Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å vokse in vitro modulære nettverk bestående av romlig trange, funksjonelt inter-tilkoblet nevrale kretser. Et polymert masken blir brukt til å mønstre et proteinsjikt for å fremme cellulær adhesjon i løpet av dyrknings substratet. Belagt nevroner vokse på belagte områder etablerer spontane tilkoblinger og stiller elektrofysiologisk aktivitet.
Hjernen opererer gjennom koordinert aktivering og dynamisk kommunikasjon av nevronale forsamlinger. Et stort åpent spørsmål er hvordan et stort repertoar av dynamiske motiver, som ligger til grunn for de forskjelligste hjernefunksjoner, kan komme ut av en fast topologisk og modulær organisering av hjernen kretser. Sammenlignet med in vivo-studier av nervekretser som presenterer eksperimentelle iboende vanskeligheter, in vitro preparater gir en mye større mulighet til å manipulere og undersøke de strukturelle, dynamiske og kjemiske egenskaper av eksperimentelle neuronale systemer. Dette arbeidet beskriver en in vitro eksperimentell metode som gjør det mulig å vokse av modulære nettverk komponert av romlig distinkte, funksjonelt sammenhengende nevronale forsamlinger. Protokollen muliggjør styring av to-dimensjonale (2D) arkitektur av neuronal nettverk på forskjellige nivåer av topologisk kompleksitet.
En ønsket nettverk mønster kan væreoppnås både på vanlige dekkglass og substrat innebygd mikroelektrode arrays. Mikro strukturer er preget på en silisiumskive og brukes til å lage biokompatible polymere stensiler, som omfatter de negative trekk ved den ønskede nettverksarkitektur. Sjablonene er plassert på dyrkingsunderlag under overflatebelegg prosedyre med en molekylsjikt for å fremme cellulær adhesjon. Etter fjerning av sjabloner blir neuroner belagt og de spontant omdirigert til de belagte områder. Ved å redusere inter-rommet avstand, er det mulig å oppnå enten isolerte eller sammenkoblede neuronal kretser. For å fremme celleoverlevelse, celler ko-dyrket med en bære neuronal nettverk som ligger ved periferien av kulturskålen. Elektrofysiologiske og optiske opptak av aktiviteten av modulære nettverk som oppnås henholdsvis ved hjelp av substrat innebygde mikroelektrodegrupper og kalsium avbildning er presentert. Mens hver modul viser spontaneous globale synkroniseringer, er forekomsten av inter-modul-synkronisering regulert av tettheten av forbindelse mellom kretsene.
Eksperimentelle og teoretiske bevis støtter den mulighet at hjernen opererer gjennom koordinert aktivering av celleenhetene 1-5, som kan betraktes som dynamiske funksjonsenheter som transient samvirker med hverandre, forme og underliggende forskjellige hjernetilstander. Funksjonell modularitet er også avhengig av og i forbindelse med den strukturelle modulær organisering av hjernen kretser 6,7. Hvordan funksjon og struktur av hjernekretser gjensidig forme hverandre er fortsatt en av de viktigste åpne spørsmål i nevrovitenskap. Å gi en dypere forståelse av dette spørsmålet, er det viktig å identifisere optimale eksperimentelle rammeverk hvor det er mulig å ta opp, i hvert fall delvis, disse problemene. Siden kontrollert manipulering av rom-tid-dynamikk nevrale nettverk i in vivo-eksperimenter er utfordrende, utvikling av in vitro modeller nevrale nettverk er av betydelig interesse på grunn av deres enkle accessibility, overvåking, manipulasjon og modellering 8,9. I de senere årene, in vitro teknologier støttes av avanserte underlaget mønstrings metoder har lov til å indusere nevrale nettverk for å utvikle en rekke forhåndsdefinerte modulære strukturer 3 og å studere funksjonelle egenskaper nettverk med pålagte topologies 10. Spesielt ble metoder nylig brukt til å organisere nettverk ved å pålegge fysiske begrensninger 4,11. Faktisk, for å studere sammenhengen mellom struktur og funksjon i nevrale nettverk og for å gi en forenklet men plausibel representasjon av samspill nevrale forsamlinger, bør in vitro-systemer gir sammenhengende nevronale undergrupper. Allment studert 2D homogene nevrale kulturer ikke pålegge noen romlige begrensninger på selvorganisert emergent kabling av kretsene. Derfor en mulig tilnærming til å forme kunstig sammenhengende celleforsamling er å posisjonere ulike nevronale populasjoner i spyttetially forskjellige områder. Avstanden mellom disse områdene hindrer ikke inter forsamlinger tilkoblinger. Denne tilnærmingen, samtidig som man sikrer en betydelig kontroll over nettverket kompleksitet, har vist seg å gi en rikere repertoar av synkroniserings modeller 6,7,12.
For å muliggjøre en reproduserbar dyrkning av modulære neuronal sammenstillinger, til en protokoll montere selv-organisering av nevrale nettverk i klynger koblet av aksoner og dendritter er presentert og beskrevet. Polymer struktur for fysisk innesperring av nevrale kulturer har blitt opprettet fra polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS er en elastomer mye brukt for biomedisinske anvendelser på grunn av dets biokompatibilitet, transparens og permeabilitet for gasser 13. PDMS er forberedt og ekskludert fra mikromaskinert SU8 2075 14,15 strukturer av spin-belegg en flytende PDMS på en "master" som beskrevet tidligere i Jackman et al. 16 Than oppnådde mønstret nevrale nettverk er sammensatt av sammenhengende moduler av ulik størrelse, og de har blitt innhentet på begge dekkglass og Micro elektrode Arrays (måle) 17-20. Tettheten av forbindelser mellom modulene kan endre funksjonene i nettverk synkronisering, fra en fullt synkronisert nettverk, typisk for ensartede kulturer, til forbigående tilstander av synkronisering mellom modulene.
En protokoll for å vokse 2D modulære nevrale nettverk in vitro sammensatt av funksjonelt sammenhengende kretser er beskrevet. Fremgangsmåten er basert på mønstring av et cellulært klebelag. Mønster oppnås med PDMS sjablonger reprodusere den negative trekk ved den ønskede nettverksarkitektur. PDMS sjablonger definere områder hvor det cellulære klebemiddellaget er avsatt. Når cellene blir sådd ut, de spontant å sette sammen de belagte øyer og selv organisere til aktive sammenhengende kretser. Innsp…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av det europeiske prosjektet BRIANBOW (FP7- Young Explorers, ville Forfatterne takke Dr. Jacopo Tessadori for nyttige kommentarer til manuskriptet, og Silvia Chiappalone for hennes hjelp i å produsere grafikk som brukes i videoen.
PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
TC02 | Multi Channel Systems | ||
Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
B-27 | Gibco | 17504044 | |
glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |