Summary
이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.
Abstract
뇌는 조정 활성화 및 신경 어셈블리의 동적 통신을 통해 작동합니다. 가장 큰 의문은 가장 다양한 뇌 기능의 기초가 동적 모티프의 광대 한 레퍼토리는, 뇌 회로의 고정 위상 및 모듈 형 조직에서 나올 수있는 방법이다. 고유 실험 어려움을 제시 신경 회로의 생체 내 연구에 비해 체외 준비가 조작하고 실험 신경 시스템의 구조적, 역학적, 화학적 특성을 조사하기 위해 훨씬 더 큰 가능성을 제공합니다. 이 작품은 공간적으로 별개의, 기능적으로 상호 연결된 신경 어셈블리로 구성 모듈 형 네트워크의 성장 수있는 시험 관내 실험 방법을 설명합니다. 프로토콜 복잡도의 위상 다른 레벨에서 신경 네트워크의 2 차원 구조를 제어한다.
원하는 네트워크 패턴이 될 수 있습니다일반 커버 슬립 기판 내장 된 마이크로 전극 배열에 모두 달성했다. 미세 가공 된 구조물은 실리콘 웨이퍼 상에 양각 및 원하는 네트워크 아키텍처의 부정적인 특징을 통합 생체 적합성 고분자 스텐실을 만드는 데 사용된다. 스텐실은 세포 접착을 촉진하는 분자 층으로 표면 코팅 과정 동안 배양 기판 상에 배치된다. 스텐실 제거한 후, 뉴런 도금 이들은 자발적 코팅 분야로 재. 구획 간 거리가 감소함으로써, 격리 또는 상호 연결된 하나의 연결 회로를 얻을 수있다. 세포 생존을 촉진하기 위해, 세포는 배양 접시의 외주에 위치하고지지 신경 네트워크와 공 배양된다. 기판 매립 마이크로 전극 배열 및 칼슘 이미징을 사용하여 각각 얻어진 모듈러 네트워크 활동의 전기 생리 광학 녹음 제시된다. 각 모듈은 spont을 표시하는 동안aneous 글로벌 동기화가 모듈 간 동기화의 발생 회로들 사이의 연결 밀도에 의해 조절된다.
Introduction
실험적이고 이론적 인 증거는 뇌 일시적 서로 다른 기본 성형 및 뇌의 상태와 상호 작용하는 동적 기능 유닛으로 간주 될 수있는 셀 어셈블리 1-5의 배위 활성화를 통해 동작 할 가능성을 지원한다. 기능 모듈 방식에 의존하고 또한 뇌 회로의 구조적 -6,7- 모듈러 조직과 관련된다. 어떻게 기능과 뇌 회로의 구조가 서로 서로를 형성하는 것은 여전히 신경 과학의 주요 열려있는 질문 중 하나입니다. 이 질문에 대한 깊은 이해를 제공하기 위해, 그것이 해결하는 것이 가능하다, 여기서 적어도 부분적으로, 이러한 문제를 최적 실험 프레임 워크를 파악하는 것이 중요하다. 생체 내 실험에서 신경 네트워크의 시공간적 역학의 조작을 제어하기 때문에 체외 신경 네트워크 모델의 개발이 용이 ACC 인해 상당한 관심의 대상이며, 도전essibility, 모니터링, 조작 및 8,9 모델링. 최근, 진보 된 기판의 패터닝 방법에 의해 지원되는 기술에 대한 시험 관내 소정 모듈러 구조 (3)의 범위를 개발하기 위해 부과 된 토폴로지 (10)와 네트워크의 기능적 특성을 연구하는 신경 네트워크를 유도 할 수있다. 특히, 방법은 최근 4,11 물리적 제약을 부과하여 네트워크를 구성하는 데 사용 하였다. 실제로, 신경 네트워크의 구조 및 기능 사이의 관계를 연구하는 신경 세포의 상호 작용을 어셈블리 단순화하지만 그럴듯한 표현을 제공하기 위해, 시험 관내 시스템은 상호 접속 된 신경 하위 집단을 제공한다. 널리 연구 2D 균질의 연결을 문화는 회로의 자기 조직 응급 배선에 어떤 공간 제약을 부과하지 않습니다. 따라서 가능한 접근 방법은 말다툼에서 다른 신경 세포 인구의 위치를 인위적으로 상호 연결된 셀 어셈블리입니다 모양ially 별개의 영역. 이 지역들 사이의 거리가 간 어셈블리 연결을 방지하지 않습니다. 네트워크 복잡성 상당한 오버 제어를 유지하면서 이러한 접근법은 동기화 모델 6,7,12의 풍부한 레퍼토리를 제공하는 것으로 나타났다.
모듈의 연결 조립체의 재현성 배양을 용이하게하기 위해, 프로토콜은 제시되고 설명된다 축삭 및 수상 돌기로 연결된 뉴런 네트워크 클러스터로의 자기 조직화를 조립한다. 의 연결을 문화의 물리적 제한에 대한 고분자 구조는 polydimtheylsiloxane (PDMS)에서 작성되었습니다. PDMS는 널리 가스 (13)에 생체 적합성, 투명성과 투과성 때문에 생물 의학 응용 프로그램에 사용되는 엘라스토머이다. PDMS 스핀 코팅 잭맨 등 알에서 전술 한 바와 같이 "마스터"에 액체 PDMS를. (16) T에 의해 2075 14,15 구조를 준비하고 미세 가공 SU8에서 제외됩니다그는 다른 크기의 간 연결 모듈로 구성되어 신경 네트워크를 패턴 화 달성 그들은 모두를 성공적으로 된 커버와 마이크로 전극 배열 (다자간) 17 ~ 20에서 얻어졌다. 모듈들 사이의 연결 밀도는 모듈들 사이의 일시적인 동기 상태로 균일 문화 전형적인 완전히 동기화 된 네트워크에서, 네트워크 동기화의 기능을 변경할 수있다.
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Protocol
절차는 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 NIH 기준에 따라 수행하고, 텔 아비브 대학 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 - L-14-019)에 의해 승인되었다.
인스 트루먼 트와 PDMS 1. 준비
- 웨이퍼 준비 (재료의 표를, 또는 미세 실험실에서 웨이퍼 주문), 메스와 핀셋 - 살균이 필요되지 않습니다.
- 다음의 조건에 따라 폴리 D 라이신 (PDL) 용액을 제조 : 4 ㎎ / 0.1 M 보레이트 완충액 ㎖, pH가 8 및 -20 ℃에서.
- 다음 절차에 따라 PDMS 스텐실을 준비합니다 :
- 베이스 10의 비율로 경화제를 함께 혼합함으로써 폴리 디메틸 실록산 (PDMS, 실리콘 엘라스토머)을 준비 : 1, 그 다음 약 5 분 동안이 물질을 교반한다.
- 15 분 동안 두 번 진공 챔버의 각 시간을두고 확인 거품이 사라 졌어요.
- 언제가스의 사용을 허용하도록 개방 질소 노브를 스피너에 실리콘 웨이퍼 (도 1a)를 배치하고, 이동하는 것을 방지하기 위해 진공을 사용 PDMS 스핀 코터를 준비 준비.
- 웨이퍼 위에 PDMS를 붓고 1,000 rpm에서 1 분간 스피너를 활성화 (약 100 μm의 높이를 만듭니다).
- 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다.
- PDMS이 강화되면, 파스퇴르 피펫을 사용하여, PDMS와 스텐실의 경계를 설명합니다. 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다.
- PDMS 경계가 강화되면, 경계에 따라 스텐실을 잘라 웨이퍼에서 실리콘 스텐실을 벗겨 메스를 사용 (하나의 패턴을 포함 제곱 PDMS).
2. 페트리 접시 및 커버 슬립 준비
- 다음 순서에 따라 23mm 정사각형 유리 커버 슬립을 준비하고 청소 :
- 증류수, 70 % 에탄올, 아세톤으로 세척 하였다.
- 질소 이소프로판올과 빠른 건조와 세척 할 것.
- 커버 슬립에 패턴 PDMS 스텐실을 배치하고 부드럽게 그들이 단단히 유리 표면에 부착되어 있는지 확인을 누릅니다. 15 분 동안 진공 챔버에 배치합니다.
- 스텐실에 PDL 1 ㎖를 삭제합니다. 두 번 20 분마다의 진공 챔버에 커버 슬립을 삽입하고, 건조 PDL O / N 두십시오.
- 지원 셀 네트워크를 만들 수 페트리 접시를 준비합니다 :
- RT에서 2 시간 동안 PDL 1 ㎖와 접시 (3.5 cm)의 표면을 커버. 피펫을 사용하여 PDL 드롭을 제거합니다.
- 증류수로 세척하고 건조 둡니다. 커버 슬립의 각 모서리에 실리콘 그리스의 아주 작은 방울을 놓습니다.
- 첨부 파일을 확인하기 위해 조심스럽게 페트리 접시 (즉, PDMS이 위를 향하도록한다)과 언론의 중심에 커버 슬립을 놓습니다.
- 조심스럽게 핀셋을 사용하여 커버 슬립에서 PDMS를 제거합니다. 멸균, 7 분 동안 UV 조명에 노출.
- 이 순서 (자료 표)에서 청소 MEA :
- 농축 효소 세제 탭 및 초음파 처리에서 물을 3 회 반복한다.
- 증류수 3 회에 초음파 처리.
- 30 분 동안 UV 증류 3 회 (후드, 1000 μL 팁) 물과 장소 씻으십시오.
- 네트워크 준비 지원 :
- 설계 지원 네트워크 금형을 준비합니다.
- 12 웰 플레이트 (22mm 직경)에 PDMS를 붓고.
- PDMS 몰드 꺼내서 메스를 이용하여 경화 될 때, 링 모양을 만들 때 중앙에 구멍을 잘랐다.
- MEA (그림 2A)의 중심에 설계 지원 네트워크 금형을 넣고 실온에서 2 시간 동안 PDL과 표면의 나머지 부분을 커버한다.
- 피펫을 사용하여 PDL을 제거하고 증류수로 세척한다.
- 곰팡이를 제거하고 (그림 2A) 건조 둡니다. </ 리>
- 설계 지원 네트워크 금형을 준비합니다.
- 다음과 같은 방법으로 MEA에 스텐실을 맞 춥니 다 :
- 지정된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 놓습니다. 정확하게 전극 패턴 구조를 맞추고 MEA 표면 (그림 2B)에 배치 될 때까지 스텐실을 낮추기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다.
참고 : 잘 청소 MEA와 연락이 PDMS와 MEA 자체 사이의 경쟁 접착력을 제공합니다. - 미세 조작기를 올리고, 필요한 경우가 MEA로부터 분리 방지 위에 PDMS 압력 소량 적용 핀셋을 사용한다.
- 조심스럽게 MEA 표면에 스텐실을 누르면 단단히 부착, 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용합니다. (도 2C-D).
- 지정된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 놓습니다. 정확하게 전극 패턴 구조를 맞추고 MEA 표면 (그림 2B)에 배치 될 때까지 스텐실을 낮추기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다.
- 15 분 동안 진공 챔버에서 MEA를 배치; 스텐실에 PDL의 1 ml의 드롭을 넣어.
- 20 분 각각 진공 챔버로 2 회를 삽입합니다. 인큐베이터에서 O / N 건조 PDL을 남겨주세요.
- 도금하기 전에, 다자간 환경에서 PDMS에게 스텐실을 제거하고 w 멸균 사용하여 세척ater에. 7 분 동안 UV 조명 아래에 배치합니다.
4. 해부와 문화
- 헤르 조그 외. 2011 21에 기술 된 바와 같이 문화를 준비합니다.
5. 도금
- 혈구 (결과에서 논의 된 회로의 크기에 따라 최적의 농도)을 사용하여, 도금에 필요한 세포의 수를 계산한다.
- 반드시 계산 챔버 (혈구)를 확인 깨끗하고 그것에 커버 슬립 (청소 사용 알코올)을 배치합니다.
- 매체 (1:20 희석) 190 μL의 도금에서 세포 현탁액 10 μL 희석.
- 로드 (10) 카운팅 챔버의 에지 상으로 희석하고 셀 μL 천천히 자체를 채울 수 있도록 챔버 세포를 피펫.
- 거꾸로 현미경을 사용하여 혈구 그리드를 시각화. 다이렉트 카운팅함으로써 챔버 내의 세포 수를 (건강한 세포가 둥글게한다)을 결정. 큰 광장 witho 내에서 세포를 계산가장자리를 횡단하는 사람들을 UT.
- 세포의 농도를 계산한다 :
세포의 총 수 / 1000 μL = 희석 배수 × × 104 (혈구의 영역) 계산 총 세포.
참고 : 예를 들어, 희석 배수가 20이었고, 계산은 전체 셀 (100)과 같다 :
100 × 20 × 104 = 0.1 × 10 7 세포 / μL 1000 또는 1 × 10 1백분의 6 μL. 0.75 × 106 세포 판형하기 위해, 세포 중 75 μl를 취할.
- 단일 MEA 또는 페트리 접시 당 도금에 필요한 세포의 수를 고려해야 응집을 방지하기 위해 세포를 재현 탁하고, patternate 영역의 상단에, 중앙에 그들을 플레이트 (필요한 경우에는 배지에 세포를 희석 할 수있다) . MEA를 들어, 중간에 100 μL 드롭을 배치합니다. 커버 슬립의 경우, 중간에 1000 μL 드롭을 배치합니다.
- 40 분 동안 37 ° C에서 도금 세포를 품어. 1까지, 도금 세포에 도금 매체 추가MEA mL 당 및 커버 슬립 당 2 ml의.
- 0.5 펜 연쇄상 구균, 2 % B-27와 0.75 % 루타가 풍부한 신선한 성장 배지로 희석, 4 일마다 37 ° C로 유지하고.
- 또는 폐해를 방지하기 위해 다른 항 유사 분열 제 6/7 DIV에서, 섬 사이의 연결을 본 후, 10 ㎕의 매체에 희석 / ㎖ FUDR은 (12.5 ml의 MEM (최소 필수 중간 이글) 25 mg을 우리 딘 + 62.5 mg을 유리 딘) 자라.
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Representative Results
약 100 ㎛의 두께를 갖는 특징 실리콘 웨이퍼 상 SU8-2075 PDMS 몰드를 형성하기 위해 사용되었다. 패턴은 변의 길이와의 거리가 200 내지 700 ㎛의 (도 1b)를 가변하여, 여러 사이즈의 사각형으로 구성되었다. 사각형의 크기와 20 배 목표의 (측면 길이 <400 μm의와 섬에 대한) (측면 길이 <800 μm의와 섬에 대한) 10 배의 시야에 맞게 선택되었다. 세 개의 매개 변수, 즉 회로 사이의 도금 셀 밀도, 거리, 회로 '크기는 단층 또는 클러스터를 얻는 회로뿐만 아니라 그들의 부과 연결을 형성하기위한 결정이다. 그러나, 이들 파라미터들은 자발적 회로 '크기 증가 접속을 확립 확률, 두 회로 사이의 고정 된 거리 주어진 보낸 독립적이지. ~ 300의 작은 신경 모듈,이 작품에서 논의 된 예에서 X 300 μm의, 연결거리가 ~ 300보다 크지 때 설립되었다 - 400 μm의, 동안 많은 신경 모듈 ~ 거리가 작은 ~ 700 μm의 때 700 X 700 μm의이 연결이 설립되었다. 일반적으로 사각형 사이의 거리를 증가시켜 그 격리 사람에게 매우 접속 모듈로부터 전달 모듈 중에서 자발적으로 생성 된 상호 연결을 설정하는 확률을 변경하는 것이 가능했다.
~ 600 × 600 μm의 시험관에 사일에 표시됩니다의 신경 모듈 (DIV; 그림 3A). 체외 신경 세포에서 몇 일의 대부분이 코팅 된 지역 내에 위치 후에는 개발 된 신경 프로세스와 연결을 관찰하는 것은 불가능합니다. 14 DIV에서 반대로, (그림 3B-C) 신경 세포 내와 모듈 사이의 연결을 설정합니다. ~ 600 × 600 μm의 더 많은 신경 회로는 (그림 3A-C), 회로이 작다의 단일 층으로 자기 조직 수 있지만(R)의 치수 (예를 들면, 300 ~도 3d에서, X는 300 μm의) 클러스터링하는 경향이 있었다. 따라서, 이차원 회로 최선 보정을 얻기 위하여, 세포를 다른 밀도는 35mm 배양 접시에 부착 0.25 × 106 106 세포 / 23 10 × 1 mm의 커버 슬립이 다양한 도금 하였다. ~ 700 X 700 μm의 더 많은 회로를 위해 우리는 35mm 페트리 접시에 부착 된 0.75 × 10 6 세포 / 23mm 커버 슬립 단층 회로가 자발적으로 간 연결을 방해하지의 형성을 유도하는 최적의 밀도 (그림 3C는 것을 발견 ). 단층의 회로와 동일한 결과는 35mm 배양 접시에 부착 된 0.5 × 106 세포 / 23mm 커버 슬립을 도금함으로써 X 300 ~ 300 μm의 작은 회로 얻었다. 도금 셀 밀도를 고려할 때 이전에 7, 신경 교세포 및 클러스터 타고난 성향이 바와 같이, 일반적으로, 그것은, 그 강조 CL 어느 정도의 매우 중요ustering 문화에 약간의 시간이 지나면 거의 불가피하다. 그러나, 우리는 지원되는 네트워크로 전송 영역을 증가하는 것은 아마도 외 공간에서 영양소의 큰 농도 인해 회로 생존 및 모노 - 층상 조직의 가능성을 향상시키는 것을 관찰 하였다. 어떤 경우에, 시행 착오 접근 방식은 칼슘 이미징, 모노 레이어 회로를 만드는 데 최적의 도금 셀 밀도를 식별하기 위해 필요하다. 4 일마다 배지를 신선한 성장 배지로 희석 하였다. 6/7에서 DIV는 섬 사이의 연결을 본 후, 10 μl의 / ㎖ FUDR은 아교과 성장을 방지하기 위해 추가되었습니다.
도 4는 모듈 형 네트워크의 동적 (Bonifazi 등. 2013 8에 기재된 바와 같이 수행) 칼슘 이미징을 사용하여 기록 나타낸다. 칼슘 - FL uorescence 이미지는 Figur (전체 네트워크의 동작을 모니터링 활성화 4X 배율 대물를 사용 취득한전자 4A). Bonifazi 등. 2013 8에 기재된 바와 같이 칼슘 영상 분석을 실시 하였다. 칼슘 이벤트도 4b 래스터 플롯에서 자발적인 활동을 표시하는 (색상 그림 4A에 표시 모듈에 해당) 제시 개시. 칼슘 이미징 30 Hz에서 행하고, 화상 크기는 1000 X 1000 픽셀이다.
아마도 많은 수의 연결 (그림 4A)에 해당하는, 그들의 두꺼운 연결 번들 계약에 래스터 플롯 (그림 4B)에서와 같이 녹색과 분홍색 모듈은 매우 동기화됩니다. 파란색과 빨간색 모듈은 약하게 녹색과 분홍색 모듈에 연결되어 있고, 따라서 그들은 때때로 그들 (그림 4B)와 동기화됩니다. 녹화 비디오는 온라인 (동영상 M1)입니다.
21에서 DIV MEA 상에 성장 네트워크 모듈의 이미지는도 5a에 도시되어있다. 나는이차원 회로 최선 교정을 획득하기 위해 N 개의, 우리는 서로 다른 밀도가 MEA 당 / 500 × 103 세포에 250 × 103에서 변화와 대뇌 피질 세포 도금. 그들의 자발적인 간 연결을 방해하지 않으면 서 250 × 103 세포 / MEA 당 (30mm 링), 단층 회로의 형성의 측면에서 더 나은 결과를 주었다. 일단 패터닝 된 신경 네트워크는 전기 생리 활성을 획득하고 전기 생리 신호를 기록하기 위해 사용되는 상용 시스템을 사용하여 모니터되어, MEA의 기판 (도 5a)에서 달성되었다. 배양의 운동량은 정확한 타이밍 스파이크 검출 (PTSD) 알고리즘 (22)을 이용하여 검출된다.
도 5b는 클러스터 번호에 따른 컬러 코딩 운동량 5 분 (에만 활성화 전극이 가시)에 대응하는 래스터 플롯을 도시한다. 이 그래프를보고함으로써, 질적 평가를하는 것이 가능하다단일 클러스터와 동시에 전체 네트워크의 활동. 특히, 각각의 클러스터 내에 기록 활동 간의 강한 동기를 관찰 할 수있다. MEA를 통해 패턴 문화의 대표 녹음의 비디오는 온라인 (동영상 M2)입니다.
1. 실리콘 웨이퍼를 그림. (A) 실리콘 웨이퍼 (~ 4 인치 직경) PDMS 스텐실을 성형하는데 사용. 다른 SU8 구조물은 다른 모듈 형 네트워크를 나타낸다. 모듈 형 네트워크를 구축하는 실리콘 웨이퍼 상에 구현 (B) 기능 주제 디자인. 각 녹색 자리는 단일 모듈 SU8 필러 구조 때문에 영역을 정의한다. 점선 검은 사각형 내의 디자인은 23mm 측 렌의 표준 광장 문화 된 커버에 사용할 수있는 세 가지 다른 스텐실에 해당GTH. 각 스텐실에서 별표 (*)가 지원하는 네트워크에 대한 매크로 영역을 표시합니다. 스폿 간의 거리에 따라, 유한 크기 회로 또는 모듈은 그들 사이의 연결 자발적인 접속을 확립 할 수있을 것이다. 기능의 설계는 다른 대물 배율에서 (4X, 10X 및 20X 시야 괜찮을 것 격리 또는 상호 연결된 회로의 연결을 달성하기 위해 다른 모듈 크기와 모듈 간 거리를 만들기 위해 선택되었다 각 배율 시야 인 빨간색 사각형으로 표시). 점선 검은 사각형의 아웃 기능이 MEA 및 칼슘 이미징의 동시 사용에 맞게 설계되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2.PDMS 구조는 MEA에 증착. (빨간색 화살표로 표시) 링 모양 (A) PDMS 금형은 MEA에 장착. PDMS 스텐실의 몰드지지 신경 네트워크에 향하는 및 배양 영역의 주변에 위치하는 영역을 코팅하는 데 사용 (이는 링에 의해 한정되는 MEA 상에 장착되고 녹색 화살표로 표시)된다. (B) 정렬 MEA에 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여. 정렬 후 MEA에에 증착 (C) PDMS 스텐실. 10 배 확대하여 MEA에 PDMS 스텐실의 (D) 이미지 (전극 간 거리가 500 μm의)입니다. 이 전극에 대응하여 스텐실 구멍을주의하는 것이 가능하다. 세포 접착을 선호하는 접착제 층에만 열 분야에 입금됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
GE = "항상"> 
다른 DIV 3. 모듈 형 신경 네트워크 그림. ~ 600 ×의 600μm (A)의 대뇌 피질 모듈 (14) DIV. (C) 후 4 DIV와 (B) 이후의 밝은 이미지 필드 (14) DIV 후 회로 간의 자발적인 상호 연결합니다. 세포가 큰 회로 단층으로 구성 할 최적의 세포 밀도로 플레이 팅 하였다 즉 절반 크기와 동일한 세포 농도의 PDMS 기능을 사용하여 750 × 103 세포를 35mm 배양 접시에 부착 / 23mm 커버 슬립. (D) 클러스터 구조로 구성 신경 회로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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모듈 형 네트워크 그림 4. 칼슘 이미징. 칼슘 표시기 OGB로드 (A) 대뇌 피질 세포 (18 DIV). 다른 색깔은 다른 모듈을 표시합니다. 보기의 필드. 2 × 2mm이다 자발적인 활동의 (B) 래스터 플롯. 패널 A에서와 같이 서로 다른 색상이 다른 모듈 내에서 세포에 해당하는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모듈 형 네트워크 그림 5. MEA 기록. (A) 4 분기에 성장 MEA 3 회로로 구성된 별개의 모듈 형 네트워크 (피질 뉴런 DIV 21 참조). 신경 회로는 ~ 서로 600 μm의 상호 먼. (B) 래스터 플롯은 자연 ELECTR의 5 분을 보여주는ophysiological 활동 기록. C1, C2와 C3는 왼쪽, 오른쪽과 왼쪽 하단 클러스터의 활동에 서로 다른 색상으로 강조, 각각 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기능적으로 상호 연결된 회로로 구성된 시험 관내에서 2D 모듈러 신경 네트워크를 성장 프로토콜을 설명한다. 절차는 세포 접착층을 패턴에 기초한다. 패터닝 PDMS 스텐실 원하는 네트워크 아키텍처의 음 재생 기능에 의해 달성된다. PDMS 스텐실 셀룰러 접착제 층이 증착되는 영역을 정의한다. 세포가 도금되면, 그들은 자발적으로 코팅 된 섬에 조립하고 활성 간 연결 회로에 자기 조직화. MEA의 칼슘 이미징을 사용하여 기록 기능 모듈 형 네트워크의 녹음이 제시되었다.
제시된 프로토콜은 정식으로 처음 다음 절차에 비해 수정되었습니다. 첫째, PDMS 스텐실 '정렬에 문제가 해결되어야했다. 정렬 (스텐실 표면을 만진 후,이 위치를 변경하지 않는 것이 좋습니다) 첫 번째 시도에서 달성해야하기 때문에,이 문제는 해결되었습니다수동 절차를 포기하고 MEA 기록 영역에서 정확한 공판 증착 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행하는 새로운 방법에 대한 옵트. 해결되어야하는 또 다른 문제가 있었다 정렬 스텐실 아래 통과 PDL 강하를 방지하는 것으로 이루어진다 (다르게 패턴 디자인은 얻을 수 없었다). 스텐실 정렬 및 그것에 PDL 강하 간주 장치 (MEA 또는 커버 슬립)를 착용하기 전에되면 이렇게하려면, 따라서 그것 양호한 부착을 제공하는 시간의 적당한 시간 동안 진공 챔버에 남아되어야 표면. PDL 강하 장치 및 드롭 자체 따라서 PDL이 표면와 연락 할 수 있도록 사이에 형성하는 기포를 제거하기 위하여 공판 배치되면 동일하게 수행되었다.
내가) 보장해야 스핀 코팅 단계는 "오픈 복제본을"얻을 또는, 적어도, suffici : 설명 프로토콜의 중요한 단계로 표시된다쉽게 핀셋을 사용하여 제거 할 수 SU8 구조물 위에 리언 박막; ⅱ) 배양 표면 (커버 슬립 또는 MEA)의 치료; ⅲ) 그 위에 PDMS 스텐실의 배치; IV)의 경우는 코팅 단계가 있기 때문에 이는 PDMS에 마스크가 위치되는 기판에 대해 제대로 밀봉되지 못하면, 따라서 마스크 패터닝을 손상 아래 접착 단백질을 전달하는 일이 있었다. 그래서, 커버 슬립 또는 다자간의 세정 공정이 가장 중요뿐만 아니라 PDMS 스텐실의 배향이다. 이 두 단계의 적절한 성과는 가장 패터닝 결과를 확인합니다.
이 기술의 한계 및 전기 생리 칼슘 촬상 모두 취득 할 수도있다. 첫 번째 경우, 매우 낮은 공간 해상도 (4 - 8 전극이 각각의 모듈에 포함된다)이 인하여 단일 회로의 치수 및 전극 간 distanc 모두에 존재전자. 후자의 경우, 위험은 이렇게 하나의 셀의 고해상도 획득을 방지 이차원 셀룰러 층이 얻어 최적 세포 밀도를 찾지 못하는 것으로 이루어진다.
이전에 (작품을보고에 코팅, 조립 및 멸균 방법 및 사용자 정의 마이크로 정렬 시스템의 창조의주의 최적화를 필요한이 전략은, 관련하여 우리에게 몇 가지 주요 이점을 준 예를 들어, 우리의 세포의 장기 생존, 즉, 최대) 시험 관내 8 주 정도. 구체적으로는 화학 패터닝 23-28에 기초 전략에 대하여 더 안정적인 장기간 한정 24 우리에게 제공했다.
설명 절차는 축색 돌기로 연결된 신경 어셈블리로 네트워크의 자기 조직화를 보장하고 번들을 수상 돌기 PDL 코팅 모듈에 대뇌 피질 세포를 도금에 의존한다. 모듈 형 그물의 넓은 필드 칼슘 이미징을 허용하려면단세포 해상도 작동 그것은 신경계가 2D 층으로 조직화하는 것이 필수적이다. 그러므로 도금 셀의 밀도를 최적화하는 두 고밀도 세포 클러스터를 피하거나 모듈 간 접속 확률을 줄이는 다른 극단 저밀도 모듈에 중요하다.
배양 신경 아교 세포 - 네트워크가 생체 내 조직 구조를 잃고 있지만, 이들은 자발적으로 잘 제어 된 실험 조건 하에서 조사를 수행 할 수있는 가능성을 제공하는 활성 기능 회로에 자기 조직화. 이 프로토콜에서 설명한 기능적 상호 연결된 회로로 구성된 이차원 모듈은 신경 네트워크 모티프 큰 레퍼토리를 생성하는 신경 세포 간의 커뮤니케이션 어셈블리의 역학과 구조적으로 정의 된 신경 네트워크의 용량을 조사하기위한 강력한 도구를 제공한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 유럽 프로젝트 BRIANBOW (FP7- 젊은 탐험가에 의해 지원되었다, 저자는 원고에 대한 유용한 의견을 박사 코포 Tessadori에게 감사를 표하고, 비디오에 사용 된 그래픽을 생산하는 그녀의 도움 실비아 Chiappalone 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
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