vilket resulterar i blandade genotyper inom flera cellpopulationer i individuella fiskar 30. Dessutom saminjektion av multipel DNA-konstruktioner i embryon en cell leder till co-integration i samma cell vid slumpmässiga platser, tillåter en att trace cellerna med uttryck av transgener och utforska samspelet mellan olika gener under sjukdoms patogenes i mosaikdjur 31. Som bevis på princip, vi transient överuttryckt mutation aktiverade ALK (F1174L) med mCherry reportergen i det perifera sympatiska nervsystemet (PSNS) under kontroll av dopamin beta hydroxylas (d βh) promotor i vildtyp fisk och transgen fisk överuttrycker MYCN. ALK, som kodar en receptor tyrosinkinas, är den vanligaste muterade genen i högrisk neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), som en av de mest frekventa och potenta somatiska aktiverande mutationer, är överrepresenterade i MYCN- förstärkta neuroblastompatienter högrisk och synergistiskt med MYCN uttryck att accelerera neuroblastom tumorigenes både stabila transgena möss och transgena zebrafisk modeller 8,34,35. Genom mosaikgående överuttryck av ALK (F1174L) med mCherry i MYCN transgen fisk, rekapituleras vi accelerationen av tumördebut observerats i stallet transgen fisk överuttrycker både ALK (F1174L) och MYCN, vilket tyder på att den mosaik genmodifiering strategin kan användas för att snabbt och effektivt bedöma de relativa bidragen från flera onkogener i tumör initiering in vivo.

Protocol

NOTERA: Alla zebrafisk studier och underhåll av djuren gjordes i överensstämmelse med Mayo Clinic Institute lACUC-godkända protokoll # A41213. 1. DNA-konstrukt för genmodifiering Förstärk ett 5,2-kb dopamin beta hydroxylas (d βh) promotorregionen 8 använder CH211-270H11 BAC-klon (från BacPac resurser centrum (BPRC)) som en DNA-mall. Använd ett PCR-system är lämpligt för lång och noggrann PCR-amplifiering av långa DNA-mallar och följande cykelpr…

Representative Results

För att undersöka huruvida överuttryck av mutationellt aktiverad ALK F1174L eller vildtyp ALK kunde samarbeta med MYCN vid neuroblastom induktion, överuttryckt vi antingen aktiverad human ALK eller vildtyp human ALK under kontroll av d βh promotorn i PSNS av transgen fisk uttrycker MYCN. Endera av följande konstruktioner, dβh – ALKF1174L eller dβh – ALKWT, ades saminjicerades med dβh – mCherry ti…

Discussion

I denna representativa studien använde vi gående saminjektion och samuttryck av aktiverade ALK med mCherry reportergen i MYCN uttryckande transgen fisk att visa att dessa gener samverkar för att markant påskynda uppkomsten av neuroblastom, i linje med vår tidigare fynd i förening stabil transgen fisk samuttrycker både aktiverad ALK och MYCN 8. Denna mosaik transgen tillvägagångssätt besitter flera distinkta fördelar jämfört med den konventionella metod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex’s Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children’s Cancer Foundation.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

References

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing’s sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

Play Video

Cite This Article
Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

View Video