Abstract
已创建模仿人类心脏疾病的动物模型来测试潜在的治疗策略。一个关键组成部分，以评估这些战略是考察其对心脏功能的影响。有几种技术在体内心脏力学（ 例如 ，超声心动图，压力/容积关系， 等等 ）来衡量。相比超声心动图，经由导管左实时左心室（LV）的压力/体积分析更精确，见地在评估LV功能。此外，LV压力/体积分析提供了在收缩（ 如 β肾上腺素能刺激）和病理损伤（ 如缺血/再灌注损伤）的操作来记录瞬间变化的能力。除了 最大值（+ DP / dt）的和最小（-dP / dt）的压力变化在LV速率，LV功能通过多个负载无关的索引的准确评估（ 例如 ，收缩末压力体积的关系和预紧recruitable行程工作）可以实现。心脏速率对左心室收缩一个显著效果，使得增加的心脏速率是提高心输出量（ 即 ，鲍迪奇效应）的主要机制。因此，实验组之间比较血流动力学时，有必要具有类似心脏速率。此外，许多病车型的标志是在收缩储备的减少（ 即减少鲍迪奇效果）。因此，重要的信息可以通过确定增加心脏速率上收缩的影响而获得。我们和其他人的数据表明，神经元型一氧化氮合酶（NOS1）基因敲除小鼠已减少收缩。在这里，我们描述了测量左室压力/体积随用NOS1基因敲除小鼠模型心脏率的过程。
Introduction
心脏的目的是泵整个身体的血液满足微生物的代谢需求。由于这些要求都在不断波动（ 例如 ，运动时），心脏必须适应（ 即 ，增加心输出量）。心脏有无数的设计途径来完成这一壮举。黄金的方式达到心脏，这是通过增加心脏率（ 即 ，鲍迪奇效果）1。即，当一个人的心脏速率增加，这导致增加的收缩力，并增加了心输出量。因此，心脏功能极其取决于心脏率。不幸的是，心脏疾病（ 例如 ，心肌梗塞，肥大等 ）导致低劣的心脏功能，其中心脏因此将不能满足身体的代谢需要。心脏疾病是发病率和死亡率在西方社会的主要病因。该重述许多人类cardiomy动物模型opathies被用于研究分子机制和测试潜在疗法。要辨别这些机制，并确定是否治疗可能是可行的，研究者必须评估在体内的心脏功能。
有几种方法来评估心脏功能的体内 （ 例如 ，超声心动图，MRI 等 ），这经常测量射血分数，缩短分数，心输出量， 等等。然而，这些参数是高度依赖于后负荷，预压，和心脏速率除了 收缩2。测量收缩是必不可少的在其原生环境中领悟心脏的内在属性。最大（DP / dt 最大值 ）率压力的发展使我们更接近了一步了解收缩。不幸的是，上升/ dt为还取决于心脏速率和负载条件3。因此技术已被开发用于测量负载（和心脏速率，参见贝尔流）心肌收缩力指数无关（ 即 ，收缩末期容积压力的关系（ESPVR）和预紧recruitable工作行程（PRSW））4-6。 ESPVR描述了可以通过心室在任何给定的LV体积要开发的最大压力。 ESPVR的斜率代表收缩末期弹性（EES）。 PRSW是脑卒中工作（由PV环封闭区域）与舒张末期容积的线性回归。这些程序是收缩的更准确和精确的测量相比的血流动力学参数，如射血分数，心输出量，和每搏输出量。 ESPVR和PRSW可以经由下腔静脉（IVC）的临时阻塞而获得。阻断IVC可以带有闭合胸腔进行，以避免改变对心脏功能胸膜内压力的作用。
增加心脏率也提高了收缩和舒张1。因此，比较experimenta之间心脏功能时，L基团（ 如 ±DP / DT），心脏率必须相似。但是，类似的心脏率通常不因各种条件（疾病，研究干预等 ）发生在每个动物。应当指出的是，麻醉（注射和吸入）降低心脏速率。作为心脏速率是收缩的主要决定因素，麻醉将大大影响收缩力。出于这个原因，我们描述我们的程序。此外，许多心肌病的特点是降低收缩储备（ 即降低鲍迪奇效应）。因此，心脏功能应测在一系列心脏率。这里，我们描述了如何使用一个刺激（带有闭合胸腔）来实现这些效果。
除了 心脏速率，一氧化氮（NO）也是收缩7的重要调节剂。否是通过生产的酶称为NO合成酶（NOS）。我们和其他人已经表明，小鼠神经元NOS的基因敲除（NOS1
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Protocol
注：此动物议定书批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在俄亥俄州立大学。此过程可用于在任何小鼠中，在颈动脉的内径大到足以插入导管。用小鼠是超过16克（超过〜2个月）。
1.准备鼠标导尿
- 密封所有手术器械和用品的消毒袋。消毒在高压釜中的机器的小袋。保持整个过程的无菌区域和戴无菌手套。
- 麻醉小鼠用氯胺酮（55毫克/千克）加赛拉嗪（15毫克/千克）通过腹膜内注射。
注：整个过程同时测量压力/容积在不同的心脏速率和ESPRV只需要不到20分钟。如果需要额外的时间（ 即 ，超过30分钟以上），得到另外¼剂量麻醉的每30分钟。 - 除去毛在前ř颈部和胸部区域使用毛发去除洗剂（ 例如 ，奈尔）和egion胶带将小鼠的肢体上的泡沫平台。由脚趾捏确认深度麻醉状态。
- 插入直肠探针监测体温（37±1℃），并保持使用热调节的加热垫（位于外科被单和平台之间）。
- 准备4-0缝合线（约10厘米）长。绕上门牙环缝合带与平台。这将保持颈部挺直。
- 通过擦拭用聚维酮碘和75％乙醇的三倍区域消毒的手术区域。
2.导尿
- 通过预浸泡的尖端在盐水或蒸馏水（37℃）至少30分钟制备的导管使用（根据制造商的说明），以适应新环境的压力传感器膜片的湿生物环境和防止压力信号漂移和负前压力记录。
- 使下颚和胸骨在颈部的前部区域之间的纵向0.8厘米切口。随着精剪，分离皮肤，肌肉结缔组织揭露设下的肌肉stemohyoideus气管。
- 在右侧与弯钳气管分离脂肪和肌肉组织以暴露右颈动脉。
注：颈动脉是颈部前区最大的动脉，包含了鲜红的血，是搏动。不要混淆与平行延伸到颈动脉颈内静脉。颈静脉是暗红色和非搏动。此外，在颈动脉的隔离期间，用户应该意识到不损害迷走神经的。 - 从右颈动脉与弯曲镊子去除脂肪。如果存在分支，这将阻碍该操作技术的船只，切断他们与bovie刀烧灼分离颈动脉。分离尽可能多的组织尽可能使用弯钳颈动脉之下。
- 切两5厘米6-0丝线。通过右颈总动脉下的每个丝线。
- 位置一个线程邻近近端部分和其他邻近动脉的远端部分。使线程上紧结在远端部分，并且使线程上的松散的结在近端部分。
- 通过夹紧用小止血血管钳动脉的近端部分阻塞血流（将近端螺纹下方的夹具）。动脉的密封区域将充满血液使其易于执行步骤2.8。
- 穿刺一个小孔在两个线程（但更靠近所述远端螺纹）之间的右颈动脉用一个＆G针。插入导管插入颈动脉。略微收紧松散结在颈动脉的近端部分上的导管保持在适当位置。
注：使用穿刺是首选比较剪刀切口。通过使紧结在动脉的远端部分，然后再夹紧近端部分，动脉将被完全充满血液。这使得它非常容易捅血管。此外，该针（26 G）的大小穿刺与很好地配合在导管的尺寸的孔的动脉。当使用剪刀切口的方法，它是更加难以控制切口的大小。但是，选择的方法应该是取决于哪一个外科医生感觉更舒服。 - 开始录制的压力信号，在第3步。
- 松开止血钳，继续向前插入导管进入左心室。如果推进导管当一些阻力经历，轻轻拉回来，然后再试一次推进。对于一个小鼠体重〜18-25克，所插入的导管的估计长度为18毫米。
注：动脉压信号会波动从70至120毫米汞柱。一旦牛逼他导管是在左心室的压力信号的变化的形状和压力会波动，从0到120毫米汞柱（ 图1中示出）。心脏功能将插入导管后的2-3分钟稳定。 - 连续监测体温，麻醉水平，和呼吸率。
3.数据采集
- 使用LabChartPro 7软件（或类似软件）。使用PV环LabChart模块的工作流程选项。使用此模块中，选择压力和容积循环默认设置。
- 建立三个通道：一个通道的压力，一个通道音量，和一个通道对心脏率。以上参数为0-150毫米汞柱，0-100微升和0-800次/分钟，分别设定量程范围。
- 按开始键记录。
4.鲍迪奇影响
- 制成1厘米的切口平行于所述柄的心前区面积。切断肌肉和EXP层OSE的肋间用剪刀。
- 采用方波脉冲刺激，设置以下参数：电压为2 V，2毫秒的时间，并启用重复模式。
- 握住钳子负极，并通过第四肋间隙心脏的心尖区插入。持用钳子的正极，并通过第二肋间到心脏的右心房区域插入。
- 打开刺激器，改变频率，从4赫兹（240次/分）起搏心脏高达10赫兹（600次/分）。在每一个新的心脏率，刺激心脏进行数据采集前1分钟。
5.生成ESPVR和PRSW
- 切开皮肤和肌肉组织垂直于用剪刀腹部区域的柄。打开enterocoelia并露出肝脏。
- 拖动弓costarum朝向头部采用金属牵引。
- 轻轻地向下肝脏与推棉签。小心不要推太多影响胸腔。这将改变心脏功能。
- 割肝的镰状韧带用剪刀以暴露肝上下腔静脉（IVC）。
- 用弯钳迅速挤压下腔静脉，持续5秒，以阻断血液回流到右心房。左心室压力和容积将下降，由于减少了流入到心脏。在产生这些值，不要使用低于60毫米汞柱循环。 60毫米汞柱是在参考收缩压。
注意：此值被设定为60毫米汞柱，因为这将导致在灌注压一个显著下降到显着降低冠状动脉灌注和影响收缩力。
6.音量校正
- Heparinize的小鼠用0.1ml的1：5000肝素溶液（用生理盐水稀释）通过腹膜内注射。
- 从颈动脉取出导管。当导管被拉出FR嗡颈动脉，肝素化血液会渗入从插入导管，其中该孔。
- 收集这些血用1毫升注射器体积校准。每个校准比色皿井填。
- 删除通过心脏放血安乐死鼠标。
- 定位在每个导管孔，并获得稳定的相对体积单元（RVU）值。生成使用各种标准体积和RVU值从每个孔的标准曲线。
- 转换录制的RVU到微升。
7.数据处理
- 为了检验效果鲍迪奇，从每个心脏率稳态压力/体积的痕迹。点击基线分析，以获得数据。
- 对于ESPVR和PRSW数据，选择第一〜15压力/容积痕迹，单击闭塞分析软件来生成ESPVR和PRSW（用在LV舒张末期容积形成的压力的斜率）（工作行程的线性回归与舒张末期体积）的斜坡。
- 兼顾环的形状。确保环没有角点或曲折关闭。这是不正确的导管放置或噪声过大的迹象。在实验过程中定期检查循环，以确保正在生成适当的压力和体积数据。
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Representative Results
正常插入导管进入左心室是达到适当的压力和体积值的一个重要步骤。 如图1中所示，使用LabChart Pro 7中，是压力波形（形状和值）作为导管的推移从动脉进入心室的变化。
正确插入导管进入左心室后，将压力（P）和体积（V）中得到将被用来产生光伏回路的值（示于图2）。
利用这些压力值，从而改变收缩机制可以进行调查。 图3所示是一个例子，如何压力和量的变化作为心脏速率增加。在本实施例中，增加从300至600次的心脏速率/ min时，低压压力增加，从80至100毫米汞柱，而舒张压和收缩期左室容积减少。 图4所示是心脏速率的压力发展（上升/ dt），将最大和最小速率的依赖。作为心脏速率的增加，所以确实压力发展的最大和最小速率。这种类型的数据的分析也可以用来研究收缩的调节。我们的数据表明，NOS1 - / -小鼠具有比野生型（WT）小鼠（ 图4）降低压力发展的最大和最小速率。因此，NOS1的敲除导致降低鲍迪奇效果。
使用IVC闭塞过程中获得的压力和体积值，我们还可以得到负载无关的收缩力的量度。 - / -小鼠显示在图5中 ，进行计算EES和PRSW值WT和NOS1（在420次/分测定）。这些数据表明，NOS1 - / -小鼠具有降低的收缩相比WT小鼠。
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图1：作为使用PV回路LabChart模块检测到的压力和容积信号的压力信号的变化时，所述导管定位在LV。动脉压力信号（上部）波动从80到120毫米汞柱。一旦导管置于左心室，压力信号变化的形状和压力波动从0到120毫米汞柱。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：光伏发电的利用回路的PV环LabChart模块。左）的压力（上），体积（中）和心脏速率（底部）的代表性数据。这些左室压力/体积值用于发电机密封Ë通过绘制压力（P）对体积（V）的光伏循环。 （右）插图由左边的数据生成的循环。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：左室压力和容量心脏率的影响有代表性的数据表明左室压力和量的变化而增加使用PV环LabChart模块心脏速率请点击此处查看该图的放大版本。
图4：NOS1淘汰赛（NOS1 - / - ）的小鼠具有降低的体内心脏功能和收缩储备相比野生型（WT）小鼠，NOS1 - / -小鼠具有显著降低最大值（上升/ dt 最大值 ）和最小值（上升/ dt的分钟 ）的压力速率发展与增加心脏率。数据表示为平均值±标准差。 * p <0.05，与WT经由ANOVA中，n = 5只小鼠/组。
图5：NOS1敲除（NOS1 - / - ）小鼠具有降低的收缩。左）代表压力/中下腔静脉闭塞获得的体循环。注意每个回路的正常形状。粗线是收缩末期容积压力的关系（ESPVR）。右）对比野生型（WT）小鼠，NOS1 - / -小鼠具有减少收缩末期弹性（EES）和预紧recruitable行程工作（PRSW）。数据表示为平均值±标准差。 * p <0.05，与通过非配对t检验中，n = 5只小鼠/组的WT。
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Discussion
此技术获得收缩的可靠措施的一个关键步骤是正确的导管放置到LV。如果导管被放置不正确，当左心室收缩的壁可接触导致非常高的，而不是生理，压力值造成的不规则形状的PV循环导管。如果需要的话，该导管可以旋转以实现正确的放置。这种技术的另一个关键步骤是确保鼠标得到适当的麻醉。如果鼠标在麻醉，这将大大降低心脏功能。鼠标与心脏率低于〜250次/分，可考虑在麻醉。此外，采血量的小鼠心脏泵是小制作很难得到准确的体积。它来校准每个小鼠的体积是重要的。对于体积校准，我们所描述的比色皿校准技术。有附加的方法，这些方法也用于校准体积（ 即每搏量的计算使用在胸降主动脉一个流量探针）10。
有使用这种方法，在小鼠的许多限制;全因它的小的车身尺寸。例如，这项技术需要精确的显微手术技巧。此外，这种技术会导致一些血液损失，这可能改变心脏功能。可避免通过推进通过脉管相比其他方法（ 如 ，穿刺左心室）导管大量失血。在这里，我们描述了整个过程详细关键细节，以避免这些问题。
压力/体积分析是体内收缩，调查的重要途径。在小鼠中进行该方法是显著，因为有比其它物种（成本，基因操作等 ）的许多优点。由于心脏速率心脏功能1的一个重要决定，并受ANESThesia，我们提出了额外的步骤，以确定可比的心脏速率达到让群体之间的有效比较。此外，使用这种改性的PV环路技术中，研究者能够直接测试鲍迪奇效果。由于这些原因，我们将描述如何在鼠标执行此技术，以获得在体内收缩的精确测量在不同心脏速率。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 silk thread | Surgical specialties | SP102 | |
| 6-0 silk thread | Surgical specialties | MBKF270 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Curve forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Vascular clamp | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Microscope | World precision instruments | PZM-3 | |
| Pressure catheter | Millar instruments | SPR-839 | |
| Pressure and volume system | Millar instruments | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD instruments | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD instruments | ||
| Temperature controller | CWE | TC-1000 | |
| Stimulator | Grass | SD-5 | |
| Sterile glove | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Betadine surgical scrub | Veterinary | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Bovie cautery | Bovie | AA29 | |
| 1 ml Syringe (26 G needle) | BD | 8017299 |
References
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