Abstract
Dyremodeller som etterligner menneskehjertesykdommer har blitt opprettet for å teste potensielle terapeutiske strategier. En viktig komponent for å evaluere disse strategiene er å undersøke deres effekter på hjertefunksjon. Det finnes flere teknikker for å måle in vivo hjerte mekanikk (for eksempel ekkokardiografi, trykk / volum relasjoner, etc.). Sammenlignet med ekkokardiografi, er sanntid venstre ventrikkel (LV) trykk / volum analyse via kateterisering mer presis og innsiktsfull i vurderingen LV-funksjon. I tillegg gir LV trykk / volum analyse muligheten til å umiddelbart registrere endringer i løpet manipulasjoner av kontraktilitet (f.eks β-adrenerge stimulering) og patologiske fornærmelser (f.eks iskemi / reperfusjon skade). I tillegg til det maksimale (+ dP / dt) og minimum (-dP / dt) hastigheten av trykkforandring i LV, en nøyaktig vurdering av LV funksjon via flere lastuavhengig indekser (f.eks ende systolisk trykkvolum forholdet og forspenning recruitable hjerneslag arbeid) kan oppnås. Hjertefrekvensen har en betydelig effekt på LV kontraktiliteten slik at en økning i hjertefrekvensen er den primære mekanismen for å øke blodsirkulasjon (dvs. Bowditch effekt). Dermed når man sammenligner hemodynamics mellom eksperimentelle grupper, er det nødvendig å ha lignende hjerte priser. Videre er et kjennetegn på mange kardiomyopati modeller en reduksjon i kontraktil reserve (dvs. nedsatt Bowditch effekt). Følgelig kan vital informasjon oppnås ved å bestemme virkningene av å øke hjertefrekvensen på kontraktilitet. Våre og andres data har vist at nevronale nitrogenoksydsyntase (NOS1) knockout mus er redusert kontraktilitet. Her beskriver vi fremgangsmåten for måling LV trykk / volum med økende puls ved hjelp av NOS1 knockout mus modell.
Introduction
Hensikten med hjertet er å pumpe blod gjennom kroppen for å møte de metabolske krav av organismen. Siden disse krav blir stadig varierende (f.eks, under trening), hjertet må tilpasse seg (dvs., øke minuttvolumet). Hjertet har utarbeidet en rekke veier for å oppnå dette feat. Prime måte hjertet oppnår dette på er via en økning i hjertefrekvens (dvs. Bowditch effekt) 1. Det er, som en hjertefrekvens øker, dette resulterer i en økning i kontraktilitet og en økning i blodsirkulasjon. Det er således meget avhengig av pulshjertefunksjon. Dessverre, hjertesykdommer (for eksempel hjerteinfarkt, hypertrofi, etc.) gir dårlig hjerte funksjon der hjertet vil følgelig ikke være i stand til å møte de metabolske krav av kroppen. Hjertesykdom er den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet i vestlige samfunn. Dyremodeller som rekapitulere mange menneskelige cardiomyopathies blir brukt til å undersøke molekylære mekanismer og for å teste potensielle terapier. Å skjelne disse mekanismene og avgjøre om en terapi kan være levedyktig, må etterforskerne vurdere hjertefunksjonen in vivo.
Det er flere måter å vurdere hjertefunksjonen in vivo (f.eks ekkokardiografi, MR, etc.), som rutinemessig måle ejeksjonsfraksjon, fractional forkorte, minuttvolum, etc. Men disse parametrene er svært avhengig av afterload, forspenning, og hjertefrekvens I tillegg til kontraktilitet 2. Måling kontraktilitet er uunnværlig for å forstå de iboende egenskapene til hjertet i sin opprinnelige miljø. Den maksimale (dP / dt maks) frekvensen av trykkutviklingen bringer oss et skritt nærmere å forstå kontraktilitet. Dessverre er dP / dt også avhengig av hjertefrekvens og belastningsforhold 3. Derfor teknikker har blitt utviklet for å måle lasten (og hjertefrekvens, se below) uavhengige indekser av hjertets kontraktilitet (dvs. slutten systoliske trykket volum forholdet (ESPVR) og forhåndslaste recruitable hjerneslag arbeid (PRSW)) 4-6. ESPVR beskriver den maksimale trykket som kan utvikles ved ventrikkelen til enhver LV volum. Skråningen av ESPVR representerer slutt systolisk elastance (EØS). PRSW er den lineære regresjon for å stryke arbeids (areal omsluttet av PV-loop) med ende-diastolisk volum. Disse prosedyrene er en mer nøyaktig og presis måling av kontraktilitet i forhold til hemodynamiske parametere som ejeksjonsfraksjon, minuttvolum og slagvolum. ESPVR og PRSW kan fås via midlertidig blokkering av vena cava inferior (IVC). Blokkering av IVC kan utføres med en lukket brystet for å unngå effekten av å endre intrapleural press på hjertefunksjon.
Økt puls forbedrer også sammentrekning og avslapning 1. Dermed når man sammenligner hjertefunksjon mellom Experimental grupper (f.eks ± dP / dt), hjertefrekvenser må være lik. Imidlertid lignende hjertefrekvenser vanligvis ikke forekommer i hvert dyr på grunn av forskjellige forhold (sykdom, forskning inngrep, etc.). Det bør bemerkes at anestesi (injiserbare og inhalert) senker hjertefrekvensen. Som pulsen er veldig avgjørende for kontraktilitet, vil anestesi betydelig innvirkning kontraktilitet. Av denne grunn er vi beskriver vår prosedyre. I tillegg er et kjennetegn på mange cardiomyopathies en redusert kontraktile reserve (dvs. en redusert Bowditch effekt). Derfor bør hjertefunksjonen måles over et område av hjertet priser. Her beskriver vi hvordan du bruker en stimulator (med en lukket kiste) for å oppnå disse effektene.
I tillegg til puls, nitrogenoksid (NO) er også en viktig modulator av kontraktilitet 7. NO produseres via enzymer betegnes NO-syntase (NOS). Vi og andre har vist at mus med utstansing av neuronal NOS (NOS1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dette dyret protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Ohio State University. Denne fremgangsmåten kan brukes på en hvilken som helst mus som den indre diameter av halspulsåren er stor nok til å føre inn katetret. Bruk mus som er over 16 g (eldre enn ~ 2 måneder).
1. Klar Mouse for Kateterisering
- Forsegle alle kirurgiske instrumenter og utstyr i en sterilisering posen. Steril posen i en autoklav maskin. Opprettholde et sterilt felt gjennom hele prosedyren og slitasje sterile hansker.
- Bedøve mus med ketamin (55 mg / kg) pluss xylazin (15 mg / kg) ved intraperitoneal injeksjon.
MERK: Hele prosedyren måle både trykk / volum på ulike hjerte priser og ESPRV tar mindre enn 20 min. Dersom ytterligere tid er nødvendig (dvs. mer enn 30 minutter), ga ytterligere ¼ dose av anestesi hvert 30 min. - Fjerne hår i fremre region av halsen og brystet området ved hjelp av hår fjerne lotion (f.eks Nair) og tape lemmer av musen på skum plattform. Bekrefte en tilstand av dyp anestesi ved en tå klype.
- Sett en rektal probe for å overvåke kroppstemperatur (37 ± 1 ° C), og opprettholder ved hjelp av en termo-regulert varmepute (plassert mellom operasjonslakenet og plattform).
- Forbered en lengde på 4-0 sutur (~ 10 cm). Loop sutur rundt de øvre fortennene og tape til plattform. Dette vil holde halsen rett.
- Sterilisere kirurgiske området ved pensling området med Betadine og 75% alkohol tre ganger.
2. Kateterisering
- Klargjør kateteret ved presoaking spissen i saltvann eller destillert vann (37 ° C) i minst 30 minutter før bruk (i henhold til produsentens instruksjoner) for å akklimatisere trykksensoren membran for det våte biologiske miljøet og for å unngå trykk signal drift og negative trykk innspillingene.
- Foreta en langsgående 0,8 cm innsnitt mellom den nedre kjeve og sternum i fremre område av halsen. Med den fine sakser, separere huden muskulære bindevev å eksponere trakea plassert under stemohyoideus muskelen.
- Separer fett og muskelvevet på høyre side av luftrøret med buet pinsett for å eksponere den høyre halspulsåre.
MERK: Arteria carotis er den største arterien i den fremre delen av halsen, inneholder lyse rødt blod, og er pulserende. Ikke forveksle med halsvenen som går parallelt med halspulsåren. Vena jugularis er mørk rød og ikke-pulserende. I tillegg, under isolering av halspulsåren, skal brukeren bli klar over ikke å skade pneumogastric nerve. - Fjerne fettet fra høyre karotidarterie med de buede tang. Dersom det eksisterer forgrening av beholderen som vil hindre denne operative teknikk, skjære dem med en Bovie kirurgi å dissosiere halspulsåren.Separate så mye av vevet som mulig under halspulsåren ved hjelp av buede tang.
- Skjær to 5 cm 6-0 silke tråder. Passere hvert silketråd under høyre halspulsåren.
- Posisjon en tråd nær den proksimale del og den andre i nærheten av den distale del av arterien. Lag en stram knute på tråden i den distale del, og en løs knute på tråden i proksimale del.
- Blokkere blodstrømmen ved å klemme den proksimale del av arterien ved hjelp av en liten hemostat vaskulær klemme (plassere klemmen under den proksimale tråd). Den forseglede område av arterien vil bli fylt med blod slik at det er enkelt å utføre trinn 2.8.
- Punktere et lite hull i den høyre halspulsåre mellom de to tråder (men nærmere den fjerne tråd) med en 26 G nål. Sett kateter i arteria carotis. Trekk lett løs knute i den proksimale delen av halspulsåren på kateteret for å holde på plass.
MERK: Bruk nålen punktering er å foretrekke sammenlignetå saks snitt. Ved å gjøre en tett knute i den distale del av arterien først, og deretter å klemme den proksimale del, blir arterien bli fullstendig fylt med blod. Dette gjør det svært enkelt å rote gjennom blodkar. Videre, størrelsen av nålen (26 g) punkterer arterien med et hull som pent passer størrelsen av kateteret. Ved bruk av saks innsnitt metoden, var det mer vanskelig å kontrollere størrelsen av snittet. Imidlertid bør den valgte metoden være avhengig av hvilken kirurgen føler seg mer komfortabel med. - Start opptak trykksignaler som i trinn 3.
- Løsne pinsetten klemmen og fortsette å sette inn kateteret frem inn i venstre hjertekammer. Hvis noen motstand oppleves når fremme kateteret, forsiktig trekke den tilbake og prøve marsj igjen. For en mus som veier 18-25 g ~, er den beregnede lengde av kateteret som er satt inn 18 mm.
MERK: arterietrykk signal vil svinge 70-120 mm Hg. Når tHan kateter i venstre ventrikkel i form av trykksignalet endrer seg, og trykket vil svinge 0-120 mm Hg (vist i figur 1). Hjertefunksjon vil stabilisere seg i løpet av 2-3 minutter etter innsetting av kateteret. - Kontinuerlig overvåke kroppstemperatur, anestesi nivå, og pustefrekvens.
3. Data Acquisition
- Bruk LabChartPro 7-programvaren (eller lignende programvare). Bruk Arbeidsflyt muligheten til PV Loop LabChart Module. Ved hjelp av denne modulen, velger trykk og volum Loops standardinnstillingen.
- Sett opp tre kanaler: en kanal for press, en kanal for volum, og en kanal for hjertefrekvens. Sett skala utvalgene av ovennevnte parametre som 0-150 mm Hg, 0-100 ul og 0-800 takt / min, henholdsvis.
- Trykk starttasten til posten.
4. Bowditch Effect
- Foreta en 1 cm innsnitt i prekordium område parallelt med manubrium. Skjær lag av muskler og expose den interkostalrom med saks.
- Ved hjelp av en firkantpuls stimulator, sette følgende parametre: Spenning på 2 V, varighet på 2 ms, og aktiverer repetisjonsmodus.
- Hold den negative elektrode med pinsett og sette det inn gjennom den fjerde interkostalrom på den apikale området av hjertet. Hold den positive elektrode med pinsett og sette det inn gjennom den andre interkostalrom til høyre atrium region av hjertet.
- Slå på stimulator og endre frekvensen til tempo hjertet fra 4 Hz (240 slag / minutt) opp til 10 Hz (600 slag / min). Ved hver ny puls, stimulere hjertet i 1 min før datainnsamling.
5. Generere ESPVR og PRSW
- Skjær hud og muskelvev vinkelrett på manubrium i mageområdet med en saks. Åpne enterocoelia og utsette leveren.
- Dra Arcus costarum mot hodet ved hjelp av metallisk trekkraft.
- Skyv leveren nedover meden bomullspinne. Vær forsiktig med å presse for mye til å påvirke brysthulen. Dette vil endre hjertefunksjon.
- Skjær falciform ligament i leveren med saks for å eksponere suprahepatic inferior vena cava (IVC).
- Bruk buet pinsett for raskt å presse IVC i 5 sekunder for å blokkere tilbakeføring av blodet til høyre atrium. Venstre ventrikkel trykk og volum vil falle på grunn av redusert tilsig til hjertet. Generere disse verdiene, ikke bruk sløyfer under 60 mm Hg. Den 60 mm Hg er i referanse til systoliske trykket.
MERK: Denne verdien er satt til 60 mm Hg fordi dette vil føre til en betydelig nedgang i perfusjonstrykket å betydelig redusere koronar perfusjon og påvirke kontraktilitet.
6. Volume Kalibrering
- Heparinisere musen med 0,1 ml av 1: 5000 heparin-løsning (fortynnet med fysiologisk saltvann) ved intraperitoneal injeksjon.
- Fjern kateteret fra karotidarterien. Når kateteret trekkes ut from carotid arterie, vil heparinisert blod siver fra hullet, hvor kateteret ble innsatt.
- Samle dette blodvolum for kalibrering ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Fyll hver brønn i kalibrerings kyvette.
- Fjern hjerte til å avlive mus via blodtapping.
- Plasser kateteret i hver brønn og få en jevn relative volumenhet (RVU) verdi. Generere en standardkurve ved bruk av de forskjellige standardvolumer og RVU-verdier fra hver brønn.
- Konvertere den innspilte RVU til ul.
7. Data Processing
- Å undersøke Bowditch effekten, velger steady-state trykk / volum spor fra hver puls. Klikk på grunnlinjen analyse for å oppnå data.
- For ESPVR og PRSW data, velger de første ~ 15 trykk / volum spor, klikk okklusjon analyse i programvaren for å generere ESPVR (helling av trykket utviklet av LV ved utgangen av diastolisk volum) og PRSW (lineær regresjon av hjerneslag arbeid med ende-diastoliskvolum) bakker.
- Gi hensyn til formen av sløyfene. Sørg for at løkken er stengt uten vinkel poeng eller vendinger. Dette er et tegn på feil kateter eller overflødig støy. Regelmessig sjekke sløyfer under forsøket for å sikre riktig trykk og volum data blir generert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den riktige innføring av kateteret inn i venstre hjertekammer er et viktig skritt for å oppnå hensiktsmessige trykk- og volumverdier. Vist i figur 1, ved hjelp av LabChart Pro 7, er endring av trykkbølgeform (form og verdier) som kateteret går fra arterien inn i ventrikkelen.
Etter riktig innføring av kateteret inn i venstre hjertekammer, trykket (P) og volum (V) oppnådde verdier vil deretter bli brukt til å generere PV løkkene (vist i figur 2).
Ved hjelp av disse trykkverdier, kan mekanismene som endrer contractility bli undersøkt. Vist i Figur 3 er et eksempel på hvordan trykk- og volumendringer som hjertefrekvensen øker. I dette eksempel, øke hjertefrekvensen 300-600 slag / min, økte LV trykket 80-100 mm Hg, mens det diastoliske og systoliske LV volum redusert. Vist i figur 4 er den puls avhengighet av maksimums- og minimumssatser for press utvikling (dP / dt). Som hjertefrekvensen øker, øker også maksimums- og minimumssatser for press utvikling. Denne type dataanalyse kan også brukes til å undersøke regulering av kontraktilitet. Våre data viser at NOS1 - / - mus har gått ned maksimums- og minimumssatser for press utvikling sammenlignet med villtype (WT) mus (figur 4). Derfor knockout av NOS1 resulterer i en redusert Bowditch effekt.
Ved hjelp av trykk- og volumverdier som oppnås under IVC okklusjon, kan vi også oppnå et mål på lastuavhengig kontraktilitet. Vist i figur 5, er beregnet Ees og PRSW verdier (målt ved 420 slag / min) i WT og NOS1 - / - mus. Disse dataene tyder på at NOS1 - / - mus har redusert kontraktilitet sammenlignet med WT mus.
8 / 52618fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Fig. 1: Trykk- og volum signaler som detekteres ved hjelp av PV Loop LabChart modul trykksignalet endres når kateteret er plassert i LV. Den arterietrykk signal (øverst) svingt 80-120 mm Hg. Når kateteret ble plassert i venstre hjertekammer, i form av trykksignalet endres og trykket svingt 0-120 mm Hg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Generering av PV looper som bruker PV Loop LabChart Module. VENSTRE) Representative data for trykk (øverst), volumet (i midten) og hjertefrekvens (nederst). Disse LV trykk / volum-verdiene benyttes til vanligvis genererere PV sløyfen ved plotting av trykk (P) mot volum (V). (Høyre) Illustrasjon av loops generert av data til venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:.. Effekt av hjertefrekvens på LV trykk og volum Representative data som viser LV trykk- og volumendringer med økt puls bruke PV Loop LabChart Module Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: NOS1 knockout (NOS1 - / -). Mus har redusert in vivo hjertefunksjon og kontraktile reserve Sammenlignet med villtype (WT) mus, NOS1 - / - mus har betydelig lavere maksimal (dP / dt maks) og minimum (dP / dt min) sats på trykk utvikling med stigende puls. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. * P <0.05 vs WT via ANOVA, n = 5 mus / gruppe.
Figur 5: NOS1 knockout (NOS1 - / -) mus har redusert kontraktilitet. VENSTRE) representant trykk / volum sløyfer innhentet under inferior vena cava okklusjon. Merk den riktige formen på hver sløyfe. De tykke linjene er slutten systoliske trykket volum forholdet (ESPVR). HØYRE) Sammenlignet med villtype (WT) mus, NOS1 - / - mus har en redusert slutten systolisk elastance (EØS) og forhåndslaste recruitable hjerneslag arbeid (PRSW). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. * P <0.05 vs WT via uparet t-test, n = 5 mus / gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trinn for denne teknikk for å oppnå et pålitelig mål på kontraktilitet er korrekt plassering av kateter inn i LV. Hvis kateteret ikke er riktig plassert, når LV kontrakter veggene kan kontakte kateteret som resulterer i svært høy, og ikke fysiologiske, trykkverdiene forårsaker uregelmessig formede PV sløyfer. Hvis nødvendig, kan kateter roteres for å oppnå riktig plassering. Et annet viktig skritt for denne teknikken er å sørge for at musen fikk skikkelig anestesi. Hvis musen er over bedøvet, vil dette i stor grad redusere hjertefunksjon. En mus med en hjertefrekvens mindre enn ~ 250 slag / min kan betraktes løpet bedøvet. I tillegg er volumet av blod som musen hjertet pumper liten slik at det er vanskelig å få nøyaktige volumer. Det er viktig å kalibrere volum for hver mus. For volumkalibrering, vi beskrev kuvetten kalibrering teknikk. Det finnes flere metoder som også brukes til å kalibrere volumer (dvs.slagvolum beregning ved hjelp av en strømningsprobe i synkende thorakalaorta) 10.
Det er mange begrensningene ved bruk av denne metoden i mus; all grunn av sin lille kroppsstørrelse. For eksempel krever denne teknikken nøyaktig mikro dyktighet. Videre fører denne teknikken i noen blodtap, noe som potensielt kan endre hjertefunksjon. Massive blodtap kan unngås ved å fremføre kateteret gjennom vaskulaturen i forhold til andre metoder (for eksempel punktering av venstre ventrikkel). Her beskriver vi hele prosedyren i detalj med kritiske detaljer for å unngå disse problemene.
Trykk / volum analyse er en viktig tilnærming for å undersøke in vivo kontraktilitet. Utføring av denne teknikk i mus er viktig siden det er mange fordeler sammenlignet med andre arter (kostnad, genetisk manipulasjon, etc.). Siden hjertefrekvens er en viktig faktor for hjertefunksjon 1 og påvirket av ANESThesia, presenterte vi ytterligere skritt for å fastslå at sammenlign hjerte priser er oppnådd for å tillate en gyldig sammenligning mellom gruppene. Videre bruker denne modifiserte PV sløyfe teknikk, er en etterforsker i stand til å teste Bowditch effekt direkte. Av disse grunner, beskriver vi hvordan du utfører denne teknikken i musen for å få nøyaktige målinger av in vivo kontraktilitet ved ulike hjerte priser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 silk thread | Surgical specialties | SP102 | |
| 6-0 silk thread | Surgical specialties | MBKF270 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Curve forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Vascular clamp | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Microscope | World precision instruments | PZM-3 | |
| Pressure catheter | Millar instruments | SPR-839 | |
| Pressure and volume system | Millar instruments | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD instruments | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD instruments | ||
| Temperature controller | CWE | TC-1000 | |
| Stimulator | Grass | SD-5 | |
| Sterile glove | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Betadine surgical scrub | Veterinary | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Bovie cautery | Bovie | AA29 | |
| 1 ml Syringe (26 G needle) | BD | 8017299 |
References
- Janssen, P. M.
- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
- Hamlin, R. L., del Rio, C.
- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76, 1422-1436 (1987).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Mann, D. L., Carabello, B. A. Effects of changes in left ventricular contractility on indexes of contractility in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2504-H2510 (2002).
- Ziolo, M. T., Kohr, M. J., Wang, H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Mol Cell Cardiol. 45, 625-632 (2008).
- Barouch, L. A., et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature. 416, 337-339 (2002).
- Wang, H., et al. Neuronal nitric oxide synthase signaling within cardiac myocytes targets phospholamban. Am J Physiol Cell Physiol. 294, C1566-C1575 (2008).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol. 274, H1416-H1422 (1998).
