Abstract
الخلايا المناعية المتخصصة التي تتسلل المكروية الورم تنظم نمو وبقاء الأورام. الخلايا الخبيثة يجب أن يراوغ أو تخريب المضادة للورم الاستجابات المناعية من أجل البقاء على قيد الحياة وتزدهر. الأورام الاستفادة من عدد من آليات مختلفة من المناعة "الهروب"، بما في ذلك تجنيد مولد للتحمل DC، وخلايا T التنظيمية المثبطة للمناعة (Tregs)، والخلايا القامع المستمدة النخاعي (MDSC) التي تمنع الردود المضادة للورم السامة للخلايا. وعلى العكس، يمكن أن الخلايا المناعية المضادة للورم المستجيب إبطاء نمو وتوسع الأورام الخبيثة: الخلايا الجذعية مناعة، الخلايا القاتلة الطبيعية التي ترعى الفطرية الحصانة المضادة للورم، والخلايا التائية السامة يمكن للجميع المشاركة في قمع الورم. التوازن بين المؤيدين والمضادة للورم الكريات البيض يحدد في نهاية المطاف سلوك ومصير الخلايا تحولت، وتحملت العديد من الدراسات السريرية الإنسان ذلك. وهكذا، تحليلا مفصلا لمجموعات فرعية الكريات البيض داخلأصبح المكروية ورم متزايد الأهمية. هنا، نحن تصف طريقة لتحليل مجموعات فرعية الكريات البيض التسلل الحالية في المكروية الورم في نموذج الورم الماوس. تم تلقيح الماوس B16 خلايا الورم القتامي تحت الجلد في C57BL / 6 الفئران. في وقت معين، ومقطوعة الأورام والجلد المحيط ككل ومعالجتها في تعليق خلية واحدة، ثم جرى الملون لمتعددة الألوان التدفق الخلوي. باستخدام مجموعة متنوعة من الكريات البيض علامات فرعية، كنا قادرين على المقارنة بين النسب المئوية النسبية للتسلل مجموعات فرعية الكريات البيض بين السيطرة والأورام، معربا عن chemerin. المحققون قد تستخدم هذه الأداة لدراسة وجود المناعة في المكروية الورم وعندما يقترن قياسات حجم الفرجار التقليدية للنمو الورم، من المحتمل أن تسمح لهم لتوضيح أثر التغيرات في تكوين المناعة على نمو الورم. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نموذج الورم الذي الورم والمكروية ج لهاويتم مقطوعة ومعالجتها.
Introduction
التوازن بين نمو الورم وتعزيز والانحدار هو، في جزء منه، يعتمد على ميزان الورم التسلل الكريات البيض المؤيدة والمضادة الموجودة في المكروية 1،2. من أجل دراسة المكروية الورم (TME) وتحديدا التعرف على مجموعات سكانية فرعية التسلل الكريات البيض، قمنا بتطوير طريقة لتقييم الأورام تحت الجلد في نموذج الورم الفئران. أهمية دراسة المكروية الورم هو معروف جيدا ودعمت في الأدب. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن ميزان المؤيدين والمضادة للورم تسلل الخلايا المناعية يمكن أن تؤثر على نتائج نمو الورم، وليس فقط في الماوس ولكن أيضا الدراسات الإنسانية (التي استعرضت في 3،4). على سبيل المثال، كورييل وآخرون أظهرت أن ساءت كانت مرتبطة النتائج السريرية في المرضى الذين يعانون سرطان المبيض مع وجود زيادة النسب المئوية للخلايا الورم التسلل التنظيمية CD4 + T (Tregs) 5. أظهر عملنا الخاص أيضا تأثير لاانخفض فيل الكريات البيض جاذب كيميائي على نسبة من مجموعات فرعية الكريات البيض في نموذج الفأر سرطان الجلد 6، والتي ترتبط أيضا مع نمو الورم. وهكذا، والآن يعترف تحليلات مفصلة لمجموعات فرعية الكريات البيض داخل الورم بشكل أوسع وذات أهمية متزايدة.
هناك العديد من الطرق لتقييم المكروية الورم لالتسلل الكريات البيض. وهندسيا على سبيل المثال مجموعات الفئران المعدلة وراثيا للتعبير عن مختلف البروتينات الفلورية من أجل صورة TME 7، المناعية الكلاسيكية والمناعي للأقسام الحفاظ 8، بما في ذلك طرائق التصوير المختلفة مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، الفحص المجهري متحد البؤر 9-11 - بعض، مع القدرة على مراقبة intravitally 10،12. هذه يمكن استخدامها مع مختلف وكلاء التصوير الجزيئي، مثل الجسيمات النانوية 13 أو عوامل التباين رواية 14 أن تسمية الخلايا المناعية. أسلوبنا هو النهج القائم على التدفق الخلوي، ولها العديد من المزايا.أولا، المكروية الورم بالكامل ويمكن أخذ عينات. في وقت التحليل، ومقطوعة الورم تحت الجلد كله والأطراف المحيطة جراحيا للمعالجة. هذا يلغي أي تحيز يحتمل أخذ العينات داخل الورم واحد ويعطي تحليلا أكثر "العالمي" للورم ككل. ثانيا، وذلك باستخدام التدفق متعدد الألوان الخلوي لتحليل مجموعات فرعية الكريات البيض يسمح لنا لقياس أكثر تحديدا النمط الظاهري من الكريات البيض التسلل. اعتمادا على عدد من الألوان المستخدمة، ويمكن تحديد مجموعات فرعية محددة للغاية. وهذا أمر مهم كما أن هناك عدة مجموعات فرعية الكريات البيض ضمن نوع من الخلايا معين - أو حتى في تصنيف فرعي العام - التي لها وظائف المتباينة التي يحتمل أن تكون هامة في تحديد مصير الورم. على سبيل المثال، الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (PDC) قد تورطت في المضادة للورم الحصانة 15. ومع ذلك، فقد أظهرت CCR9 + فرعية من PDCS أن يكون مولد للتحمل 16، وتحول مكتبة الإسكندريةانس هذه مجموعة فرعية قد يكون لها تأثير على نمو الورم.
أسلوبنا هو مناسب لتحت الجلد أو الأورام الأخرى التي يمكن مقطوعة جملة. في أيدينا، والأورام مقطوعة بشكل موحد في وقت القتل الرحيم. ومع ذلك، فمن المتصور، كما حدث في بعض الدراسات، أن وجود ورم تحت الجلد يمكن مقطوعة تماما مع إغلاق الجلد المحيطة بها في عملية جراحية بقاء 17، مما يتيح تقييم إضافي للحيوان. ثم يتم إجراء التحليل على الورم مقطوعة. وهكذا، فإن النتائج تمثل timepoint واحد في تنمية الورم. في حين أن هذا يسمح نظرة مفصلة في المكروية، بل هو أيضا صورة ثابتة من ما لا شك فيه عملية ديناميكية. ومع ذلك، الكريات البيض معزولة (على سبيل المثال عن طريق المغناطيسي الانفصال أو التدرج الكثافة) ثم يمكن تحليلها بشكل منفصل عن ظهائر الورم وسدى، أو استخدامها في أخرى، المقايسات الفنية لزيادة تحديد النمط الظاهري، وكما كان PREVIصفت سابقا 18. هذه الطريقة، ثم، سيكون مفيدا لأي المحققين المهتمين في فهم تكوين الكريات البيض داخل المكروية الورم في مرحلة زمنية معينة، سواء في الإعداد للدورة مرض طبيعي، أو بعد اضطراب علاجي معين. وإن لم يكن ذلك من قبلنا، ويمكن أيضا أن من المحتمل أن تستخدم أشكال مختلفة من هذا الإجراء لتحليل أجزاء محددة من ورم في عزلة. على سبيل المثال، نظرا لحجم الورم، والمنطقة الطرفية (ق) يمكن تشريح بعيدا عن المركزية، الأساسية ربما الناخر للورم لإعطاء الباحث وجهة نظر أكثر يعزلون مكانيا من المكروية الورم.
في مجال المزدهرة من ورم علم المناعة، وسوف يكون هناك شك في عدد متزايد باطراد من دراسات تقييم عوامل المناعية رواية في نماذج الفئران الورم. وقد أبرزت عدة تقارير الاختلافات في وظيفة الكريات البيض محددة داخل الورم مقابل الطرفية ENvironment و. على سبيل المثال، أظهرت شيفر-ويفر آخرون في نموذج الفأر أن مستضد معين T المستجيب CD8 + الخلايا، في حين تنشط في محيط، تم تحويلها إلى CD8 + T خلايا القامع بمجرد الاتجار بهم في المكروية ورم 19. كان هذا في جزء منه بسبب TGFβ، ولكن العوامل الأخرى التي يحتمل وتشارك كذلك. وهكذا، وتقييم مجموعات فرعية الكريات البيض - الأرقام والنسب، وكذلك الوضع الوظيفي - داخل الورم في حد ذاته سوف تعطي تمثيل أكثر دقة للتأثير تعديل مناعي خاص على مصير الورم.
تقنية تسمح لنا تحليلا مفصلا للورم، وتوفر للباحث فرصة لتحديد أكثر عن كثب التغيرات في السكان الكريات البيض من المناهج السابقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للستانفورد المعتمدة، بالو ألتو VA HCS، والمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية المؤسسية AnimalCare واستخدام اللجنة.
1. إعداد لجمع العينات وتجهيز (الوقت المطلوب: ~ 10-15 دقيقة)
- تطعيم خلايا سرطان الجلد B16F0 الفئران (0.5-1 × 10 6) تحت الجلد في أو بالقرب من خط الوسط من البطن في الإناث C57BL / 6 الفئران كما هو موضح سابقا 6. بدلا من ذلك، تطعيم الخلايا السرطانية في مواقع تشريحية إضافية (مثل الجناح، الثديية سادة الدهون، الخ).
ملاحظة: أي عدد من الأورام (زرع أو عفوية) يمكن استخدامها وتقييمها باستخدام هذا البروتوكول. على سبيل المثال، وغيرها التي تستخدم عادة أورام مسانج في C57BL / 6 ضمن السطر القولون MC38، لويس الرئة سرطان (LLC)، والخط البروستاتا TRAMP-C2. في حين xenografts الإنسان تلقيح في الفئران العوز المناعي ويمكن أيضا أن يتم تقييم في هذا الطريق، وتجدر الإشارة إلى أن عسوف بالضرورة أن تتغير rofiles من الكريات البيض-التسلل الورم وفقا لحالة العوز المناعي من الفأرة المضيف.- استخدام وسائل الإعلام كاملة (على سبيل المثال RPMI تحتوي على 10٪ FBS والمواد المضافة) أو عازلة أخرى التي تحتوي على البروتين المناسب (على سبيل المثال HBSS أو برنامج تلفزيوني + 1٪ FBS أو 1٪ BCS). هدئ وسائل الإعلام أو المخزن المؤقت إلى 4 درجات مئوية قبل euthanization.
- إعداد أنابيب جمع والمرشحات للأورام مقطوعة. وضع هذه على الجليد.
- استخدام واحد 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في الورم ليتم مقطوعة. إدراج 40-70 ميكرون فلتر تعليق خلية في كل واحد. بدلا من ذلك، استخدم 15 مل أنابيب المخروطية مع شبكة تصفية المعادن. استخدام حقنة الغطاس 5 مل أو قلم سميك لإنشاء فلتر على شكل كوب في الجزء العلوي من الأنبوب 15 مل.
- إعداد الأدوات اللازمة لاستئصال الورم وتجهيز؛ استخدام ملقط الجراحة ومقص غرامة لبتر والأورام العملية. استخدام الايثانول 70٪ لتنظيف الأدوات بين العينات استئصال / الورم. لعدد أكبر سو عينات (على سبيل المثال> 10)، ونحن نوصي معالجة في وقت واحد من قبل الباحثين عينات متعددة لتجنب اختلافات كبيرة في وقت المعالجة بين عينات الورم.
2. ورم استئصال (الوقت المطلوب: ~ 5 دقيقة / ورم)
- الموت ببطء B16 الفئران الحاملة للورم على حدة باستخدام ثاني أكسيد الكربون أو أي طريقة أخرى معتمدة.
- تأمين الماوس على مرحلة الجراحية. رش منطقة الورم مع 70٪ من الإيثانول وتمحو الزائدة. هذا يساعد على منع انتشار أي الحاضر الشعر. بالنسبة للفئران غير عارية، حلق منطقة الجلد حول الورم قبل استئصال حسب الحاجة.
- باستخدام ملقط ومقص، وبتر الورم تحت الجلد ككل، بما في ذلك المغطي والجلد المحيط. مبلغ "هامش" الجلد تؤخذ يمكن أن تختلف، ولكن عادة بتر 2-3 ملم من الجلد حول الورم.
- وزن الأورام مقطوعة (+/- الجلد المحيط) في هذه المرحلة. وضع القسم الجلد / الورم مقطوعة في المرشح المضمون داخل ررأنبوب مخروطي أستيك.
3. إعداد تعليق واحد ورم الخلية (الوقت المطلوب: ~ 5-7 دقيقة / ورم)
- استخدام ملقط ومقص لاللحم المفروم الورم والمغطي / الجلد المحيطة بها. تخطر على العينة باستخدام مقص حتى تتم معالجة كافة قطاعات واسعة من الأنسجة إلى 1-2 أقسام ملم.
ملاحظة: عادة، تتم معالجة الأورام كلها. بدلا من ذلك، لأورام الكبيرة، أقسام تمثيلية من الأورام يمكن مفروم ومعالجتها. - باستخدام المكبس من المتاح 5 أو 10 مل حقنة، تفصيل ميكانيكيا نسيج الورم مفروم ضد مرشح المضمون.
- باستخدام pipettor، وغسل نسيج الورم معالجتها مع 5-10 ملل من وسائل الاعلام البارد أو العازلة. هذا وسوف تدفق الخلايا واحد من خلال التصفية.
- كرر اثنين من الخطوات السابقة عدة مرات، وضمان أن العدد الإجمالي وحجم غسل ما يقرب من نفس عن الأورام ذات الحجم المماثل.
- بعد غسل نسيج الورم معالجتها، ومراقبةينبغي أن تترك شظايا صغيرة من الجلد و / أو الأنسجة الضامة الأخرى وراء في التصفية.
- بدلا من ذلك، للأورام حيث التفصيل الميكانيكية وحدها قد لا تكون كافية، والهضم مع كولاجيناز و / أو الإنزيمات الأخرى لا يمكن أن يؤديها قبل إجراء تنميق. وهذا سوف يسمح لتعليق خلية واحدة أكثر شمولا. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذه البروتوكولات الهضم يمكن أن تؤثر على المستضد السطحي التعبير 20، لذلك ينبغي اتخاذ الحذر في تفسير هذه النتائج.
- غسل وبيليه الخلايا عن طريق إضافة وسائل الاعلام / العازلة والطرد المركزي في 4 ° C 500 x ج لمدة 5 دقائق.
4. FACS تلون واحد تعليق خلية (الوقت المطلوب: ~ 30-60 دقيقة)
- Resuspend الخلايا في المخزن FACS الجليد الباردة (PBS + 1٪ FBS).
- عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام الأزرق التريبان وعدادة الكريات، أو العداد خلية الآلي.
- تحديد إجمالي العائد خلية قابلة للحياة لكل وحدة التخزين. هذه البيانات يمكن أن تستخدم لاستقراءالأعداد المطلقة للورم التسلل الكريات البيض في تركيبة مع البيانات FACS.
- تحديد عدد الخلايا لتكون ملطخة وتحليلها بواسطة FACS. سوف يتأثر بذلك عن طريق عدة عوامل (مثل الورم نوع الأنسجة، والعمر الورم وحجمه، ومتوسط نسبة الكريات البيض التسلل، وما إلى ذلك).
ملاحظة: في B16 سرطان الجلد، وجدنا نسبة منخفضة من ورم التسلل الكريات البيض (سمسم، عادة <5٪) مقارنة مع الخلايا السرطانية. وهكذا، تم جمع ما لا يقل عن 1 × 10 6 جميع الأورام (ورم + الكريات البيض التسلل) خلايا عادة عبر FACS للتحليل.- باستخدام البيانات العد التريبان الملطخة، وحجم المحسوبة من الخلايا لتكون ملطخة للFACS. على سبيل المثال، إذا سمسم تشكل عادة 5٪ من مجموع خلايا الورم (العديد من الخلايا السرطانية سوف يكون ميتا على وصمة عار التريبان)، عامل هذا في العدد الإجمالي للورم خلية واحدة تعليق لتكون ملطخة.
- لمجموعات فرعية الكريات البيض أقل شيوعا على سبيل المثال CCR9 + PDC) استخدام عدد أكبر من مجموع خلايا الورم (على سبيل المثال 2-3 × 10 6) لFACS تلطيخ، وبالنظر إلى التردد المنخفض النسبي لهذه الخلايا في تعليق خلية واحدة.
- وصمة عار على تعليق خلية الورم واحدة لFACS.
- ليعيش / التمييز ميت، واستخدام وصمة عار يمكن حلها أو وصمة عار غير يمكن حلها (مثل يوديد propidium) يمكن استخدامها. إذا كانت ملطخة الخلية دون الحي / الميت التمييز، والحذر يجب أن ينصح نظرا لإمكانية غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة.
- وصمة عار على تعليق خلية لمجموعات فرعية الكريات البيض محددة باستخدام معيار بروتوكول تلطيخ FACS. خلايا كتلة للحد من الأجسام المضادة غير محدد ملزم مع PBS / FBS تحتوي على 1٪ مصل الفئران والتيسير كتلة (معاداة CD16 / 32) لمدة 10 دقيقة قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة مستضد معين. تشمل الأجسام المضادة isotype السيطرة الصحيحة لضمان تلطيخ هو محدد.
- في هذه المرحلة، بعد تلطيخ FACS اكتمال، وتحديد العينات مع 4٪ الفورمالديهايد أو غيرها من وكيل تثبيتي مماثل. عينات في مخزن 4 ° C في دار (لتجنب التبريد من fluorophores) حتى وقت جمع وتحليل.
ملاحظة: تخزين عينات ثابتة لفترات طويلة من الزمن قد يؤدي إلى تغيير في إشارة وشدة fluorophores 21. - جمع العينات على عداد الكريات التدفق. سوف تدفق الأمثل عداد الكريات الإعدادات تختلف تبعا لنوع الصك والإعداد ليزر / كاشف.
ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون هناك التباين بين التجارب حتى لو باستخدام نفس الجهاز. وهكذا، نفذ الإعداد الجهاز المناسب (على سبيل المثال باستخدام الخرز المعايرة) لضمان تحديد التعويض المناسب قبل جمع وتحليل كل تجربة FACS.
- تحليل مجموعات فرعية leukoctye
- باستخدام FACS برامج تحليل البيانات، وتحليل البيانات. ل/ وصمة عار الميتة الحية، تبدأ من خلال النابضة من الخلايا الميتة. استخدام الأجسام المضادة ضد علامة محددة الكريات البيض (مثل مكافحة CD45) لتحديد الكريات البيض داخل الخلايا الحية.
- بعد هذا، واستخدام مختلف غاتيمخططات نانوغرام لتحديد مجموعات فرعية محددة، اعتمادا على بروتوكول تلطيخ. على سبيل المثال، لتحديد الخلايا CD4 + T، تحديد المنطقة SSC لو من السكان CD45 + وتحديد CD19-CD3 + الخلايا. من هذا CD4 + T الخلايا يمكن تحديد 22.
- تحليل البيانات وتقديمها في عدد من الطرق المختلفة لضمان الاتساق وتحديد أنماط أو اتجاهات (أي استخدام الأرقام الإجمالية، والنسب المئوية، أو نسب لتحديد مجموعات فرعية).
ملاحظة: على سبيل المثال، ونحن ننظر إلى مجموع CD45 + الحية خلايا كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا السرطانية التي تم جمعها (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، فإننا ثم احتساب نسبة كل مجموعة فرعية الكريات البيض (مثل خلايا CD4 + T) داخل الورم ومقارنة هذه النسب كما بين جهاز التحكم ومجموعات اختبار (الشكل 3).
- باستخدام FACS برامج تحليل البيانات، وتحليل البيانات. ل/ وصمة عار الميتة الحية، تبدأ من خلال النابضة من الخلايا الميتة. استخدام الأجسام المضادة ضد علامة محددة الكريات البيض (مثل مكافحة CD45) لتحديد الكريات البيض داخل الخلايا الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت نتائجنا التي أجبرت أكثر تعبيرا عن chemerin في الأورام B16 الفئران زادت النسبة المئوية للورم التسلل الكريات البيض (TILs). بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد تغييرات على نسبة النسبية لمجموعات فرعية الكريات البيض ممثلة في المكروية الورم المرتبطة chemerin التعبير. إعادة طباعة بإذن من Pachynski وآخرون. 6.
ويبين الشكل 1 أن هناك زيادة كبيرة في إجمالي CD45 + الخلايا (TILs) داخل في الأورام التي أعرب عنها chemerin مقارنة مع الضوابط، على النحو الذي يحدده تحليل FACS من يوم 17 مقطوعة الأورام. باستخدام الملون، cryosectioned B16 الأورام، والزيادة في التسلل CD45 + الخلايا عن طريق المناعي للأورام وأكد (الشكل 2).
يظهر مزيد من التحليل للبيانات FACS زيادة نسبية، في المتوسط، من خلايا NK، وخلايا T، والتقليدية DC (لين-B220- CD11c و+) في الأورام حيث chemeوكان رين خلال اعرب مقارنة أورام التحكم (الشكل 3). كان هناك انخفاض نسبي في النسب المئوية للمجموعات فرعية الكريات البيض التي لها دور في قمع أو كبت الاستجابات المناعية، وخلايا القامع تحديدا المستمدة النخاعي (لين CD11b + GR1 +) والحزب الديمقراطي المسيحي (Lin- B220 + CD11c وكثافة العمليات PDCA1 +) 16،23 .
وقد أظهرت عدد متزايد من الدراسات أن نسبة مجموعات فرعية الكريات البيض داخل المكروية الورم ليكون عاملا هاما، سواء من حيث نمو الورم والنتائج السريرية 4،24،25. تم تحليل البيانات FACS لدينا مزيد من الكشف عن عدد من خلايا T (إجمالي CD3 +) والخلايا القاتلة الطبيعية لكل خلية الورم. وهذه أنواع الخلايا ممثلة على نحو متزايد في الأورام، معربا عن chemerin مقارنة مع الضوابط (الشكل 4).
مقارنة مباشرة لالمستجيب (أي الخلايا القاتلة الطبيعية وT) وخلية القامع (أي MDSC وPDC) السكان داخل الورم microenviron منة لكلا الفريقين الورم كان في ذلك الحين يقوم به. ويبين الشكل 5 زيادات كبيرة في نسب المستجيب لسكان الخلية القامع داخل الأورام، معربا عن chemerin مقارنة مع الضوابط.
وعموما، فقد بينت النتائج تمثيلية آثار chemerin التعبير في المكروية الورم على السكان الكريات البيض فرعية، وانحراف إيجابي لهؤلاء السكان ونسب بطريقة تتفق مع فائدة سريرية رأيت.
وقد تم تحليل زيادة الورم التسلل الكريات البيض في الأورام، معربا عن chemerin الأورام رفعه من التعبير-chemerin مقابل السيطرة في يوم 17 لCD45 + الكريات البيض التسلل (٪ من خلايا قابلة للحياة) عن طريق التدفق الخلوي.: الشكل 1. * P <0.05 كتبها t-اختبار ثنائي الطرف الطالب تبين يعني ± SEM من مع 4 أو أكثر من الفئران في المجموعة.
2 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52657 / 52657fig2.jpg "/>
. الشكل 2: التصوير من B16 سرطان الجلد سمسم الصور المناعي توضح CD45 + خلية تتسرب (السهام البيضاء) في السيطرة والميلانينية رفعه في يوم 9 معربا عن chemerin؛ يمثل شريط 25 ميكرون.
الشكل (3): تم تحويل غيرت تمثيل مجموعات فرعية الكريات البيض في الأورام، معربا عن chemerin FACS تحليل البيانات عن طريق نسبة سجل 2 من سمسم تردد فرعية في chemerin- معربا عن مباراة الأورام تحكم عن الحزب الديمقراطي المسيحي (بلازماوية الشكل العاصمة؛ Lin- CD11c وكثافة العمليات B220 + PDCA1 +)، CDC (DC التقليدية؛ لين CD11c ومرحبا B220-)، CD4 (CD3 + CD4 +) خلايا T، خلايا CD8 (CD3 + CD8 +) T، مجموع خلايا T (CD3 + CD4 + وCD3 + CD8 +)، وخلايا NK (CD3-NK1. 1+)، CD11b (لين CD11b +) الوحيدات / الضامة، MDSC (النخاعي المستمدة خلايا القامع، لين CD11b + GR1 +)، والخلايا CD19 + B (CD3-CD19 +).
جوري 4 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52657 / 52657fig4.jpg "/>
الرقم 4: نسب المستجيب غيرت إلى الكريات البيض القامع في B16 الأورام يوم 17 B16 أورام سرطان الجلد تم تحليلها من قبل FACS كما هو موضح. تم تحديد مجموعات فرعية الكريات البيض الفردية المعزولة. ثم تم حساب نسبة NK أو مجموع الخلايا T لMDSC أو PDC في كل نوع الورم.
وقد تم تحليل زيادة الخلايا المستجيب في الأورام B16، معربا عن chemerin التحكم أو الأورام، معربا عن chemerin بواسطة FACS: الرقم 5. تم حساب الأعداد المطلقة للT والخلايا القاتلة الطبيعية لكل 10،000 مجموع خلايا الورم باستخدام البيانات FACS. النتائج من تجربة تمثيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إجراء تحليل مفصل للالمكروية الورم أمر بالغ الأهمية في تحديد آليات وآثار تعديل مناعي. مع وجود زيادة من immunotherapeutics في المجال السريري البشري، فهم تأثير هذه العوامل على الورم التسلل الكريات البيض أصبح شرطا في تحديد آلية عملها. في البشر، وهناك كثير من الأحيان وجود صعوبات السريرية و / أو اللوجستية في الحصول على وتحليل أنسجة الورم للتحليل الكريات البيض فرعية، وبالتالي تحليل الاستجابة المناعية الطرفية وغالبا ما يتم تنفيذ. إجراء الدراسات قبل السريرية في نماذج حيوانية يسمح للباحث لاستكشاف المزيد تماما من تأثير العوامل المناعية على الجهاز المناعي داخل الورم نفسه، وبالتالي إعطاء نظرة إضافية إلى الآليات التي قد تؤثر على النتائج السريرية.
تقنية تسمح لنا تحليلا مفصلا من الكريات البيض-التسلل الورم. لأنه لا يمكن المكروية الورم بالكاملأخذ عينات، وهو رأي أكثر عالمية من وجود المناعة داخل الورم يمكن تقييم. و، في نهاية المطاف، وميزان خلايا القامع الموالية للورم وخلايا المستجيب المضادة للورم يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نمو الورم والنتائج السريرية 4. وهكذا، وهذا النوع من التحليل هو قيمة في توفير الباحث بمعلومات مفصلة عن مجموعات فرعية الكريات البيض محددة الحالية. ويمكن استخدام هذه البيانات التفصيلية في تركيبة مع البيانات الفنية الأخرى لزيادة توضيح آليات مناعية داخل الورم.
البساطة النسبية للبروتوكول يسمح احد لتقييم الأفواج الكبيرة من الأورام من أجل تقليل التباين داخل المجموعات. مقارنة مع اقتراب أكثر نموذجية وانتشارا من التصوير (إما عن طريق IHC أو المناعي)، تقنية تسمح لنا تحديد مجموعات فرعية الكريات البيض محددة للغاية من خلال الاستفادة من تدفق متعدد الألوان الخلوي. القدرة على أخذ عينات إما الورم بأكمله (بما في ذلك محيط) أو قسم منالورم يعطي مرونة إضافية الباحث من حيث أخذ العينات وتحليلها. هذا يسمح أيضا تجميع أكثر بكثير البيانات المتعلقة الكريات البيض مما يمكن الحصول عليها من خلال تحليل أقسام الأنسجة متعددة عن طريق التصوير، وبالتالي إعطاء صورة أكثر دقة من المكروية الورم.
نحن استخدمت هذه التقنية على الأورام تحت الجلد، والتي تستخدم على نطاق واسع في نماذج الماوس نظرا لسهولة النسبية للتلقيح الورم والقياسات. وبالتالي، فإن هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق لالمرجح أغلبية النماذج المستخدمة الورم. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لأورام مقطوعة من نماذج ورم مثلي أو عفوية، وإن كان ذلك مع خطوات إضافية لاستئصال الورم. وبينما B16 سرطان الجلد لا تتطلب الهضم انزيم للحصول على تعليق خلية واحدة، قد يكون هناك أنواع الأورام الأخرى التي تتطلب هذه الخطوة للحصول على الزي الرسمي، وممثل تعليق خلية واحدة. وهناك أيضا المزايا التي التصوير من secti الورمإضافات يتيح التي لا يمكن تقييمها مع أسلوبنا. على سبيل المثال، يمكن الحصول على بيانات أكثر تحديدا بشأن توطين الكريات البيض داخل المكروية الورم من خلال IHC / IF، وهذا قد يكون في كثير من الأحيان إضافة قيمة إلى البيانات المقدمة من تحليل FACS.
في الختام، تقنية لدينا لتقييم مجموعات فرعية الكريات البيض داخل المكروية ورم تسمح للباحث لإجراء تحليلات مفصلة لوجود المناعة داخل الورم باستخدام بروتوكول بسيط نسبيا. ويمكن تطبيقها على غالبية نماذج ورم الماوس ويمكن أن تساعد في توضيح معلومات قيمة عن نوع الكريات البيض، عدد، ونسب الحالي داخل الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة R01-CA169354 وR01-047822 من المعاهد الوطنية للصحة وجائزة تقدير من وزارة شؤون المحاربين القدامى (ECB). وأيد RKP من قبل المعاهد الوطنية للصحة T32 CA009287-30A1، وهي جائزة الباحث ASCO يونغ، كاليفورنيا سرطان الثدي بحوث زمالة مشروع، وجمعية السرطان الأمريكية إرشادهم بحوث الباحث غرانت. وأيد BAZ من قبل منحة AI079320 NIH. وأيد JM التي كتبها المنح الدراسية من المعاهد الوطنية للصحة T-32 منحة تدريبية T32-AI07290- 25، T32-AI07290-24 وجمعية السرطان الأمريكية زمالة ما بعد الدكتوراه PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
