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Neuroscience

डिजाइन, उपचार, सेलुलर चढ़ाना, और कार्यात्मक आपस में जुड़े सर्किट से बना मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क का संवर्धन भूतल

Published: April 15, 2015 doi: 10.3791/52572
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 5, 3, 4, 1, 2, 1,4
1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि स्थानिक तक ही सीमित है, कार्यशील आपस में जुड़े neuronal सर्किट से मिलकर इन विट्रो मॉड्यूलर नेटवर्क में विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक polymeric मुखौटा संवर्धन सब्सट्रेट पर सेलुलर आसंजन को बढ़ावा देने के पैटर्न के लिए एक प्रोटीन की परत प्रयोग किया जाता है। मढ़वाया न्यूरॉन्स लेपित क्षेत्रों सहज कनेक्शन की स्थापना और electrophysiological गतिविधि प्रदर्शन पर बढ़ता है।

Abstract

मस्तिष्क समन्वित सक्रियण और neuronal विधानसभाओं के गतिशील संचार के माध्यम से चल रही है। एक प्रमुख खुला प्रश्न सबसे विविध मस्तिष्क कार्यों आबाद जो dynamical रूपांकनों का एक विशाल प्रदर्शनों की सूची, मस्तिष्क सर्किट का एक निश्चित और topological मॉड्यूलर संगठन से बाहर उभर सकता है। आंतरिक प्रयोगात्मक कठिनाइयों पेश जो neuronal सर्किट के vivo अध्ययनों की तुलना में, इन विट्रो तैयारी में हेरफेर और प्रयोगात्मक न्यूरोनल सिस्टम की, संरचनात्मक dynamical और रासायनिक गुणों की जांच के लिए एक बहुत बड़ा संभावना प्रदान करते हैं। इस काम के स्थानिक अलग, कार्यात्मक परस्पर न्यूरोनल विधानसभाओं द्वारा रचित मॉड्यूलर नेटवर्क की बढ़ती अनुमति देता है एक में इन विट्रो प्रयोगात्मक कार्यप्रणाली का वर्णन है। प्रोटोकॉल के topological जटिलता के विभिन्न स्तरों पर neuronal नेटवर्क के दो-आयामी (2 डी) वास्तुकला को नियंत्रित करने की अनुमति देता है।

एक वांछित नेटवर्क patterning के हो सकते हैंनियमित रूप से कवर फिसल जाता है और सब्सट्रेट एम्बेडेड माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों पर दोनों हासिल की। Micromachined संरचनाओं एक सिलिकॉन वेफर पर उभरा और इच्छित नेटवर्क वास्तुकला के नकारात्मक सुविधाओं को शामिल जो biocompatible है बहुलक स्टेंसिल, बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। स्टेंसिल सेलुलर आसंजन को बढ़ावा देने के लिए एक आणविक परत के साथ सतह कोटिंग प्रक्रिया के दौरान संवर्धन substrates पर रखा जाता है। स्टेंसिल के हटाने के बाद, न्यूरॉन्स चढ़ाया जाता है और वे अनायास लेपित क्षेत्रों के लिए निर्देशित कर दिये। अंतर-कम्पार्टमेंट दूरी कम करके, यह अलग या परस्पर या तो neuronal सर्किट प्राप्त करने के लिए संभव है। सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए, कोशिकाओं संस्कृति पकवान की परिधि में स्थित है जो एक का समर्थन neuronal नेटवर्क के साथ सह-सुसंस्कृत हैं। सब्सट्रेट एम्बेडेड माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके क्रमशः प्राप्त मॉड्यूलर नेटवर्क की गतिविधि के electrophysiological और ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग प्रस्तुत कर रहे हैं। प्रत्येक मॉड्यूल spont से पता चलता है, जबकिaneous वैश्विक सिंक्रनाइज़ेशंस, अंतर मॉड्यूल तुल्यकालन की घटना सर्किट के बीच कनेक्शन के घनत्व के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

Introduction

प्रायोगिक और सैद्धांतिक सबूतों मस्तिष्क क्षणिक एक दूसरे को आकार देने और अंतर्निहित अलग मस्तिष्क राज्यों के साथ बातचीत कि गतिशील कार्यात्मक इकाइयों के रूप में माना जा सकता है, जो सेल विधानसभाओं 1-5 की समन्वित सक्रियण, के माध्यम से संचालित की संभावना है कि समर्थन करते हैं। कार्यात्मक प्रतिरूपकता भी पर निर्भर है और मस्तिष्क सर्किट 6,7 के संरचनात्मक मॉड्यूलर संगठन के साथ जुड़ा हुआ है। कैसे समारोह और मस्तिष्क सर्किट की संरचना परस्पर एक दूसरे को आकार अभी भी तंत्रिका विज्ञान में मुख्य खुला सवालों में से एक है। इस सवाल का एक गहरी समझ प्रदान करने के लिए है, इसे संबोधित करने के लिए संभव है, जहां कम से कम आंशिक रूप से, उन मुद्दों इष्टतम प्रयोगात्मक व्यवस्थाएं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन विवो प्रयोगों में neuronal नेटवर्क के spatio- लौकिक गतिशीलता के हेरफेर नियंत्रित चूंकि इन विट्रो neuronal नेटवर्क मॉडल के विकास के कारण उनके लिए आसान एसीसी के लिए महत्वपूर्ण ब्याज की है, चुनौती दे रहा हैessibility, निगरानी, ​​हेरफेर और 8,9 मॉडलिंग। हाल के वर्षों में, उन्नत सब्सट्रेट patterning के तरीकों द्वारा समर्थित विट्रो प्रौद्योगिकियों में पूर्वनिर्धारित मॉड्यूलर संरचनाओं तीन की एक श्रृंखला विकसित करने के लिए और लगाया टोपोलोजी 10 के साथ नेटवर्क के कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए neuronal नेटवर्क प्रेरित करने के लिए अनुमति दी है। विशेष रूप से, विधियों हाल ही में शारीरिक बाधाओं 4,11 लगाने से नेटवर्क व्यवस्थित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। दरअसल, neuronal नेटवर्क में संरचना और समारोह के बीच की कड़ी का अध्ययन करने और neuronal विधानसभाओं बातचीत का एक सरल लेकिन प्रशंसनीय प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए इन विट्रो सिस्टम आपस में जुड़े न्यूरोनल उप आबादी प्रदान करना चाहिए। व्यापक रूप से अध्ययन 2D समरूप neuronal संस्कृतियों सर्किट के स्वयं संगठित आकस्मिक तारों पर किसी भी स्थानिक बाधाओं लागू नहीं है। इसलिए एक संभव दृष्टिकोण विवाद में अलग neuronal आबादी की स्थिति के लिए कृत्रिम रूप से परस्पर सेल विधानसभाओं है आकार करने के लिएially अलग क्षेत्रों। इन क्षेत्रों के बीच दूरी इंटर विधानसभाओं कनेक्शन नहीं रोकता है। नेटवर्क जटिलता पर एक काफी नियंत्रण सुनिश्चित करते हुए यह दृष्टिकोण, तुल्यकालन मॉडल 6,7,12 के एक अमीर प्रदर्शनों की सूची उपलब्ध कराने के लिए दिखाया गया है।

मॉड्यूलर न्यूरोनल विधानसभाओं की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संवर्धन की सुविधा के लिए आदेश में, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया और वर्णन किया गया है axons और dendrites से जुड़े न्यूरोनल समूहों में नेटवर्क की आत्म संगठन को इकट्ठा करने के लिए। neuronal संस्कृतियों के भौतिक प्रसूति के लिए बहुलक संरचना polydimtheylsiloxane (PDMS) से बनाया गया है। PDMS व्यापक रूप से गैसों से 13 अपने biocompatibility, पारदर्शिता और पारगम्यता के कारण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल एक elastomer है। PDMS स्पिन कोटिंग जैकमैन एट अल में पहले से वर्णित के रूप में एक 'मास्टर' पर एक तरल PDMS। 16 टी द्वारा 2075 14,15 संरचनाओं तैयार है और micromachined SU8 से बाहर रखा गया हैवह अलग-अलग आकार के आपस में जुड़े मॉड्यूल से बना रहे हैं neuronal नेटवर्क नमूनों हासिल की है और वे सफलतापूर्वक दोनों coverslips और माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों (meas) 17-20 पर प्राप्त किया गया है। मॉड्यूल के बीच कनेक्शन का घनत्व मॉड्यूल के बीच तुल्यकालन के क्षणिक राज्य अमेरिका के लिए, वर्दी संस्कृतियों के ठेठ एक पूरी तरह से सिंक्रनाइज़ नेटवर्क, से, नेटवर्क तुल्यकालन की सुविधाओं को बदल सकते हैं।

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Protocol

प्रक्रिया देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए एनआईएच मानकों के अनुसार किया गया था और तेल-अवीव विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति (परमिट नंबर - एल-14-019) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

उपकरण और PDMS की 1. तैयारी

  1. वेफर तैयार करें (सामग्री की तालिका, या एक microfabrication प्रयोगशाला से वेफर आदेश), एक स्केलपेल, और चिमटी की एक जोड़ी - नसबंदी की जरूरत नहीं है।
  2. निम्नलिखित शर्तों के अनुसार पाली डी lysine (पीडीएल) समाधान करें: 4 मिलीग्राम / 0.1 एम borate बफर में मिलीलीटर, पीएच 8, और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. निम्नलिखित प्रक्रिया के अनुसार PDMS स्टेंसिल तैयार:
    1. आधार और 10 के अनुपात के साथ इलाज एजेंट एक साथ मिश्रण से polydimethylsiloxane (PDMS, सिलिकॉन elastomer) तैयार: 1, तो लगभग 5 मिनट के लिए दो पदार्थों हलचल।
    2. 15 मिनट के लिए दो बार निर्वात चैम्बर में हर बार प्लेस और सत्यापित बुलबुले चले गए हैं।
    3. कब, गैस के उपयोग की अनुमति देने के लिए खुला नाइट्रोजन knobs के स्पिनर पर सिलिकॉन वेफर (चित्रा 1 ए) जगह है, और बढ़ने से रोकने के लिए वैक्यूम का उपयोग करें: PDMS स्पिन coater तैयार करते हैं, के लिए तैयार है।
    4. वेफर से अधिक PDMS डालो और 1000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिनर को सक्रिय (लगभग 100 माइक्रोन ऊंचाई बनाता है)।
    5. 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर रखें।
    6. PDMS कठोर गया है, पाश्चर विंदुक का उपयोग, PDMS के साथ स्टैंसिल की सीमाओं की रूपरेखा तैयार। 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर रखें।
    7. PDMS सीमाओं को कठोर कर दिया है, सीमाओं के अनुसार स्टेंसिल कटौती और वेफर से सिलिकॉन स्टैंसिल बंद छील करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें (एक ही पैटर्न युक्त चुकता PDMS)।

2. पेट्री डिश और कवर पर्ची तैयारी

  1. निम्नलिखित आदेश के अनुसार 23 मिमी वर्ग गिलास को कवर फिसल जाता है तैयार करने और उन्हें साफ:
    1. आसुत जल, 70% इथेनॉल, और एसीटोन के साथ धोएं।
    2. नाइट्रोजन के साथ isopropanol और तेजी से शुष्क के साथ धोएं।
  2. Coverslip पर नमूनों PDMS स्टेंसिल प्लेस, और धीरे वे दृढ़ता से कांच की सतह से जुड़े होते हैं कि सत्यापित करने के लिए दबाएँ। 15 मिनट के लिए निर्वात चैम्बर में रखें।
  3. स्टैंसिल पर पीडीएल के 1 मिलीलीटर गिरा। दो बार 20 मिनट के लिए हर बार निर्वात चैम्बर में coverslip डालें, और सूखे के लिए पीडीएल हे / एन छोड़ दें।
  4. एक का समर्थन सेल नेटवर्क बनाने के लिए पेट्री डिश तैयार:
    1. आर टी में 2 घंटे के लिए पीडीएल के 1 मिलीलीटर के साथ पकवान (3.5 सेमी) की सतह को कवर। एक विंदुक का उपयोग पीडीएल बूंद निकालें।
    2. आसुत जल से धो और सूखी छोड़ दें। Coverslip के प्रत्येक कोने पर सिलिकॉन तेल की एक बहुत ही छोटी सी बूंद रखें।
  5. कुर्की सत्यापित करने के लिए धीरे पेट्री डिश (यानी, PDMS के ऊपर का सामना करना पड़ जाना चाहिए) और प्रेस के केंद्र पर coverslip जगह।
  6. धीरे चिमटी का उपयोग coverslip से PDMS हटा दें। नसबंदी के लिए, 7 मिनट के लिए यूवी रोशनी को बेनकाब।
Le "> 3। मल्टी इलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) की तैयारी

  1. इस आदेश (सामग्री की तालिका) में स्वच्छ विदेश मंत्रालय:
    1. एक केंद्रित, एंजाइमी डिटर्जेंट में नल और sonicate के तहत पानी के साथ तीन बार धोएं।
    2. आसुत जल 3 बार में sonicate।
    3. 30 मिनट के लिए यूवी के तहत आसुत 3 बार के लिए (हुड में, 1000 μl टिप) पानी और जगह के साथ धोएं।
  2. नेटवर्क तैयारी सहायक:
    1. डिज़ाइन किया समर्थन नेटवर्क ढालना तैयार करें।
      1. एक 12 अच्छी तरह से थाली (22 मिमी व्यास) में PDMS डालो।
      2. PDMS ढालना बाहर ले और एक स्केलपेल का उपयोग कठोर है, जब एक अंगूठी आकार बनाने के लिए बीच में एक छेद में कटौती।
      3. विदेश मंत्रालय (2A चित्रा) के केंद्र पर एक डिजाइन समर्थन नेटवर्क मोल्ड प्लेस और आरटी पर 2 घंटे के लिए पीडीएल के साथ सतह के बाकी को कवर किया।
    2. पिपेट का उपयोग पीडीएल निकालें और आसुत जल से धो लें।
    3. मोल्ड निकालें और (2A चित्रा) सूखने के लिए छोड़ दें। </ ली>
  3. निम्नलिखित तरीके में विदेश मंत्रालय को स्टैंसिल संरेखित:
    1. नामित सूक्ष्म जोड़तोड़ पर स्टैंसिल रखें। सही रूप में इलेक्ट्रोड के लिए नमूनों संरचना संरेखित, और यह विदेश मंत्रालय की सतह (चित्रा 2B) पर रखा गया है जब तक स्टैंसिल कम करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: एक अच्छी तरह से साफ विदेश मंत्रालय के साथ संपर्क PDMS और विदेश मंत्रालय खुद के बीच प्रतियोगी आसंजन प्रदान करता है।
    2. Micromanipulator के लिफ्ट और यदि आवश्यक हो तो, यह विदेश मंत्रालय से detaching को रोकने के लिए PDMS के ऊपर दबाव की एक छोटी राशि लागू करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
    3. धीरे विदेश मंत्रालय की सतह के लिए स्टैंसिल दबाएँ, और यह दृढ़ता से संलग्न है, और अच्छी तरह से गठबंधन किया है सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। (चित्रा -2 डी)।
  4. 15 मिनट के लिए निर्वात चैम्बर में विदेश मंत्रालय रखें; स्टैंसिल पर पीडीएल के 1 मिलीलीटर बूंद डाल दिया।
  5. 20 मिनट प्रत्येक के लिए निर्वात चैम्बर में 2 बार डालें। इनक्यूबेटर में हे / एन सुखाने के लिए पीडीएल छोड़ दें।
  6. चढ़ाना पहले, meas से PDMS स्टेंसिल को हटाने और डब्ल्यू बाँझ का उपयोग कर धोनेअटर। सात मिनट के लिए यूवी रोशनी के तहत रखें।

4. विच्छेदन और संस्कृति

  1. हार्ज़ोग एट अल। 2011 21 में वर्णित के रूप में संस्कृतियों तैयार करें।

5. चढ़ाना

  1. एक hemocytometer (परिणाम में चर्चा के रूप में सर्किट के आकार के अनुसार इष्टतम घनत्व) का उपयोग कर, चढ़ाना के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना।
    1. यकीन गिनती चैम्बर (hemocytometer) बनाओ साफ है और उस पर एक कवर पर्ची (साफ करने के लिए उपयोग शराब) रखें।
    2. मध्यम (कमजोर पड़ने 1:20) चढ़ाना के 190 μl में सेल निलंबन के 10 μl पतला।
    3. लोड 10 गिनती चैम्बर के किनारे पर पतला कोशिकाओं के μl और धीरे-धीरे खुद को भरने के लिए चैम्बर की इजाजत दी कोशिकाओं बाहर विंदुक।
    4. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, रुधिरकोशिकामापी ग्रिड कल्पना। प्रत्यक्ष गिनती द्वारा चैम्बर में कोशिकाओं की संख्या (स्वस्थ कोशिकाओं दौर होना चाहिए) निर्धारित करते हैं। बड़े वर्ग witho भीतर कोशिकाओं की गणनाकिनारों को पार करने के लिए उन ut।
    5. कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना:
      कोशिकाओं की कुल संख्या / 1000 μl = कमजोर पड़ने कारक × × 10 4 (hemocytometer का क्षेत्र) में गिना कुल कोशिकाओं।
      नोट: उदाहरण के लिए, अगर कमजोर पड़ने कारक 20 था और गिना कुल कोशिकाओं 100 थे:
      100 × 20 × 10 = 4 0.1 10 x 7 कोशिकाओं / 1000 μl या 1 एक्स 10 6/100 μl। 0.75 x 10 6 कोशिकाओं थाली करने के लिए आदेश में, कोशिकाओं के बाहर 75 μl ले।
  2. एकल विदेश मंत्रालय या पेट्री डिश प्रति चढ़ाना के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या में ले एकत्रीकरण को रोकने के लिए कोशिकाओं resuspend, और patternate क्षेत्र के शीर्ष पर, केंद्र में उन्हें प्लेट (यदि आवश्यक हो तो, यह मध्यम में कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए संभव है) । विदेश मंत्रालय के लिए, बीच में एक 100 μl बूंद जगह है। कवर पर्ची के लिए, बीच में एक 1000 μl बूंद जगह है।
  3. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर चढ़ाया कोशिकाओं को सेते हैं। एक अप करने के लिए, चढ़ाया कोशिकाओं को चढ़ाना मध्यम जोड़ेंविदेश मंत्रालय के प्रति मिलीलीटर और कवर पर्ची प्रति 2 मिलीलीटर।
  4. 0.5 पेन Strep, 2% बी -27 और 0.75% glutamax के साथ समृद्ध ताजा मध्यम विकास के साथ पतला, हर 4 दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और।
  5. या glial को रोकने के लिए किसी भी अन्य विरोधी mitotic एजेंट 07/06 div से, द्वीपों के बीच कनेक्शन को देखने के बाद, 10 μl के साथ मध्यम पतला / एमएल FUDR (12.5 मिलीलीटर सदस्य (न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल) में 25 मिलीग्राम deoxyuridine + 62.5 मिलीग्राम uridine) अतिवृद्धि।

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Representative Results

लगभग 100 माइक्रोन की एक विशेषता मोटाई के साथ एक सिलिकॉन वेफर पर एक SU8-2075 ढालना PDMS के आकार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पैटर्न एक ओर लंबाई और दूरी 200 के बीच और 700 माइक्रोन (चित्रा 1 बी) के साथ अलग, कई आयामों के वर्गों से बना था। वर्ग के आकार और एक 20x उद्देश्य के (एक पक्ष लंबाई <400 माइक्रोन के साथ द्वीपों के लिए) (एक पक्ष लंबाई <800 माइक्रोन के साथ द्वीपों के लिए) एक 10X के दृश्य के क्षेत्र फिट करने के लिए चुना गया था। तीन मानकों, सर्किट के बीच अर्थात् सेल चढ़ाना घनत्व, दूरी, सर्किट 'आकार monolayers या क्लस्टर सर्किट प्राप्त करने के साथ ही थोपना और उनके कनेक्टिविटी को आकार के लिए निर्धारक हैं। हालांकि, इन मापदंडों वे अनायास सर्किट 'के आकार के साथ एक कनेक्शन वृद्धि की स्थापना की संभावना है कि, दो सर्किट के बीच एक निश्चित दूरी दिया, के बाद से स्वतंत्र नहीं हैं। ~ 300 के छोटे न्यूरोनल मॉड्यूल के लिए, इस काम में चर्चा उदाहरण में एक्स 300 माइक्रोन, कनेक्शनदूरी ~ 300 से बड़ा नहीं था जब स्थापित किए गए थे - 400 माइक्रोन, जबकि की बड़ी न्यूरोनल मॉड्यूल के लिए ~ दूरी छोटे ~ 700 से माइक्रोन था जब 700 X 700 माइक्रोन, कनेक्शन स्थापित किए गए थे। सामान्य में, चौराहों के बीच की दूरी को बढ़ाने के द्वारा यह अलग लोगों के लिए अत्यधिक जुड़ा मॉड्यूल से गुजर रहा है, मॉड्यूल के बीच अनायास उत्पन्न अंतर कनेक्शन स्थापित करने की संभावना को बदलने के लिए संभव था।

~ 600 X 600 माइक्रोन इन विट्रो में चार दिनों में दिखाया जाता है की neuronal मॉड्यूल (DIV, चित्रा 3A)। इन विट्रो न्यूरॉन्स में कुछ दिनों ज्यादातर लेपित क्षेत्रों के भीतर स्थित हैं के बाद इसे विकसित neuronal प्रक्रियाओं और कनेक्शन का निरीक्षण करने के लिए संभव नहीं है। 14 DIV पर इसके विपरीत, (चित्रा 3 बी-सी) न्यूरॉन्स के भीतर और मॉड्यूल के बीच कनेक्शन स्थापित। ~ 600 X 600 माइक्रोन का बड़ा neuronal सर्किट (चित्रा 3 ए-सी), सर्किट smalle की monolayers में स्वयं को व्यवस्थित कर सकता हैआर आयाम (जैसे, ~ 300 चित्रा 3 डी में एक्स 300 माइक्रोन) क्लस्टर जाती थी। इसलिए, दो आयामी सर्किट के लिए सबसे अच्छा अंशांकन प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं अलग घनत्व एक 35 मिमी पेट्री डिश में संलग्न 0.25 एक्स 10 6 6 कोशिकाओं / 23 10 एक्स 1 मिमी कवर पर्ची से बदलती के साथ चढ़ाया गया। ~ 700 X 700 माइक्रोन की बड़ी सर्किट के लिए हम एक 35 मिमी पेट्री डिश में संलग्न 0.75 x 10 6 कोशिकाओं / 23 मिमी कवर पर्ची monolayer सर्किट उनकी सहज इंटर कनेक्शन रोक नहीं के गठन को प्रेरित करता है जो इष्टतम घनत्व (चित्रा -3 सी पाया है कि )। monolayer सर्किट का ही परिणाम एक 35 मिमी पेट्री डिश में संलग्न 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / 23 मिमी कवर पर्ची चढ़ाना द्वारा एक्स 300 माइक्रोन ~ 300 के छोटे सर्किट में प्राप्त हुई थी। सेल चढ़ाना घनत्व, जब यह पहले से 7, neuronal और glial कोशिकाओं क्लस्टर के लिए एक सहज प्रवृत्ति है चर्चा के रूप में सामान्य में, यह, कि उजागर करने के लिए सीएल की तो कुछ डिग्री के लिए महत्वपूर्ण हैustering संस्कृति में कुछ समय के बाद लगभग अपरिहार्य है। हालांकि, हम समर्थन नेटवर्क के लिए किस्मत क्षेत्र में वृद्धि शायद बाह्य अंतरिक्ष में पोषक तत्वों का एक बड़ा एकाग्रता की वजह से, सर्किट 'अस्तित्व और उनके मोनो स्तरों पर संगठन की संभावना में वृद्धि होगी कि मनाया। किसी भी मामले में, एक परीक्षण और त्रुटि दृष्टिकोण कैल्शियम इमेजिंग के लिए मोनो स्तरों सर्किट बनाने के लिए इष्टतम सेल चढ़ाना घनत्व की पहचान करने के लिए आवश्यक है। हर 4 दिन मध्यम ताजा मध्यम विकास के साथ पतला था। 07/06 से div, द्वीपों के बीच कनेक्शन को देखने के बाद, 10 μl / एमएल FUDR glial अतिवृद्धि को रोकने के लिए जोड़ा गया है।

चित्रा 4 एक मॉड्यूलर नेटवर्क के गतिशील (Bonifazi एट अल। 2013 8 में वर्णित के रूप में प्रदर्शन) कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कर दर्ज दिखाता है। कैल्शियम FL uorescence छवियों Figur (पूरे नेटवर्क की गतिविधि की निगरानी सक्षम है, जो एक 4X बढ़ाई उद्देश्य, का उपयोग कर हासिल किया गयाई -4 ए)। Bonifazi एट अल। 2013 8 में वर्णित के रूप में कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण किया गया था। कैल्शियम की घटनाओं की 4B चित्रा रेखापुंज साजिश में सहज गतिविधि प्रदर्शित कर (रंगों चित्रा -4 ए में चिह्नित मॉड्यूल के अनुरूप) प्रस्तुत किया है शुरुआत। कैल्शियम इमेजिंग 30 हर्ट्ज पर प्रदर्शन किया गया था, और छवि का आकार 1000 x 1000 पिक्सल है।

संभवतः कनेक्शन की एक बड़ी संख्या (चित्रा -4 ए) के लिए इसी उनकी मोटी जोड़ने बंडलों के साथ समझौते में रेखापुंज साजिश (4B चित्रा) के रूप में दिखाया हरे और गुलाबी मॉड्यूल अत्यधिक सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं। नीले और लाल मॉड्यूल दुर्बलता से हरे और गुलाबी मॉड्यूल से जुड़ा है और इसलिए वे उन्हें कभी कभी (4B चित्रा) के साथ सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं। रिकॉर्डिंग का एक वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन (फिल्म एम 1) है।

21 DIV में विदेश मंत्रालय पर उगाया एक मॉड्यूलर नेटवर्क की छवि चित्रा 5A में दिखाया गया है। मैंदो आयामी सर्किट के लिए सबसे अच्छा अंशांकन प्राप्त करने के लिए n आदेश, हम अलग अलग घनत्व विदेश मंत्रालय के प्रति / 500 X 10 3 कोशिकाओं के लिए 250 एक्स 10 3 से बदलती के साथ cortical कोशिकाओं चढ़ाया। उनके सहज इंटर कनेक्शन रोक नहीं है, जबकि 250 एक्स 10 3 कोशिकाओं / विदेश मंत्रालय के अनुसार (30 मिमी अंगूठी), monolayer सर्किट के गठन के मामले में बेहतर परिणाम दे दी है। एक बार जब नमूनों neuronal नेटवर्क electrophysiological गतिविधि प्राप्त करने और electrophysiological संकेतों की रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक वाणिज्यिक प्रणाली का उपयोग करते हुए नजर रखी गई है, MEAS सब्सट्रेट (चित्रा 5A) पर हासिल किया गया है। संस्कृतियों की सहज गतिविधि सटीक समय स्पाइक जांच (पीटीएसडी) एल्गोरिथ्म 22 का उपयोग करते हुए पाया जाता है।

चित्रा 5 ब क्लस्टर संख्या के हिसाब से कोडित रंग का सहज गतिविधि के 5 मिनट (केवल सक्रिय इलेक्ट्रोड दिखाई दे रहे हैं) के लिए इसी एक रेखापुंज साजिश को दिखाती है। इन भूखंडों को देख कर, यह गुणात्मक आकलन करना संभव हैएकल समूहों के लिए और एक ही समय में पूरे नेटवर्क की गतिविधि की। विशेष रूप से, यह प्रत्येक क्लस्टर के भीतर दर्ज की गतिविधियों के बीच एक मजबूत तुल्यकालन निरीक्षण करने के लिए संभव है। विदेश मंत्रालय से अधिक नमूनों संस्कृतियों से एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग का एक वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन (फिल्म M2) है।

चित्र 1
1. सिलिकॉन वेफर चित्रा। (ए) सिलिकॉन वेफर (~ 4 इंच व्यास) PDMS स्टेंसिल मोल्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है। विभिन्न SU8 संरचनाओं अलग मॉड्यूलर नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करते हैं। मॉड्यूलर नेटवर्क के निर्माण के लिए एक सिलिकॉन वेफर पर कार्यान्वित (बी) के प्रतिनिधि सुविधा डिजाइन। प्रत्येक हरी हाजिर एक मॉड्यूल के लिए एक SU8 स्तंभ संरचना और इसलिए इस क्षेत्र को परिभाषित। धराशायी काला आयत के भीतर डिजाइन 23 मिमी पक्ष लेन के मानक वर्ग संस्कृति coverslips पर इस्तेमाल किया जा सकता है, जो तीन अलग अलग स्टेंसिल के अनुरूपgth। प्रत्येक स्टैंसिल में, एक तारांकित समर्थन नेटवर्क के लिए एक वृहद क्षेत्र के निशान। स्पॉट के बीच की दूरी पर निर्भर करता है, परिमित आकार सर्किट या मॉड्यूल उनके बीच सहज neuronal कनेक्शन स्थापित करने में सक्षम हो सकता है। सुविधाओं की डिजाइन अलग उद्देश्य आवर्धन में (4X, 10x और 20X देखने के क्षेत्र फिट सकता है जो अलग या परस्पर neuronal सर्किट प्राप्त करने के लिए विभिन्न मॉड्यूल आकार और अंतर-मॉड्यूल दूरी बनाने के लिए चुना गया था, प्रत्येक बढ़ाई के लिए देखने के क्षेत्र है लाल वर्गों द्वारा प्रतिनिधित्व)। धराशायी काला आयत से बाहर सुविधाओं को विदेश मंत्रालय और कैल्शियम इमेजिंग के एक साथ उपयोग के लायक बनाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2।PDMS संरचनाओं एक विदेश मंत्रालय पर बयान। (लाल तीर के साथ चिह्नित) एक अंगूठी के आकार के साथ (ए) PDMS ढालना एक विदेश मंत्रालय पर मुहिम शुरू की। एक PDMS स्टैंसिल के सांचे का समर्थन neuronal नेटवर्क के लिए किस्मत और संवर्धन के क्षेत्र की परिधि में स्थित क्षेत्र कोट करने के लिए प्रयोग किया जाता है (इस अंगूठी के द्वारा सीमित है विदेश मंत्रालय पर मुहिम शुरू की और हरे रंग का तीर द्वारा चिह्नित) है। (बी) के संरेखण विदेश मंत्रालय पर एक माइक्रो जोड़तोड़ का उपयोग कर। संरेखण के बाद विदेश मंत्रालय पर जमा पर (सी) PDMS स्टैंसिल। एक 10x बढ़ाई उपयोग करते हुए विदेश मंत्रालय पर एक PDMS स्टैंसिल (डी) छवि (इंटर-इलेक्ट्रोड दूरी 500 माइक्रोन है)। यह इलेक्ट्रोड के पत्राचार में स्टेंसिल पर छेद नोट करने के लिए संभव है। सेलुलर आसंजन पक्ष चिपकने वाला परत ही खोला क्षेत्रों पर जमा हो जाएगा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जीई = "हमेशा"> चित्र तीन
अलग DIV पर 3. मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क चित्रा। ~ 600 X 600μm (ए) के cortical मॉड्यूल 14 डिव। (सी) के बाद 4 DIV और (बी) के बाद के उज्ज्वल क्षेत्र छवि 14 DIV के बाद सर्किट के बीच सहज interconnections के नोट। सेल, बड़े सर्किट monolayers में व्यवस्थित करने के लिए इष्टतम सेल घनत्व पर चढ़ाया गया, यानी आधे आकार और एक ही सेल एकाग्रता के PDMS सुविधाओं का उपयोग करते हुए 750 एक्स 10 3 कोशिकाओं एक 35 मिमी पेट्री डिश में संलग्न / 23 मिमी कवर पर्ची। (डी), क्लस्टर संरचनाओं में संगठित neuronal सर्किट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

highres.jpg "चौड़ाई =" 700 "/>
मॉड्यूलर नेटवर्क के चित्रा 4. कैल्शियम इमेजिंग। कैल्शियम सूचक OGB के साथ भरी हुई (ए) cortical कोशिकाओं (18 DIV)। अलग अलग रंग अलग मॉड्यूल के निशान। देखने के क्षेत्र। 2 एक्स 2 मिमी है सहज गतिविधि का (बी) रेखापुंज साजिश है। पैनल ए में दिखाया के रूप में अलग अलग रंग अलग मॉड्यूल के भीतर कोशिकाओं के अनुरूप इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
मॉड्यूलर नेटवर्क के चित्रा 5. विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग। (ए) एक 4Q विदेश मंत्रालय पर उगाया तीन अलग सर्किट से बना मॉड्यूलर नेटवर्क (cortical न्यूरॉन्स, 21 DIV)। Neuronal सर्किट ~ एक दूसरे से 600 माइक्रोन परस्पर दूर कर रहे हैं। (बी) रेखापुंज साजिश सहज electr के 5 मिनट के दिखाophysiological गतिविधि रिकॉर्डिंग। सी 1, सी 2 और सी 3 ऊपरी बाएँ, निचले दाहिने और निचले बाएँ क्लस्टर की गतिविधियों के लिए अलग अलग रंग में प्रकाश डाला, क्रमशः अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कार्यात्मक आपस में जुड़े सर्किट से बना विट्रो में 2 डी मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रक्रिया एक सेलुलर चिपकने वाला परत patterning पर आधारित है। Patterning PDMS स्टेंसिल वांछित नेटवर्क वास्तुकला के नकारात्मक सुविधा reproducing के साथ हासिल की है। PDMS स्टेंसिल सेलुलर चिपकने वाला परत जमा है उन क्षेत्रों में जहाँ परिभाषित करते हैं। कोशिकाओं चढ़ाया जाता है एक बार, वे अनायास लेपित द्वीपों के लिए इकट्ठा करने और सक्रिय आपस में जुड़े सर्किट में स्वयं का आयोजन। Meas और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कर दर्ज कार्यात्मक मॉड्यूलर नेटवर्क की रिकॉर्डिंग पेश किया गया।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल विधिवत शुरू में अपनाई गई प्रक्रिया की तुलना में संशोधित किया गया है। सबसे पहले, PDMS स्टेंसिल 'संरेखण के साथ समस्याओं को संबोधित किया जा सकता था। संरेखण (स्टैंसिल सतह को छुआ है एक बार, इसे स्थानांतरित करने के लिए सिफारिश नहीं है) पहले ही प्रयास में हासिल हो गया है के बाद से इस समस्या को दूर कर दिया गया गया हैमैनुअल प्रक्रिया को छोड़ने और विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग क्षेत्र पर सटीक स्टैंसिल बयान के लिए एक माइक्रो जोड़तोड़ का उपयोग कर के होते हैं, जो एक नई विधि के लिए चुनने के द्वारा। संबोधित किया जा सकता था कि एक और मुद्दा गठबंधन स्टैंसिल के नीचे गुजर से पीडीएल बूंद को रोकने में होते हैं (अन्यथा नमूनों डिजाइन प्राप्त नहीं किया जा सकता है)। स्टैंसिल गठबंधन और उस पर पीडीएल ड्रॉप, माना डिवाइस (विदेश मंत्रालय या coverslip) डालने से पहले किया गया है एक बार ऐसा करने के लिए इस प्रकार पर यह एक अच्छा लगाव उपलब्ध कराने के समय का एक उचित अवधि के लिए निर्वात चैम्बर में नहीं छोड़ा जा सकता है सतह। पीडीएल बूंद डिवाइस और ड्रॉप से ​​ही इस प्रकार पीडीएल की सतह के साथ संपर्क में प्राप्त करने की अनुमति के बीच कि फार्म हवाई बुलबुले को खत्म करने के क्रम में स्टैंसिल पर रखा गया है एक बार ही किया जा चुका है।

मैं) की गारंटी चाहिए जो स्पिन कोटिंग चरण "खुला प्रतिकृतियां" पाने के लिए या कम से कम, एक suffici: वर्णित प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैंआसानी से चिमटी का उपयोग कर हटाया जा सकता है कि SU8 संरचनाओं से अधिक ently पतली फिल्म, द्वितीय) संवर्धन सतह (कवर पर्ची या विदेश मंत्रालय) के उपचार, iii) उस पर PDMS स्टेंसिल की नियुक्ति, चतुर्थ) मामलों कोटिंग चरण के बाद से वहाँ जो, में PDMS मुखौटा तैनात है, जिस पर सब्सट्रेट के खिलाफ ठीक से सील नहीं करता है, तो यह मुखौटा इस प्रकार patterning के कोई समझौता नीचे चिपकने वाला प्रोटीन से गुजरता है कि हो सकता है। तो, कवर फिसल जाता है या MEAS की सफाई की प्रक्रिया के प्राथमिक महत्व के साथ ही PDMS स्टैंसिल के संरेखण की है। इन दो चरणों का उचित प्रदर्शन सबसे अच्छा patterning के परिणामों को सुनिश्चित करते हैं।

इस तकनीक की सीमाओं electrophysiological और कैल्शियम इमेजिंग अधिग्रहण दोनों के साथ क्या करना भी है। पहले मामले में, एक बहुत कम स्थानिक संकल्प (4-8 इलेक्ट्रोड प्रत्येक मॉड्यूल में शामिल हैं) की वजह से ही सर्किट के आयामों और अंतर-इलेक्ट्रोड distanc दोनों के लिए मौजूद हैई। दूसरे मामले में, जोखिम, इस प्रकार एक एकल कोशिका संकल्प अधिग्रहण रोकने, एक दो आयामी सेलुलर परत प्राप्त करने की अनुमति देता है जो इष्टतम सेलुलर घनत्व नहीं मिल में होते हैं।

पहले से (काम करता है की सूचना दी लिए कोटिंग, विधानसभा और नसबंदी प्रक्रियाओं और एक कस्टम माइक्रो संरेखण प्रणाली के निर्माण के एक सावधान अनुकूलन के लिए आवश्यक है कि इस रणनीति, सम्मान के साथ हमें कुछ प्रमुख लाभ दे दी है उदाहरण के लिए, हमारी कोशिकाओं की लंबी अवधि के अस्तित्व, यानी, ऊपर) इन विट्रो में आठ सप्ताह के लिए। विशेष रूप से, यह रासायनिक patterning के 23-28 पर आधारित रणनीतियों के संबंध में एक अधिक स्थिर और विश्वसनीय लंबी अवधि के कारावास के साथ 24 हमें प्रदान की है।

वर्णित प्रक्रिया एक्सोन से जुड़े न्यूरोनल विधानसभाओं में नेटवर्क की आत्म संगठन का आश्वासन दिया और बंडलों dendrites जो पीडीएल लेपित मॉड्यूल, पर cortical कोशिकाओं चढ़ाना पर निर्भर करता है। मॉड्यूलर नेट के व्यापक क्षेत्र कैल्शियम इमेजिंग अनुमति देने के लिएएक एकल कोशिका संकल्प के साथ काम करता है, यह न्यूरोनल प्रणाली एक 2 डी परत में आयोजित करता है कि आवश्यक है। इसलिए यह चढ़ाया कोशिकाओं के घनत्व अनुकूलन करने के लिए दोनों उच्च घनत्व, सेलुलर समूहों से बचने के लिए या अंतर-मॉड्यूल कनेक्शन संभावना को कम जो अन्य चरम कम घनत्व मॉड्यूल में महत्वपूर्ण है।

संस्कृति में neuronal-glial नेटवर्क उनके इन विवो संरचनात्मक संगठन खो हालांकि, वे अनायास अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत पढ़ाई बाहर ले जाने के लिए संभावना की पेशकश सक्रिय कार्यात्मक सर्किट में स्वयं का आयोजन। इस प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यात्मक आपस में जुड़े सर्किट से बना दो आयामी मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क रूपांकनों के बड़े प्रदर्शनों की सूची उत्पन्न करने के लिए न्यूरोनल विधानसभाओं के बीच संचार की गतिशीलता और संरचनात्मक रूप में परिभाषित किया neuronal नेटवर्क की क्षमता की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम में यूरोपीय परियोजना BRIANBOW (FP7- युवा खोजकर्ता द्वारा समर्थित किया गया था, लेखकों पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए डॉ Jacopo Tessadori का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और वीडियो में इस्तेमाल किया ग्राफिक्स के निर्माण में उसकी मदद के लिए सिल्विया Chiappalone होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS, Sylgard 184 Dow Corning
Nalgene vacuum chamber Thermo 5305-0609
Poly-D-lysine PDL Sigma P7886
Silicone grease - SILICAID 1010 aidchim Ltd H3375
Spin coater Laurell - Technologies Corporation WS-650-23
12-well culture plate Sigma CLS3336
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma F0503
Uridine Sigma U3003
MEA1060-Inv-BC Multi Channel Systems
TC02 Multi Channel Systems
Pen Strep Biological Industries Beit Haemek 03-033-1c
B-27 Gibco 17504044
glutaMAX Gibco 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle Biological Industries Beit Haemek 01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4Q Multi Channel Systems 60-4QMEA1000iR-Ti-pr cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com
Silicon wafer microchem SU8-2075 Preparation protocol: http://www.microchem.com

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 98, Patterning PDMS स्टेंसिल SU8-2075 सिलिकॉन वेफर कैल्शियम इमेजिंग माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी
डिजाइन, उपचार, सेलुलर चढ़ाना, और कार्यात्मक आपस में जुड़े सर्किट से बना मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क का संवर्धन भूतल
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Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G.,… More

Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G., Goldin, M., Tedesco, M., Hanein, Y., Ben-Jacob, E., Barzilai, A., Chiappalone, M., Bonifazi, P. Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits. J. Vis. Exp. (98), e52572, doi:10.3791/52572 (2015).

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