Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol om te groeien in vitro modulaire netwerken bestaande uit ruimtelijk beperkt, functioneel met elkaar verbonden neuronale circuits. Een polymere masker wordt gebruikt voor het patroon van een eiwit laag om cellulaire adhesie op het kweken substraat te bevorderen. Plated neuronen groeien op gecoat gebieden oprichting spontane verbindingen en vertonen elektrofysiologische activiteit.
Abstract
Het brein werkt via de gecoördineerde activering en de dynamische communicatie van neuronale assemblages. Een grote open vraag is hoe een uitgebreid repertoire van dynamische motieven, die meest uiteenlopende hersenfuncties ten grondslag liggen, kunnen voortkomen uit een vaste topologische en modulaire organisatie van de hersenen circuits. In vergelijking met in vivo studies van neuronale circuits die intrinsieke experimentele moeilijkheden opleveren, in vitro preparaten bieden een veel grotere mogelijkheid te manipuleren en sonde de structurele, dynamische en chemische eigenschappen van experimentele neuronale systemen. Dit werk beschrijft een in vitro experimentele methode die het mogelijk maakt het groeien van modulaire netwerken samengesteld door ruimtelijk onderscheiden, functioneel met elkaar verbonden neuronale assemblages. Het protocol maakt het regelen van de tweedimensionale (2D) architectuur van het neuronale netwerk op verschillende topologische complexiteit.
Een gewenste netwerk patroonvorming kan zijnbereikte zowel op reguliere dekglaasjes en substraat ingesloten micro-elektrode arrays. Micromachine structuren reliëf op een silicium wafer en gebruikt om biocompatibele polymere stencils, die de negatieve kenmerken van het gewenste netwerkarchitectuur nemen creëren. De sjablonen worden tijdens de oppervlaktelaag procedure met een moleculaire laag voor het bevorderen van cellulaire adhesie aan het kweken substraten geplaatst. Na verwijdering van de stencils worden neuronen uitgeplaat en zij spontaan doorgestuurd naar de beklede gebieden. Door het verlagen van de inter-compartiment afstand, is het mogelijk om ofwel geïsoleerde of onderling verbonden neuronale circuits te verkrijgen. Celoverleving bevorderen, cellen samen gekweekt met een ondersteunend neuronale netwerk dat zich aan de rand van de kweekschaal. Elektrofysiologische en optische opnames van de activiteit van modulaire netwerken respectievelijk verkregen door substraat ingesloten micro-elektrode arrays en calcium imaging gepresenteerd. Terwijl elke module toont Spontaneous wereldwijde synchronisaties, wordt het optreden van de inter-module synchronisatie gereguleerd door de dichtheid van de verbinding tussen de circuits.
Introduction
Experimentele en theoretische bewijzen ondersteunen de mogelijkheid dat de hersenen werken door gecoördineerde activatie van celsamenstellen 1-5, waarbij dynamische functionele eenheden die tijdelijk met elkaar, vormen en onderliggende verschillende hersengebieden toestanden kunnen worden beschouwd. Functionele modulariteit is ook afhankelijk en verbonden aan de structurele modulaire organisatie van de hersenen circuits 6,7. Hoe de functie en structuur van de hersenen circuits elkaar wederzijds vorm is nog steeds één van de belangrijkste open vragen in de neurowetenschappen. Om een dieper inzicht in deze vraag te voorzien, is het belangrijk om een optimale experimentele kaders identificeren waar het mogelijk is om aan te pakken, ten minste gedeeltelijk, die kwesties. Sinds gecontroleerde manipulatie van de ruimtelijke en temporele dynamiek van neuronale netwerken in in vivo-experimenten is uitdagend, de ontwikkeling van in vitro neuronale netwerken modellen is van groot belang vanwege hun gemakkelijke accessibility, controle, manipulatie en het modelleren van 8,9. In de afgelopen jaren, in vitro technieken met geavanceerde substraat patroonvorming werkwijzen maken neuronale netwerken bewegen een reeks vooraf gedefinieerde modulaire structuren 3 ontwikkelen en de functionele eigenschappen van netwerken bestuderen met opgelegde topologieën 10. In het bijzonder werden methoden onlangs gebruikt om netwerken te organiseren door het opleggen van fysieke beperkingen 4,11. Inderdaad, het verband tussen structuur en functie in neuronale netwerken te bestuderen en om een vereenvoudigde maar plausibele voorstelling van interactie neuronale assemblages bieden, dient in vitro systemen onderling verbonden neuronale subpopulaties bieden. Uitgebreid bestudeerd 2D homogene neuronale culturen geen ruimtelijke beperkingen op te leggen aan de zelf-georganiseerde emergent bedrading van de circuits. Daarom is een mogelijke aanpak om kunstmatig verbonden celsamenstellen vorm is om de verschillende neuronale populaties spuugde positionerenially verschillende gebieden. De afstand tussen deze gebieden niet voorkomen dat de inter assemblages aansluitingen. Deze benadering, waarbij een aanzienlijke controle over netwerkcomplexiteit, is aangetoond dat een rijkere repertoire synchronisatie modellen 6,7,12 verschaffen.
Om een reproduceerbare kweken van neuronale modulaire samenstellen vergemakkelijken, een protocol voor de zelf-organisatie van neuronale netwerken in clusters toegevoegd door axonen en dendrieten assembleren wordt voorgesteld en beschreven. De polymere structuur voor de fysieke opsluiting van neuronale culturen is ontstaan uit polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS is een elastomeer veel gebruikt voor biomedische applicaties vanwege de biologische verenigbaarheid ervan, transparantie en permeabiliteit voor gassen 13. De PDMS wordt bereid en uitgesloten van de micromachine SU8 2075 14,15 structuren door spin coaten van een vloeibare PDMS op een "master" zoals eerder beschreven in Jackman et al. 16 THij bereikte gevormde neuronale netwerken bestaan uit onderling verbonden modules van verschillende grootte en ze werden met succes verkregen zowel dekglaasjes en Micro Electrode Arrays (MEA) 17-20. De dichtheid van de verbindingen tussen de modules kunnen de eigenschappen van het netwerk synchronisatie tussen modules wijzigen van een volledig gesynchroniseerde netwerk, typisch uniform culturen, voorbijgaande toestanden van synchronisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de NIH normen voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werd goedgekeurd door de Universiteit van Tel Aviv Animal Care en gebruik Comite (nummer van de vergunning - L-14-019).
1. Voorbereiding van Instrumenten en PDMS
- Bereid de wafel (Table of Materials, of bestel de wafel vanaf een microfabricage lab), een scalpel en pincet - sterilisatie niet noodzakelijk.
- Maak poly-D-lysine (PDL) oplossing volgens de volgende voorwaarden: 4 mg / ml in 0,1 M boraatbuffer, pH 8, en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid PDMS stencils volgens de volgende procedure:
- Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS, silicone-elastomeer) door mengen van de basis en het hardingsmiddel met een verhouding van 10: 1, roer de 2 stoffen gedurende ongeveer 5 min.
- Plaatsen in vacuümkamer tweemaal gedurende 15 min elke keer en controleer belletjes zijn verdwenen.
- Wanneerhet PDMS is klaar, bereiden spinbekleder: geopend stikstof knoppen om het gebruik van gas mogelijk te maken, plaatst u de silicium wafer (Figuur 1A) op de spinner, en gebruik het vacuüm te verhinderen dat ze.
- Giet PDMS dan wafer en activeert de spinner gedurende 1 min bij 1000 rpm (creëert ongeveer 100 urn hoogte).
- Plaats wafer op een hete plaat bij 100 ° C gedurende 30 min.
- Wanneer het PDMS is uitgehard overzicht grenzen het sjabloon met PDMS, met Pasteur pipet. Plaats wafer op een hete plaat bij 100 ° C gedurende 30 min.
- Wanneer de PDMS grenzen hebben verhard, gebruik dan een scalpel om stencils gesneden volgens de grenzen en trek het silicium stencil van de wafer (een kwadraat PDMS die een enkele patroon).
2. petrischaaltje en Cover Slip Voorbereiding
- Bereid 23 mm vierkante glazen dekglaasjes en reinig ze volgens de volgende volgorde:
- Wassen met gedestilleerd water, 70% ethanol en aceton.
- Wassen met isopropanol en snel droog met stikstof.
- Plaats patroon PDMS stencils op dekglaasje, en drukt u voorzichtig om te controleren of ze stevig zijn bevestigd aan het glasoppervlak. Plaats in vacuümkamer 15 min.
- Drop 1 ml van PDL op stencil. Plaats het dekglaasje in de vacuümkamer tweemaal 20 minuten per keer, en laat PDL O / N drogen.
- Bereid petrischaal een ondersteunende cel netwerk te creëren:
- Bedek het oppervlak van de schaal (3,5 cm) met 1 ml van PDL 2 uur bij RT. Verwijder de PDL druppel met een pipet.
- Wassen met gedestilleerd water en laten drogen. Plaats een klein druppeltje siliconenvet op elke hoek van het dekglaasje.
- Plaats het dekglaasje op het midden van de petrischaal (dat wil zeggen, moet het PDMS worden naar boven) en druk zachtjes om bevestiging te controleren.
- Verwijder voorzichtig PDMS van dekglaasje met een pincet. Voor sterilisatie, blootstellen aan UV-verlichting voor 7 min.
- Schoon MEA in deze volgorde (tabel van Materialen):
- Wassen met water onder de kraan en ultrasone trillingen in een geconcentreerde, enzymatische detergent 3 keer.
- Ultrasone trillingen in gedestilleerd water 3 keer.
- Wassen met gedestilleerd water (in kap, 1.000 III tip) 3 keer en plaats onder UV gedurende 30 min.
- Ondersteunende netwerk voorbereiding:
- Bereid de ontworpen ondersteunend netwerk schimmel.
- Giet PDMS in een 12-well plaat (22 mm diameter).
- Wanneer de PDMS is uitgehard nemen uit de mal en met behulp van een scalpel, een gat in het midden om een ring vorm te maken.
- Plaats een ontworpen ondersteuningsnetwerk schimmel op het midden van het MEA (figuur 2A) en bestrijken de rest van het oppervlak met PDL gedurende 2 uur bij KT.
- Verwijder PDL behulp van een pipet en wassen met gedestilleerd water.
- Verwijder de mal en laat het drogen (Figuur 2A). </ Li>
- Bereid de ontworpen ondersteunend netwerk schimmel.
- Lijn stencil naar MEA op de volgende manier:
- Plaats stencil op aangewezen micro manipulator. Gebruik een omgekeerde microscoop om nauwkeurig uitlijnen patroon structuur elektroden en laat het stencil totdat op het MEA oppervlak (figuur 2B) geplaatst.
Opmerking: Neem contact op met een goed schoongemaakt MEA biedt concurrerende hechting tussen de PDMS en de MEA zelf. - Til de micromanipulator en gebruik indien nodig pincet een kleine hoeveelheid druk toegepast boven de PDMS te voorkomen dat het loskomen van de MEA.
- Druk voorzichtig op stencil te MEA oppervlak, en gebruik microscoop om te controleren of hij stevig bevestigd is, en goed uitgelijnd. (Figuur 2C-D).
- Plaats stencil op aangewezen micro manipulator. Gebruik een omgekeerde microscoop om nauwkeurig uitlijnen patroon structuur elektroden en laat het stencil totdat op het MEA oppervlak (figuur 2B) geplaatst.
- Plaats MEA in vacuümkamer voor 15 min; zet een 1 ml druppel PDL op stencil.
- Invoegen in vacuümkamer 2 keer voor 20 minuten elk. Laat PDL drogen O / N in de incubator.
- Voordat plating, verwijder de PDMS stencils van MMO's en wassen met steriele water. Plaats onder UV-belichting gedurende 7 min.
4. Dissection en Cultuur
- Bereid culturen zoals beschreven Herzog et al. 2011 21.
5. Plating
- Bereken aantal cellen nodig voor plateren met behulp van een hemocytometer (optimale dichtheid volgens de grootte van de schakeling beschreven in het resultaat).
- Zorg ervoor dat de telkamer (hemocytometer) is schoon en plaats een deksel slip op het (gebruik van alcohol schoon te maken).
- Verdun 10 pi van de celsuspensie in 190 pl plaatmedium (verdunning 1:20).
- Plaats 10 gl van de verdunde cellen op de rand van de telkamer en langzaam pipet cellen uit waardoor de kamer zich vult.
- Met behulp van een omgekeerde microscoop, visualiseer de haemocytometer net. Bepaal het aantal cellen in de kamer door directe telling (gezonde cellen zou ronde). Tel de cellen in het grote plein without die het oversteken van de randen.
- Bereken de concentratie van cellen:
Totaal aantal cellen / 1000 ul = totaal getelde cellen x verdunningsfactor x 10 4 (gebied van de hemocytometer).
Opmerking: Als bijvoorbeeld de verdunningsfactor was 20 en de totale cellen geteld werden 100:
100 x 20 x 10 4 = 0,1 x 10 7 cellen / 1000 ul of 1 x 10 6/100 ul. Om 0.75 x 10 6 cellen plaat, neem 75 pi uit de cellen.
- Neem het aantal cellen nodig voor plateren per enkelvoudige MEA of petrischaal, resuspendeer de cellen om aggregatie te voorkomen en plaat ze in het midden bovenop het patternate gebied (indien nodig, het mogelijk om de cellen te verdunnen in het medium) . Voor de MEA, plaats een 100 ul druppel in het midden. Voor dekglas, plaats een 1.000 III daling in het midden.
- Incubeer de cellen uitgeplaat bij 37 ° C gedurende 40 min. Voeg plating medium om de geplateerde cellen tot 1ml per MEA en 2 ml per dekglas.
- Houd bij 37 ° C en elke 4 dagen, verdund met vers groeimedium verrijkt met 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 en 0,75% glutamax.
- Van 07/06 DIV, na het zien van verbindingen tussen de eilanden, verdunnen medium met 10 ul / ml FUDR (25 mg deoxyuridine + 62,5 mg uridine in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) of een andere anti-mitotische middel aan gliale voorkomen begroeiing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een SU8-2075 schimmel op een silicium wafer met een functie dikte van ongeveer 100 urn werd gebruikt om de PDMS vormen. Het patroon werd uit vierkanten van verschillende afmetingen, met een zijlengte en afstand variërend tussen 200 en 700 urn (Figuur 1B). De afmeting van het vierkant werd gekozen om het gezichtsveld van een 10X passen (voor eilanden met een zijlengte <800 pm) en een 20X objectief (voor eilanden met een zijlengte <400 pm). Drie parameters, namelijk cel plating dichtheid, afstand tussen circuits, grootte schakelingen "zijn bepalend voor het verkrijgen monolagen of geclusterd schakelingen, alsmede opleggen en vorm hun connectiviteit. Echter, deze parameters niet onafhankelijk omdat, gegeven een vaste afstand tussen twee circuits, de kans dat zij spontaan een toename verbinding met de grootte van de schakelingen "vast. In het voorbeeld besproken in dit werk, voor kleine neuronale modules van ~ 300 x 300 micrometer, verbindingenwerden vastgesteld als de afstand niet groter dan ~ 300-400 urn, terwijl voor grote neuronale modules ~ 700 x 700 urn, verbindingen werden vastgesteld als de afstand kleiner dan ~ 700 urn. In het algemeen, door de afstand tussen de vierkanten was het mogelijk om de waarschijnlijkheid spontaan gegenereerde onderlinge verbindingen tussen de modules vast wijzigen passeren uit zeer verbonden modules die geïsoleerd.
Neuronale modules van ~ 600 x 600 pm worden weergegeven op 4 dagen in vitro (DIV; figuur 3A). Na enkele dagen in vitro neuronen liggen vaak in de beklede gebieden, terwijl het niet mogelijk is ontwikkeld neuronale processen en verbindingen observeren. Integendeel, 14 DIV (figuur 3B-C) neuronen richten verbindingen binnen en tussen modules. Terwijl grotere neuronale circuits van ~ 600 x 600 pm kon zichzelf organiseren in monolagen (Figuur 3A-C), circuits van Smaller dimensies (bijvoorbeeld ~ 300 x 300 urn in figuur 3D) neiging te clusteren. Teneinde de beste kalibratie krijgen voor tweedimensionale circuits, cellen werden met verschillende dichtheid variërend van 0,25 x 06-1 oktober x 10 6 cellen / 23 mm dekglas vastgemaakt op een 35 mm petrischaal. Voor grotere circuits van ~ 700 x 700 urn bleek dat 0,75 x 10 6 cellen / 23 mm dekglas vastgemaakt op een 35 mm petrischaal de optimale dichtheid die de vorming van monolaag circuits hun spontane interconnectie voorkomen induceert (Figuur 3C ). Hetzelfde resultaat van monolaag circuit werd in kleinere circuits van ~ 300 x 300 micrometer verkregen door platen 0,5 x 10 6 cellen / 23 mm dekglas bevestigd in een 35 mm petrischaal. In het algemeen, bij het overwegen cel plating dichtheid, is het belangrijk te benadrukken dat, zoals eerder besproken 7, neuronale en gliale cellen een aangeboren neiging cluster, zodat enige mate van clustering is bijna onvermijdelijk is na enige tijd in de cultuur. Echter waargenomen dat de verhoging bestemd voor het ondersteunen netwerkgebied de kans op overleving en hun mono- gelaagde ordening circuits zou verbeteren, waarschijnlijk vanwege een grotere concentratie van nutriënten in de extracellulaire ruimte. In elk geval is een trial and error benadering bij de optimale cel uitplaatdichtheid identificeren mono- gelaagde circuits calcium beeldvorming creëren. Elke 4 dagen werd het medium verdund met vers groeimedium. Van 07/06 DIV, na het zien van verbindingen tussen de eilanden, 10 ul / ml FUDR is toegevoegd aan gliale overgroei te voorkomen.
Figuur 4 toont de dynamiek van een modulaire netwerk opgenomen met calcium beeldvorming (uitgevoerd zoals beschreven in Bonifazi et al. 2013 8). Calcium- fluorescentie beelden werden verkregen met behulp van een 4X vergroting doelstelling, die in staat toezicht op de activiteit van het gehele netwerk (Figure 4A). Analyse van de calcium beeldvorming werd uitgevoerd zoals beschreven in Bonifazi et al. 2013 8. In figuur 4B raster plot van de calcium gebeurtenissen Onset weergeven van spontane activiteit wordt gepresenteerd (kleuren corresponderen met modules gemarkeerd in figuur 4A). Calcium beeldvorming werd uitgevoerd bij 30 Hz, en beeldgrootte bedraagt 1000 x 1000 pixels.
De groene en roze modules zijn zeer gesynchroniseerd zoals in het raster grafiek (Figuur 4B) in overeenstemming met hun dikke verbinden bundels, eventueel overeenkomt met een groot aantal verbindingen (figuur 4A). De blauwe en rode modules zijn zwak verbonden met de groene en roze modules en daarom zijn ze zo nu en dan gesynchroniseerd met hen (Figuur 4B). Een video van de opname is online beschikbaar (film M1).
Het beeld van een modulaire netwerk gegroeid op een MEA 21 DIV wordt getoond in figuur 5A. Ikn om de beste kalibratie voor tweedimensionale circuits bieden we geplateerd corticale cellen met verschillende dichtheid variërend van 250 x 10 3-500 x 10 3 cellen / per MEA. 250 x 10 3 cellen / per MEA (30 mm ring) leverde betere resultaten in termen van de vorming van monolaag circuits, terwijl hun spontane interconnectie voorkomen. Eenmaal gevormd neuronale netwerken zijn verwezenlijkt MEA substraat (figuur 5A), elektrofysiologische activiteit werd geanalyseerd met een commercieel systeem wordt gebruikt voor het verkrijgen en registreren van elektrofysiologische signalen. Spontane activiteit van culturen wordt gedetecteerd met behulp van de precieze timing Spike Detection (PTSS) algoritme 22.
Figuur 5B toont een raster grafiek overeenkomt met 5 min van spontane activiteit (alleen actieve elektroden zichtbaar) gekleurd gecodeerd volgens de clusternummer. Door te kijken naar deze percelen, is het mogelijk om kwalitatieve evaluatie te makenvan de activiteit van afzonderlijke clusters en het hele netwerk tegelijk. Met name is het mogelijk om een sterke synchronisatie van de opgenomen binnen elk cluster activiteiten observeren. Een video van een representatieve opname van gedessineerde culturen dan MEA is online beschikbaar (film M2).
Figuur 1. Silicium wafer. (A) De siliciumwafel (~ 4 inch diameter) gebruikt om de PDMS stencils vormen. Verschillende SU8 structuren vertegenwoordigen verschillende modulaire netwerken. (B) Vertegenwoordiger functie ontwerp geïmplementeerd op een silicium wafer voor modulaire netwerken bouw. Elke groene vlek definiëren een SU8 pijlerstructuur en derhalve het gebied voor een enkele module. De ontwerpen binnen het gestippelde zwarte rechthoek overeenkomen met drie verschillende sjablonen die worden gebruikt op standaard vierkante cultuur dekglaasjes van 23 mm zijde lenGTH. In elk stencil, een sterretje markeert een macro-regio voor de ondersteunende netwerk. Afhankelijk van de afstand tussen de vlekken, kan de eindige grootte circuit of modules kunnen spontaan neuronenverbindingen stand onder hen. Het ontwerp van de functies is gekozen om verschillende moduulmaat en tussen modules afstand creëren geïsoleerd of verbonden neuronale circuits die het gezichtsveld zou passen in andere doelstelling vergrotingen (4X, 10X en 20X bereiken; het gezichtsveld voor elke vergroting vertegenwoordigd door de rode vierkantjes). De kenmerken van de gestippelde zwarte rechthoek zijn ontworpen om het gelijktijdig gebruik van MEA en calcium imaging passen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2.PDMS structuren depositie op een MEA. (A) PDMS mal met een ringvorm (aangegeven met de rode pijl) gemonteerd op een MEA. De mal wordt gebruikt voor het bekleden bestemd ter ondersteuning van het neuronale netwerk en zich aan de rand van het kweken area (dit wordt beperkt door de ring gemonteerd op de MEA en gekenmerkt door de groene pijl). (B) Het instellen van een PDMS sjabloon het MEA met een micro manipulator. (C) PDMS stencil afgezet op het in MEA na uitlijning. (D) Afbeelding van een PDMS sjabloon op MEA met een 10x vergroting (elektrodeafstand 500 pm). Het is mogelijk om de gaten op de stencils mee in overeenstemming van de elektroden. De lijmlaag gunste van cellulaire adhesie zal worden gestort op de geopende gebieden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
ge = "always"> 
Heldere veld afbeelding van corticale modules van ~ 600 x 600μm (A) na 4 DIV en (B) na 14 DIV. (C) Figuur 3. Modulaire neuronale netwerken op verschillende DIV. Let op de spontane onderlinge verbindingen tussen de circuits na 14 DIV. Cellen werden op het optimale celdichtheid voor grote circuits te organiseren in monolagen, dat wil zeggen, 750 x 10 3 cellen / 23 mm dekglas bevestigd in een 35 mm petrischaal. (D) Met behulp van PDMS kenmerken van halve grootte en dezelfde cel concentratie, neuronale circuits georganiseerd in geclusterde structuren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 4. Calcium beeldvorming van modulaire netwerken. (A) Corticale cellen (18 DIV) geladen met de calcium-indicator OGB. Verschillende kleuren markeren verschillende modules. Het gezichtsveld is 2 x 2 mm. (B) Raster perceel van spontane activiteit. De verschillende kleuren komen overeen met de cellen in verschillende modules, zoals weergegeven in het paneel A. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. MEA opnemen van modulaire netwerken. (A) Modulaire netwerk (corticale neuronen, 21 DIV), bestaande uit 3 verschillende circuits geteeld op een 4Q MEA. Neuronale circuits ver ~ 600 urn verbonden met elkaar. (B) Raster tonende 5 min spontane elektrophysiological activiteit opnemen. C1, C2 en C3 respectievelijk overeenkomen met de linksboven, rechtsonder en activiteiten linksonder cluster, met verschillende kleuren gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een protocol 2D modulaire neuronale netwerken groeien in vitro samengesteld functioneel onderling verbonden circuits beschreven. De procedure is gebaseerd op een cellulair patroon brengen kleeflaag. Patroonvorming wordt bereikt met PDMS mallen reproduceren negatieve eigenschap van het gewenste netwerkarchitectuur. PDMS stencils bepalen de gebieden waar de cellulaire lijmlaag wordt afgezet. Zodra cellen worden verzilverd, ze spontaan verzamelen om de gecoate eilanden en zichzelf organiseren in actieve onderling verbonden circuits. Opnames van functionele modulaire netwerken opgenomen met MMO's en calcium beeldvorming werd gepresenteerd.
De gepresenteerde protocol is behoorlijk aangepast ten opzichte van de aanvankelijk gevolgde procedure. Allereerst problemen met uitlijning PDMS mallen hadden worden aangepakt. Sinds de uitlijning heeft in de eerste poging te bereiken (zodra de stencil de oppervlakte heeft aangeraakt, is het niet aanbevolen om het te verplaatsen), is deze kwestie te overwinnendoor af te zien van de handmatige procedure en de keuze voor een nieuwe methode die bestaat uit met behulp van een micro-manipulator voor nauwkeurige stencil depositie op de MEA opname gebied. Een ander probleem dat moest worden opgelost bestaat uit het voorkomen van de PDL druppel passeert onder de lijn stencil (anders gevormde ontwerp zou niet worden verkregen). Hiervoor nadat het sjabloon is uitgelijnd voordat de PDL druppel op het, de betrokken inrichting (MEA of dekglaasje) moet worden achtergelaten in de vacuümkamer voor een goede tijd waardoor een goede hechting van het op de oppervlak. Hetzelfde is mogelijk wanneer de PDL druppel op het stencil wordt geplaatst om de luchtbellen die zich vormen tussen de inrichting en de daling zelf waardoor de PDL in contact met het oppervlak te komen elimineren.
De kritische stappen van het beschreven protocol worden voorgesteld door: i) het spincoaten fase die moet garanderen om "openen replica" of ten minste een sufficilend dunne film via SU8 structuren die gemakkelijk kan worden verwijderd met een pincet, ii) de behandeling van het kweken oppervlak (dekglas of MEA), iii) de plaatsing van de PDMS sjablonen op het; iv) de bekleding fase omdat er gevallen waarbij, wanneer de PDMS masker niet goed af tegen het substraat waarop wordt geplaatst, kan het voorkomen dat de lijm eiwit passeert onder het masker waardoor het patroon compromitteren. Dus, het reinigingsproces van de dekglaasjes of MEA is van primair belang, evenals de uitlijning van de PDMS stencil. Goede prestaties van deze twee stappen waarborgen beste patroonvorming resultaten.
De beperkingen van deze techniek hebben ook te maken met zowel de elektrofysiologische en calcium beeldopname. In het eerste geval, een zeer lage ruimtelijke resolutie (4-8 elektroden in elke module) aanwezig komt zowel de afmetingen van de enkel circuit en de inter-elektrode distance. In het tweede geval het risico bestaat uit niet om de optimale cellulaire dichtheid waardoor het verkrijgen van een tweedimensionale cellaag, dus een enkele cel resolutie acquisitie voorkomen.
Deze strategie, die een zorgvuldige optimalisatie van de coating, assemblage en sterilisatie procedures en de oprichting van een aangepaste micro-uitlijning systeem vereist, gaf ons een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van eerder gerapporteerde werken (bv de lange termijn overleving van onze cellen, dwz tot 8 weken in vitro). Specifiek, gaf ons een meer stabiele en betrouwbare langdurige opsluiting 24 met betrekking tot strategieën op basis van chemische patronen 23-28.
De procedure is gebaseerd op plating corticale cellen op PDL-gecoate modules, die de zelf-organisatie van netwerken verzekert in neuronale assemblages verbonden door axonen en dendrieten bundels. Om wide-field calcium beeldvorming van de modulaire netto toestaanwerkt met een enkele cel resolutie, is het essentieel dat het neuronale systeem organiseert in een 2D-laag. Daarom is het essentieel om de dichtheid van de geplateerde cellen te optimaliseren voor zowel hoge dichtheid cellulaire clusters voorkomen of op andere uiterste modules lage dichtheid die tussen moduleverbinding waarschijnlijkheid verminderen.
Hoewel neuronale-gliale netwerken in cultuur verliezen hun in-vivo structurele organisatie, ze spontaan zichzelf te organiseren in actieve functionele circuits bieden de mogelijkheid om studies onder goed gecontroleerde experimentele omstandigheden uit te voeren. De tweedimensionale modulaire neuronale netwerken uit functioneel onderling verbonden circuits beschreven in dit protocol een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de dynamica van communicatie tussen neuronale samenstellingen en de capaciteit van structureel gedefinieerd neuronale netwerken groot repertoire van motieven genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Europese Project BRIANBOW (FP7 Young Explorers, zou De auteurs willen dr Jacopo Tessadori bedanken voor nuttig commentaar op het manuscript, en Silvia Chiappalone voor haar hulp bij het produceren van de graphics gebruikt in de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
