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Developmental Biology

ट्यूमर रोगजनन में उम्मीदवार सहकारी जीन की कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए मोज़ेक Zebrafish transgenesis

Published: March 31, 2015
doi:
10.3791/52567
, , , ,
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics,Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,Mayo Clinic

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

कैंसर समय के साथ वैकृत म्यूटेशन, विलोपन और गुणसूत्र लाभ के संचय के द्वारा चिह्नित प्रगतिशील रोगों हैं। ये आनुवंशिक असामान्यताएं ऐसे हाइपोक्सिया के रूप में प्रतिक्रियाओं तनाव की cytoskeleton की कोशिका चक्र, कोशिका मृत्यु, ऊर्जावान चयापचय और विधानसभा से लेकर कई सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, tumorigenesis जैविक प्रक्रियाओं की एक स्पेक्ट्रम भर में कई आनुवंशिक aberrations के सामूहिक कार्यों को दर्शाता है। पूरे जीनोम अनुक्रमण, exome अनुक्रमण, लक्षित अनुक्रमण, गहरी अनुक्रमण और जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन सहित हाल एकीकृत जीनोमिक अनुसंधान के प्रयासों, ट्यूमर 1-4 की अनिवार्य रूप से सभी प्रकार के उपन्यास आनुवंशिक परिवर्तन की बढ़ती संख्या की पहचान की है। कई उदाहरणों में, आनुवंशिक घावों रोग रोगजनन में उनके सहयोग, सुझाव एक nonrandom ढंग 5-8 में एक साथ होते हैं। एफ जिसके परिणामस्वरूप aberrantly व्यक्त जीनों के बड़े सरणी के oncogenic भूमिकाओं विदारकइन जीनोमिक घावों ROM नयी चिकित्सकीय रणनीति वसीयत करने के लिए और इन एजेंटों को ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए आवश्यक है, लेकिन इस उच्च throughput कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के संचालन में के लिए बहुत मजबूत पशु मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है, एक चुनौतीपूर्ण काम साबित हुई है विवो।

स्तनधारी, विशेष रूप से कृन्तकों, कैंसर जीव विज्ञान में इष्ट मॉडल हैं हालांकि, zebrafish काफी ध्यान आकर्षित करने के लिए शुरू हो गया है। teleost zebrafish (दारियो rerio) 1960 के दशक के बाद से विकास अध्ययन के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है और पहली बार 1982 9-11 में ट्यूमर रोगजनन के अध्ययन के लिए लागू किया गया था। रखरखाव, छोटे शरीर के आकार, और उच्च उपजाऊपन की आसानी zebrafish असामान्य और रोग phenotypes के 10 प्रदान कि म्यूटेशन की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक मजबूत मॉडल बनाते हैं। zebrafish भ्रूण के ऑप्टिकल पारदर्शिता के रूप में, इस कैंसर मॉडल के व्यापक उपयोग का समर्थन एक और महत्वपूर्ण विशेषता हैयह वास्तविक समय 9 में कृन्तकों 12 में अपेक्षाकृत कठिन है कि एक आवेदन ट्यूमर के विकास का पता लगाने के लिए ही किया जा सकता vivo इमेजिंग में अनुमति देता है। Zebrafish संदर्भ जीनोम (Zv9) की हाल ही में तुलनात्मक जीनोमिक्स विश्लेषण, 71% 82% मैन (OMIM) डाटाबेस 13 में ऑनलाइन मेंडेलियाई विरासत में रोग से जुड़े जीन के साथ सहसंबद्ध होते हैं, जिनमें से मानव orthologues, होने के साथ 26,206 प्रोटीन कोडिंग जीन का पता चला 14। नतीजतन, zebrafish neuroblastoma 8 सहित मानव कैंसर के विविध प्रकार के मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है, टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (टी सभी) 15,16, मेलेनोमा 17,18, इविंग सारकोमा 19, rhabdomyosarcoma 20,21, अग्नाशय कार्सिनोमा 22 हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा 23 और माइलॉयड 24,25 malignancies, और xenotransplantation के लिए एक कैंसर मॉडल 11,26 अध्ययन के रूप में चयनित किया गया है।

एक स्थिर ट्रांसजेनिकzebrafish में दृष्टिकोण आमतौर पर लाभ के समारोह सामान्य विकास या रोग रोगजनन 27,28 में जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तरह के एक मॉडल (चित्रा 1 ए) को विकसित करने के लिए, एक एक सेल जंगली प्रकार भ्रूण में एक ऊतक विशेष प्रमोटर द्वारा संचालित ब्याज की जीन से युक्त एक डीएनए का निर्माण injects। इंजेक्शन भ्रूण यौन परिपक्वता तक पहुँचने जब तीन चार महीने के इंजेक्शन के बाद, वे संस्थापक मछली के रूप में उन्हें लाइसेंस जो उनके germline में निर्माण डीएनए के एकीकरण दिखा लोगों के लिए स्क्रीन करने के लिए जंगली प्रकार मछली के साथ outcrossed कर रहे हैं। ऐसे प्रतिलिपि संख्या और transgene की एकीकरण साइट के रूप में कई कारकों, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों में transgene की अभिव्यक्ति प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, एक ट्रांसजेनिक ट्यूमर मॉडल विकसित करने के लिए, एक एकल ओंकोजीन overexpressing कई स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों पहले उत्पन्न होता है और ट्यूमर प्रेरण का कारण हो सकता है कि एक स्तर पर transgene व्यक्त लाइन के लिए जांच की जानी है। हालांकि, अगर एक उम्मीदवार ओ की overexpressionncogene रोगाणु कोशिकाओं को विषाक्त है, यह सीधे transgene 29 overexpressing द्वारा एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए मुश्किल है। इसलिए, इस दृष्टिकोण एक उपयुक्त कैंसर मॉडल उत्पन्न करने के लिए विफलता का एक उच्च जोखिम के साथ, समय लेने वाली हो सकती है।

यहाँ, हम vivo में कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए पारंपरिक स्थिर transgenesis से अधिक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है कि मोज़ेक क्षणिक transgenesis (चित्रा 1 बी) के आधार पर एक वैकल्पिक रणनीति वर्णन। इस दृष्टिकोण में, एक या एक से अधिक transgene निर्माणों ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार भ्रूण की एक सेल चरण में इंजेक्ट किया जाता है। ट्रांसजीन युक्त इंजेक्शन के डीएनए निर्माणों व्यक्ति मछली 30 में कई सेल आबादी के भीतर मिश्रित जीनोटाइप में जिसके परिणामस्वरूप, तो mosaically और बेतरतीब ढंग से प्राथमिक इंजेक्ट मछली में एकीकृत कर रहे हैं। इसके अलावा, कई डीएनए के coinjection एक सेल भ्रूण में constructs सह-एकीकरण के लिए यादृच्छिक स्थलों पर एक ही सेल में, टीआरए के लिए एक की अनुमति के लिए सुरागtransgenes की अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं सीई और मोज़ेक जानवरों 31 में रोग रोगजनन के दौरान विभिन्न जीनों की बातचीत का पता लगाएं। सिद्धांत के सबूत के रूप में, हम क्षणिक जंगली प्रकार मछली और MYCN overexpressing ट्रांसजेनिक मछली में डोपामाइन बीटा hydroxylase (डी βh) प्रमोटर के नियंत्रण के तहत परिधीय सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (PSNS) में mCherry रिपोर्टर जीन के साथ mutationally सक्रिय ALK (F1174L) overexpressed। एक रिसेप्टर tyrosine kinase encodes जो ALK, उच्च जोखिम neuroblastoma 5-7,32,33 में सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन है। ALK सबसे लगातार और प्रबल दैहिक को सक्रिय करने के म्यूटेशन से एक के रूप में (F1174L), में प्रतिनिधित्व पर- है MYCN- उच्च जोखिम neuroblastoma रोगियों प्रवर्धित और स्थिर ट्रांसजेनिक चूहों और ट्रांसजेनिक zebrafish मॉडल 8,34,35 दोनों में neuroblastoma tumorigenesis में तेजी लाने के MYCN overexpression के साथ synergizes। मोज़ेक तकMYCN ट्रांसजेनिक मछली में mCherry साथ ALK (F1174L) के क्षणिक overexpression, हम मोज़ेक transgenesis रणनीति के लिए तेजी से और कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है, सुझाव है कि ALK (F1174L) और MYCN दोनों overexpressing स्थिर ट्रांसजेनिक मछली में मनाया ट्यूमर शुरुआत के त्वरण recapitulated vivo में ट्यूमर दीक्षा में कई ओंकोजीन के रिश्तेदार योगदान का आकलन करें।

Protocol

नोट: सभी zebrafish अध्ययन और पशुओं के रखरखाव के मेयो क्लीनिक संस्थान IACUC को मंजूरी दी प्रोटोकॉल # A41213 के साथ समझौते में किया गया था। Transgenesis के लिए 1. डीएनए constructs एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में (BACPAC संसाधन क?…

Representative Results

Mutationally सक्रिय ALK F1174L या जंगली प्रकार ALK की overexpression neuroblastoma प्रेरण में MYCN के साथ सहयोग कर सकता है कि क्या जांच करने के लिए, हम MYCN overexpressing ट्रांसजेनिक मछली की PSNS में डी βh प्रमोटर के नियंत्रण में सक्रिय मा?…

Discussion

इस प्रतिनिधि अध्ययन में, हम इन जीनों स्पष्ट रूप से यौगिक स्थिर ट्रांसजेनिक मछली coexpressing में हमारे पिछले खोजने के साथ संगत neuroblastoma की शुरुआत में तेजी लाने के लिए सहयोग दिखाने के लिए कि ट्रांसजेनिक मछली -expressing <em…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex’s Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children’s Cancer Foundation.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix		 Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY
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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).
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