Abstract
Os modelos animais que imitam desordens cardíacas humanas foram criadas para testar potenciais estratégias terapêuticas. Um componente-chave para avaliar estas estratégias é examinar os seus efeitos sobre a função cardíaca. Existem várias técnicas para medir em mecânica vivo cardíacos (por exemplo, ecocardiografia, relações pressão / volume, etc.). Em comparação com a ecocardiografia, ventricular em tempo real à esquerda (LV) Pressão / análise de volume através de cateterismo é mais precisa e perspicaz na avaliação da função do VE. Além disso, a análise do VE pressão / volume fornece a capacidade de gravar instantaneamente alterações durante as manipulações de contractilidade (por exemplo, estimulação β-adrenérgico) e insultos patológicos (por exemplo, isquemia / reperfusão). Para além da máxima (+ dP / dt) e mínimo (-dP / dt) taxa de variação de pressão no VE, uma avaliação precisa da função ventricular esquerda através de vários índices independentes de carga (por exemplo, a pressão sistólica finalrelação volume e pré-carga de trabalho do curso recrutável) pode ser alcançado. A frequência cardíaca tem um efeito significativo na contractilidade do VE de tal modo que um aumento no ritmo cardíaco é o principal mecanismo para aumentar o débito cardíaco (isto é, efeito Bowditch). Assim, quando se comparam hemodinâmica entre os grupos experimentais, é necessário dispor de frequências cardíacas semelhantes. Além disso, uma característica de muitos modelos de cardiomiopatia é uma diminuição da reserva contrátil (isto é, uma diminuição do efeito Bowditch). Consequentemente, a informação vital pode ser obtida através da determinação dos efeitos de aumento da frequência cardíaca na contractilidade. Os nossos dados e outros tem demonstrado que o óxido nítrico sintase neuronal (NOS1) rato de abate diminuiu contractilidade. Aqui nós descrevemos o procedimento de medição de pressão LV / volume com o aumento da freqüência cardíaca, utilizando o modelo knockout rato NOS1.
Introduction
A finalidade do coração de bombear o sangue é todo o corpo para satisfazer as necessidades metabólicas do organismo. Uma vez que estas exigências são constantemente flutuante (por exemplo, durante o exercício), o coração tem de se adaptar (ou seja, aumentar o débito cardíaco). O coração criou numerosas vias para realizar esta façanha. A maneira privilegiada no coração consegue isso é através de um aumento da freqüência cardíaca (isto é, efeito Bowditch) 1. Isto é, como um aumento da frequência cardíaca, isso resulta em um aumento da contractilidade e um aumento do débito cardíaco. Assim, a função do coração é extremamente dependente da freqüência cardíaca. Infelizmente, a doença de coração (por exemplo, enfarte do miocárdio, hipertrofia, etc) resulta no mau funcionamento do coração em que o coração não será, consequentemente, capaz de satisfazer as necessidades metabólicas do corpo. A doença cardíaca é a principal causa de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. Os modelos animais que recapitulam muitos cardiomy humanoopathies são utilizados para investigar os mecanismos moleculares e para testar terapias potenciais. Para discernir esses mecanismos e determinar se a terapia pode ser viável, os investigadores devem avaliar a função cardíaca in vivo.
Existem várias maneiras de avaliar a função cardíaca in vivo (por exemplo, o ecocardiograma, ressonância magnética, etc.), que rotineiramente medir a fração de ejeção, fração de encurtamento, o débito cardíaco, etc. No entanto, estes parâmetros são altamente dependentes de pós-carga, pré-carga e freqüência cardíaca Além disso a contractilidade 2. Medindo contratilidade é indispensável para compreender as propriedades intrínsecas do coração em seu ambiente nativo. A taxa máxima (dP / dt max) de desenvolvimento de pressão nos leva um passo mais perto de compreender a contratilidade. Infelizmente, dP / dt é também dependente da frequência cardíaca e condições de carga 3. Por isso foram desenvolvidas técnicas para medir a carga (e frequência cardíaca, consulte below) índices independentes de contratilidade do miocárdio (ou seja, o volume sistólico final relação de pressão (ESPVR) e pré-carga recrutável trabalho acidente vascular cerebral (PRSW)) 4-6. ESPVR descreve a pressão máxima que pode ser desenvolvida pelo ventrículo em qualquer dado volume do VE. A inclinação da ESPVR representa a elastância sistólica final (EEE). PRSW é a regressão linear de trabalho acidente vascular cerebral (área fechada pelo laço PV) com o volume diastólica final. Estes procedimentos são uma medida mais exata e precisa da contratilidade em comparação com parâmetros hemodinâmicos tais como fração de ejeção, débito cardíaco e volume sistólico. ESPVR PRSW e pode ser obtido através do bloqueio temporário da veia cava inferior (IVC). O bloqueio da VCI pode ser realizada com uma caixa fechada para evitar o efeito da alteração da pressão intrapleural sobre a função cardíaca.
O aumento da freqüência cardíaca também aumenta a contração e relaxamento 1. Assim, quando se compara a função cardíaca entre experimentaOs grupos L (por exemplo, ± dP / dt), as frequências cardíacas precisa ser semelhante. No entanto, as taxas similares do coração normalmente não ocorrem em cada animal devido a várias condições (doença, intervenção investigação, etc.). Deve notar-se que a anestesia (injectável e inalado) diminui a frequência cardíaca. Como a frequência cardíaca é um dos principais determinantes da contratilidade, a anestesia irá afectar consideravelmente a contratilidade. Por esta razão, nós descrevemos o nosso procedimento. Além disso, uma característica de muitas cardiomiopatias é uma diminuição da reserva contrátil (isto é, um efeito de diminuição da Bowditch). Por conseguinte, a função cardíaca deve ser medida ao longo de uma gama de frequências cardíacas. Aqui nós descrevemos como usar um estimulador (com uma caixa fechada) para conseguir estes efeitos.
Além disso a frequência cardíaca, o óxido nítrico (NO) é também um importante modulador da contractilidade 7. O NO é produzido por meio de enzimas denominadas NO sintase (NOS). Nós e outros mostraram que camundongos com nocaute de neuronal NOS (NOS1
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Protocol
NOTA: Este protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) no The Ohio State University. Este procedimento pode ser usado em qualquer rato em que o diâmetro interno da artéria carótida é grande o suficiente para inserir o cateter. Use ratos que estão acima de 16 g (com mais de ~ 2 meses).
1. Preparação do rato por cateterismo
- Vede todas instrumentos cirúrgicos e materiais em uma bolsa de esterilização. Esterilizar a bolsa em uma máquina autoclave. Manter um campo estéril durante todo o procedimento e usar luvas estéreis.
- Anestesiar ratos com cetamina (55 mg / kg), além de xilazina (15 mg / kg) por injecção intraperitoneal.
NOTA: Todo o procedimento de medição tanto a pressão / volume em diversas freqüências cardíacas e ESPRV leva menos de 20 min. Se for necessário um tempo adicional (ou seja, mais de 30 min), ¼ dar uma dose adicional de anestesia a cada 30 min. - Remova o cabelo no r anterioregion de pescoço e peito área usando o cabelo removendo loção (por exemplo, Nair) e cole os membros do mouse sobre a plataforma de espuma. Confirme o estado de anestesia profunda por uma pitada dedo do pé.
- Insira uma sonda rectal para monitorizar a temperatura do corpo (37 ± 1 ° C), e manter usando uma almofada de aquecimento regulada-termo (localizado entre a cobertura cirúrgica e plataforma).
- Prepara-se uma duração de 4-0 (~ 10 cm). Laço de sutura em torno dos incisivos superiores e fita para plataforma. Isto irá manter a linha reta pescoço.
- Esterilizar a área cirúrgica esfregando a área com Betadine e álcool 75% três vezes.
2. Cateterismo
- Prepara-se o cateter pelo presoaking a ponta em solução salina ou água destilada (37 ° C) durante pelo menos 30 min antes da utilização (de acordo com as instruções do fabricante) para aclimatar o diafragma sensor de pressão para o ambiente biológico húmido e impedir a dispersão do sinal de pressão e negativo registos de pressão.
- Adicione uma incisão longitudinal 0,8 centímetros entre a mandíbula inferior e esterno na região anterior do pescoço. Com as tesouras finas, separar o tecido conjuntivo da pele-muscular para expor a traqueia localizado sob o músculo stemohyoideus.
- Separou-se a gordura e tecido muscular no lado direito da traqueia com uma pinça curvos para expor a artéria carótida direita.
NOTA: A artéria carótida é a maior artéria na região anterior do pescoço, contém sangue vermelho brilhante, e é pulsátil. Não confundir com a veia jugular que corre paralela à artéria carótida. A veia jugular é vermelho escuro e não pulsátil. Além disso, durante o isolamento da artéria carótida, o usuário deve estar ciente de não danificar o nervo pneumogastric. - Remover a gordura a partir da artéria carótida direita com as pinças curvas. Se existe ramificação do vaso que vai impedir esta técnica operacional, cortá-los com um cautério Bovie dissociar a artéria carótida.Separe o máximo de tecido possível, sob a artéria carótida usando uma pinça curva.
- Corte dois cinco centímetros 6-0 fios de seda. Passe cada fio de seda sob a artéria carótida direita.
- Posição um segmento perto da parte proximal eo outro perto da parte distal da artéria. Faça um nó apertado na rosca na parte distal, e fazer um nó frouxo na linha na parte proximal.
- Bloquear o fluxo de sangue por aperto a parte proximal da artéria usando uma pinça vascular pequena pinça hemostática (colocar a braçadeira abaixo o segmento proximal). A região selada da artéria vai ser enchido com sangue, tornando mais fácil executar o passo 2.8.
- Perfurar um pequeno buraco na artéria carótida direita entre os dois tópicos (mas mais perto do segmento distal) com uma agulha de 26 G. Inserir o cateter na artéria carótida. Aperte ligeiramente o nó frouxo na parte proximal da artéria carótida para o cateter para manter no lugar.
NOTA: Usando a punção com agulha é preferido em relaçãoa tesoura incisão. Ao fazer um nó apertado na parte distal da artéria em primeiro lugar, e depois de prender a parte proximal, artéria vai ser totalmente cheio com sangue. Isto torna muito fácil para picar através do vaso sanguíneo. Além disso, o tamanho da agulha (26 L) perfura a artéria com um furo que se adapta muito bem ao tamanho do cateter. Quando se utiliza o método de incisão tesoura, que era mais difícil de controlar o tamanho da incisão. No entanto, o método escolhido deve ser dependente de qual o cirurgião sente-se mais confortável. - Comece a gravar sinais de pressão como no passo 3.
- Solte a braçadeira pinça hemostática e continuar a inserção do cateter para dentro do ventrículo esquerdo. Se alguma resistência é experiente quando o avanço do cateter, puxe-o suavemente para trás e tentar avançar novamente. Para um rato pesando 18-25 g ~, o comprimento estimado do cateter que é inserido é de 18 mm.
NOTA: O sinal de pressão arterial irá flutuar 70-120 mm Hg. Uma vez que tele é cateter no ventrículo esquerdo a forma do sinal muda de pressão e a pressão irá variar de 0 a 120 mm de Hg (mostrado na Figura 1). A função do coração vai se estabilizar dentro de 2-3 min após a inserção do cateter. - Monitorar continuamente a temperatura corporal, nível de anestesia, e taxa de respiração.
3. Aquisição de Dados
- Use software LabChartPro 7 (ou software similar). Use a opção de WorkFlow do LabChart Módulo PV loop. Usando este módulo, selecione a configuração padrão de pressão e volume Loops.
- Set-up de três canais: um canal de pressão, um canal para o volume, e um canal para a freqüência cardíaca. Definir intervalos de escala de parâmetros acima como 0-150 mm Hg, 0-100 0-800 ul e batida / min, respectivamente.
- Pressione a tecla Iniciar para gravar.
4. Efeito Bowditch
- Fazer uma incisão de 1 cm na área precórdio paralelo ao manubrium. Corte a camada de músculo e expose o espaço intercostal com uma tesoura.
- Usando um estimulador pulso quadrado, definir os seguintes parâmetros: Tensão de 2 V, duração de 2 ms, e ativar o modo de repetição.
- Segurar o eléctrodo negativo com uma pinça e inseri-la através do quarto espaço intercostal para a região apical do coração. Segurar o eléctrodo positivo com uma pinça e inseri-la através do segundo espaço intercostal para a região do átrio direito do coração.
- Ligue o estimulador e mudar a freqüência para estimular o coração a partir de 4 Hz (240 batimentos / min) até 10 Hz (600 batimentos / min). A cada nova freqüência cardíaca, estimular o coração para 1 min antes da coleta de dados.
5. Gerando o ESPVR e PRSW
- Cortar a pele e o tecido muscular perpendicular ao manubrium na região abdominal com uma tesoura. Abra o enterocoelia e expor o fígado.
- Arraste o costarum Arcus para a cabeça usando tração metálico.
- Com cuidado, empurre para baixo com o fígadoum cotonete. Tenha cuidado para não empurrar demais para afetar a cavidade torácica. Isso vai mudar a função do coração.
- Cortar o ligamento falciforme do fígado com uma tesoura para expor a veia cava inferior suprahepática (IVC).
- Use pinças curvas para apertar rapidamente da VCI durante 5 segundos para bloquear o retorno do sangue para o átrio direito. A pressão ventricular esquerda e volume irá cair devido à entrada reduzida para o coração. Em gerar esses valores, não use loops de abaixo de 60 mm Hg. A 60 mm Hg é em referência a pressão sistólica.
NOTA: Esse valor é fixado em 60 mm Hg, porque isso irá causar uma queda significativa na pressão de perfusão para diminuir consideravelmente a perfusão coronária e afetar a contratilidade.
6. Volume Calibration
- Heparinizar o rato com 0,1 ml de 1: 5,000 solução de heparina (diluído com solução salina normal) por injecção intraperitoneal.
- Remover o cateter da artéria carótida. Quando o cateter é retirado from a artéria carótida, sangue heparinizado vai escoar do buraco onde o cateter foi inserido.
- Recolha este sangue para calibragem de volume usando uma seringa de 1 ml. Encher cada poço na cuvete de calibração.
- Remover coração para sacrificá o mouse via sangria.
- Posicione o cateter em cada poço e obter um valor estável unidade de volume relativo (RVU). Gerar uma curva padrão, utilizando os vários volumes padrão e valores RVU de cada poço.
- Converter o RVU gravadas ul.
7. Processamento de Dados
- Para examinar o efeito Bowditch, selecione no estado estacionário vestígios pressão / volume de cada frequência cardíaca. Clique na análise de base para obter dados.
- Para dados ESPVR e PRSW, selecione os primeiros vestígios ~ 15 pressão / volume, clique em análise de oclusão no software para gerar o ESPVR (inclinação da pressão desenvolvida pela LV no volume diastólico final) e PRSW (a regressão linear de trabalho sistólico com o fim-diastólicavolume) pistas.
- Submeter a atenção para a forma dos laços. Verifique se o circuito é fechado sem pontos angulares ou torções. Este é um sinal de colocação do cateter imprópria ou excesso de ruído. Verifique periodicamente laços durante a experiência para garantir que os dados de pressão e volume adequados estão sendo gerados.
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Representative Results
A inserção correcta do cateter no interior do ventrículo esquerdo é um passo importante para atingir os valores de pressão e de volume apropriados. Mostrado na Figura 1, usando LabChart Pro 7, representa a mudança da forma de onda de pressão (forma e valores) como o cateter da artéria vai para o ventrículo.
Após a inserção correcta do cateter no ventrículo esquerdo, a pressão (P) e o volume (V) Os valores obtidos, em seguida, ser utilizada para gerar os loops PV (mostrado na Figura 2).
Usando estes valores de pressão, mecanismos que possam alterar a contractilidade pode ser investigada. Mostrado na Figura 3 é um exemplo de como a pressão e mudanças de volume à medida que aumenta da frequência cardíaca. Neste exemplo, o aumento da frequência cardíaca 300-600 batimentos / min, a pressão do VE aumentou de 80 para 100 mm Hg, enquanto os volumes diastólica e sistólica do ventrículo esquerdo diminuída. Mostrado na Figura 4 é a frequência cardíaca dependência das taxas máximas e mínimas de desenvolvimento de pressão (dP / dt). Conforme aumenta a freqüência cardíaca, o mesmo acontece com as taxas máximas e mínimas de desenvolvimento de pressão. Este tipo de análise de dados também pode ser utilizado para investigar os reguladores de contractilidade. Os nossos dados demonstram que NOS1 - / - ratos diminuiu as taxas máximas e mínimas de desenvolvimento de pressão em comparação com o tipo selvagem (WT) murganhos (Figura 4). Assim, knockout de NOS1 resulta em um efeito de diminuição da Bowditch.
Usando os valores de pressão e volume obtidos durante a oclusão IVC, também podemos obter uma medida da contratilidade independente de carga. Mostrado na Figura 5, são calculadas e valores Ees PRSW (medido a 420 batimentos / min) durante WT e NOS1 - / - ratos. Estes dados sugerem que NOS1 - / - ratos contractilidade diminuída em comparação com ratinhos WT.
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Figura 1:. Os sinais de pressão e volume como detectadas usando o LabChart Módulo PV loop As mudanças de sinal de pressão quando o cateter está posicionado no VE. O sinal de pressão arterial (topo) oscilou de 80 a 120 mm Hg. Uma vez que o cateter foi colocado no ventrículo esquerdo, a forma das mudanças de sinal de pressão ea pressão oscilou de 0 a 120 mm Hg. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de PV laços usando o LabChart Módulo PV loop. LEFT) dados representativos de pressão (em cima), o volume (meio) e freqüência cardíaca (em baixo). Esses valores pressão LV / volume são usados para generate o circuito de PV traçando de pressão (P) contra o volume (V). (Direito) Ilustração de loops gerados pelos dados sobre a esquerda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:.. Efeito da freqüência cardíaca em pressão e volume do VE dados representativos que demonstram mudanças de pressão e volume LV com o aumento do ritmo cardíaco, usando o laço PV LabChart Módulo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: nocaute NOS1 (NOS1 - / -.) Em ratos diminuiu e a função cardíaca contráctil reserva vivo Em comparação com o tipo selvagem (WT) ratinhos, NOS1 - / - ratos têm máxima significativamente inferior (dP / dt max) e mínimo (dP / dt min) taxa de pressão desenvolvimento com o aumento da freqüência cardíaca. Os dados são apresentados como média ± DP. * P <0,05 vs WT através de ANOVA, n = 5 ratinhos / grupo.
Figura 5: nocaute NOS1 (NOS1 - / -) camundongos diminuíram a contratilidade. LEFT) Pressão representante / laços de volume obtidos durante a oclusão da veia cava inferior. Observe a forma adequada de cada loop. As linhas grossas são a relação de volume pressão sistólica final (ESPVR). Direita) Comparado ao tipo selvagem (WT) ratos, NOS1 - / - ratos têm uma elastância sistólica diminuiu final (EEE) e pré-carga de trabalho do curso recrutável (PRSW). Os dados são apresentados como média ± DP. * P <0,05 vs WT através do teste t não emparelhado, n = 5 ratinhos / grupo.
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Discussion
Um passo crítico para esta técnica para obter uma medida confiável da contratilidade é a colocação do cateter adequado para a LV. Se o cateter não é colocado corretamente, quando o LV contrai as paredes podem entrar em contato com o cateter, resultando em valores muito elevados, e não fisiológico, causando pressão laços PV de forma irregular. Se necessário, o cateter pode ser girada para realizar o posicionamento correcto. Outro passo chave para esta técnica é certificar-se o mouse receberam anestesia adequada. Se o mouse está sobre anestesiado, isso vai diminuir significativamente a função cardíaca. Um rato com uma frequência cardíaca inferior a ~ 250 batimentos / min pode ser considerado sobre anestesiado. Além disso, o volume de sangue que bombeia o coração do rato é pequeno, o que torna difícil obter volumes precisos. É importante para calibrar o volume para cada rato. Para a calibração do volume, que descreveu a técnica de calibração cuvete. Há métodos adicionais que também são utilizadas para calibrar os volumes (ou seja,acidente vascular cerebral cálculo de volume, utilizando uma sonda de fluxo na aorta torácica descendente) 10.
Há muitas limitações de usar este método no rato; tudo devido ao seu pequeno tamanho corporal. Por exemplo, esta técnica requer habilidade microcirúrgico precisas. Além disso, esta técnica resulta em alguma perda de sangue, o que poderia potencialmente alterar a função do coração. Perda de sangue massiva pode ser evitado com o avanço do cateter através do sistema vascular em comparação com outros métodos (por exemplo, perfurando o ventrículo esquerdo). Aqui, descrevemos todo o processo em detalhe com detalhes críticos para evitar esses problemas.
Análise de pressão / volume é uma abordagem importante investigar na contratilidade vivo. A execução dessa técnica em camundongos é significativo uma vez que existem muitas vantagens sobre outras espécies (custo, manipulação genética, etc.). Desde frequência cardíaca é um importante determinante da função cardíaca 1 e afectadas pelo anesthesia, apresentamos medidas adicionais para assegurar que as frequências cardíacas comparáveis são alcançados para permitir uma comparação válida entre os grupos. Além disso, usando esta técnica laço PV modificado, um investigador é capaz de testar diretamente o efeito Bowditch. Por estas razões, nós descrevemos como executar esta técnica no mouse para obter medições precisas de contratilidade in vivo em diferentes taxas de coração.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 silk thread | Surgical specialties | SP102 | |
| 6-0 silk thread | Surgical specialties | MBKF270 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Curve forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Vascular clamp | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Microscope | World precision instruments | PZM-3 | |
| Pressure catheter | Millar instruments | SPR-839 | |
| Pressure and volume system | Millar instruments | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD instruments | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD instruments | ||
| Temperature controller | CWE | TC-1000 | |
| Stimulator | Grass | SD-5 | |
| Sterile glove | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Betadine surgical scrub | Veterinary | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Bovie cautery | Bovie | AA29 | |
| 1 ml Syringe (26 G needle) | BD | 8017299 |
References
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- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
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- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
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