Mosaic Zebrafish genmodifiering för Funktionell Genomic analys av kandidat Kooperativa gener i tumör Patogenes

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Cancer är progressiva sjukdomar präglas av ansamling av patologiska mutationer, deletioner och kromosomvinster över tid. Dessa genetiska avvikelser kan påverka flera cellulära processer som sträcker sig från cellcykeln, celldöd, energisk metabolism och montering av cytoskelettet betona svar såsom hypoxi. Därför speglar tumorigenes de gemensamma åtgärder av flera genetiska avvikelser över ett spektrum av biologiska processer. Senaste integrativa iska forskningsinsatser, inklusive hela genom sekvensering, Exoma sekvense, riktad sekvensering, djupa sekvensering och genomtäckande associationsstudier, har identifierat ett växande antal nya genetiska förändringar i stort sett samtliga typer av tumörer ^1-4. I många fall, de genetiska skador förekommer tillsammans i ett icke slumpvis sätt ^5-8, vilket tyder sitt samarbete i sjukdoms patogenes. Dissekera onkogena roller stort utbud av abnormt uttryckta gener resulte from dessa iska lesioner är nödvändig för att utarbeta nya behandlingsstrategier och förstå svaren från tumörceller till dessa medel, men det har visat sig vara en svår uppgift, som kräver mycket robusta djurmodellsystem för genomförandet av hög genomströmning funktionell genomisk analys vivo.

Även däggdjur, särskilt gnagare, är gynnade modeller i cancerbiologi, har zebrafisk börjat locka stor uppmärksamhet. Den teleost zebrafisk (Dario rerio) har använts som modellorganism för utvecklingsstudie sedan 1960-talet och var först appliceras på studier av tumör patogenes 1982 ^9-11. Enkelt underhåll, mindre kroppsstorlek, och hög fruktsamhet gör zebrafisk en robust modell för storskaliga framåt genetiska skärmar för att identifiera mutationer som ger onormala och patologiska fenotyper ^10. Den optiska insyn i zebrafisk embryon är en annan viktig funktion som stöder en bredare användning av denna cancer modell, somdet tillåter in vivo imaging att genomföras för att lokalisera tumörutveckling i realtid ^9, ett program som är relativt svårt i gnagare ^12. Senaste komparativ genomik analys av zebrafisk referens genomet (Zv9) avslöjade 26.206 proteinkodande gener, med 71% som har mänskliga ortologer, varav 82% är korrelerade med sjukdomsassocierade gener i Online Mendels ärftlighetslagar i Man (OMIM) databas ^{13, 14.} Följaktligen har zebrafisk använts för att modellera olika typer av humana cancerformer, inklusive neuroblastom ^8, T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) ^15,16, melanom ^17,18, Ewings sarkom ^19, rhabdomyosarkom ^20,21, pankreaskarcinom ^22, hepatocellulär cancer ²³ och myeloida maligniteter ^24,25, och har valts ut som en cancermodell för xenotransplantation studerar ^11,26.

En stabil transgentillvägagångssätt i zebrafisk används ofta för att studera effekten av förstärkningen-of-funktionen hos gener i normal utveckling eller sjukdom patogenes ^27,28. Att utveckla en sådan modell (Figur 1A), injicerar en en DNA-konstruktion som innehåller genen av intresse drivs av en vävnadsspecifik promotor i en-cell av vildtyp embryon. Tre till fyra månader efter injektionen, när de injicerade embryona blir könsmogna, de utparade med vildtyp fisk att screena för de som visar integration av DNA-konstruktionen i deras könsceller, som licensierar dem som grundare fisk. Många faktorer, såsom kopietalet och integrationsstället i transgenen, påverkar expression av transgenen i stabila transgena linjerna. Således, för att utveckla en transgen tumörmodell, multipla stabila transgena linjer som överuttrycker ett enskilt onkogen måste genereras först och screenas för den linje som uttrycker transgenen på en nivå som skulle kunna leda till tumörinduktion. Men om överuttryck av en kandidat oncogene är toxisk för bakterieceller, är det svårt att generera en stabil transgen linje genom att direkt överuttrycker transgen ^29. Därför kan denna metod vara tidskrävande, med en hög risk för misslyckande för att generera en lämplig cancermodell.

Här visar vi en alternativ strategi baserad på mosaik gående genmodifiering (Figur 1B) som ger unika fördelar jämfört med traditionella stabil genmodifiering för funktionell genomisk studie in vivo. I detta tillvägagångssätt, är en eller flera transgenstrukturerna injiceras i en-cells stadiet av transgena eller vildtyp embryon. De injicerade DNA-konstruktioner som innehåller transgener är sedan mosaically och slumpmässigt integrerade i den primära injicerade fisk, vilket resulterar i blandade genotyper inom flera cellpopulationer i individuella fiskar ^30. Dessutom saminjektion av multipel DNA-konstruktioner i embryon en cell leder till co-integration i samma cell vid slumpmässiga platser, tillåter en att trace cellerna med uttryck av transgener och utforska samspelet mellan olika gener under sjukdoms patogenes i mosaikdjur ^31. Som bevis på princip, vi transient överuttryckt mutation aktiverade ALK (F1174L) med mCherry reportergen i det perifera sympatiska nervsystemet (PSNS) under kontroll av dopamin beta hydroxylas (d βh) promotor i vildtyp fisk och transgen fisk överuttrycker MYCN. ALK, som kodar en receptor tyrosinkinas, är den vanligaste muterade genen i högrisk neuroblastom ^5-7,32,33. ALK (F1174L), som en av de mest frekventa och potenta somatiska aktiverande mutationer, är överrepresenterade i MYCN- förstärkta neuroblastompatienter högrisk och synergistiskt med MYCN uttryck att accelerera neuroblastom tumorigenes både stabila transgena möss och transgena zebrafisk modeller ^8,34,35. Genom mosaikgående överuttryck av ALK (F1174L) med mCherry i MYCN transgen fisk, rekapituleras vi accelerationen av tumördebut observerats i stallet transgen fisk överuttrycker både ALK (F1174L) och MYCN, vilket tyder på att den mosaik genmodifiering strategin kan användas för att snabbt och effektivt bedöma de relativa bidragen från flera onkogener i tumör initiering in vivo.

Protocol

NOTERA: Alla zebrafisk studier och underhåll av djuren gjordes i överensstämmelse med Mayo Clinic Institute lACUC-godkända protokoll # A41213. 1. DNA-konstrukt för genmodifiering Förstärk ett 5,2-kb dopamin beta hydroxylas (d βh) promotorregionen 8 använder CH211-270H11 BAC-klon (från BacPac resurser centrum (BPRC)) som en DNA-mall. Använd ett PCR-system är lämpligt för lång och noggrann PCR-amplifiering av långa DNA-mallar och följande cykelpr…

Representative Results

För att undersöka huruvida överuttryck av mutationellt aktiverad ALK F1174L eller vildtyp ALK kunde samarbeta med MYCN vid neuroblastom induktion, överuttryckt vi antingen aktiverad human ALK eller vildtyp human ALK under kontroll av d βh promotorn i PSNS av transgen fisk uttrycker MYCN. Endera av följande konstruktioner, dβh – ALKF1174L eller dβh – ALKWT, ades saminjicerades med dβh – mCherry ti…

Discussion

I denna representativa studien använde vi gående saminjektion och samuttryck av aktiverade ALK med mCherry reportergen i MYCN uttryckande transgen fisk att visa att dessa gener samverkar för att markant påskynda uppkomsten av neuroblastom, i linje med vår tidigare fynd i förening stabil transgen fisk samuttrycker både aktiverad ALK och MYCN ^8. Denna mosaik transgen tillvägagångssätt besitter flera distinkta fördelar jämfört med den konventionella metod…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY