Abstract
תאים חיסוניים מיוחדים הלחדור מייקרו-הסביבה של הגידול להסדיר את הצמיחה והישרדות של neoplasia. תאים ממאירים חייבים להתחמק או לחתור תחת תגובות חיסוני אנטי-סרטנית על מנת לשרוד ולשגשג. גידולים לנצל מספר המנגנונים השונים של חיסון "בריחה", ובכלל זה הגיוס של DC tolerogenic, תאי T רגולטורים לדיכוי המערכת החיסונית (Tregs), ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSC) המעכבים תגובות אנטי-סרטניים רעילות לתאים. לעומת זאת, תאים חיסוניים מפעיל אנטי-סרטני יכולים להאט את הצמיחה והתרחבות של גידולים ממאירים: תאים דנדריטים immunostimulatory, תאי רוצח טבעיים שנמל חסינות אנטי גידול מולדת, ותאי T ציטוטוקסי כל יכולים להשתתף בדיכוי גידולים. האיזון בין כדוריות דם לבנות בעד ונגד גידול סופו של דבר קובע את התנהגותו וגורלו של תאים הפכו; מספר רב של מחקרים קליניים בבני אדם נשא את זה. לפיכך, ניתוח מפורט של תת ויקוציטים במייקרו-הסביבה של הגידול הפכה להיות חשובה יותר ויותר. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח תת ויקוציטים להסתנן לתוכם נוכחי במייקרו-הסביבה של הגידול במודל גידול עכבר. תאי גידול מלנומה B16 העכבר היו מחוסן תת עורי בעכברי C57BL / 6. בזמן מסוים, גידולים ועור שמסביב היו כריתה כמקשה אחת ומעובדים להשעיות תא בודדות, אשר לאחר מכן היו מוכתמת עבור צבע רב cytometry זרימה. תוך שימוש במגוון של סמני משנה לויקוציטים, היינו יכול להשוות את האחוזים היחסי של חדירה תת ויקוציטים בין שליטה וגידולים להביע chemerin. חוקרים ישתמשו בכלי כזה כדי ללמוד את נוכחות החיסון במייקרו-הסביבה של הגידול ובשילוב עם מדידות גודל קליפר מסורתיות של צמיחת גידול, יהיה פוטנציאל לאפשר להם לברר את ההשפעה של שינויים בהרכב חיסון על צמיחת גידול. כגון טכניקה יכולה להיות מיושמת על כל מודל גידול שבו הגידול וג מייקרו-הסביבה שלהלהיות כריתה ועיבוד.
Introduction
האיזון בין צמיחת גידול וקידום ונסיגה הוא, בחלקו, תלוי באיזון של לויקוציטים הנוכחי במייקרו-הסביבה 1,2 פרו ואנטי-סרטני שחדר. כדי ללמוד מייקרו-הסביבה של הגידול (TME) ובמיוחד לזהות את תת-אוכלוסיות לויקוציטים להסתנן לתוכם, פיתחנו שיטה להערכה של גידולים תת עורית במודל עכברי גידול. החשיבות של לימוד מייקרו-הסביבה של הגידול ידועה ונתמך בספרות. מחקרים רבים הראו כי המאזן של תאי מערכת חיסון פרו ואנטי-סרטניים שחדר יכול להשפיע על התוצאות של גידול, לא רק בעכבר, אלא גם מחקרים בבני אדם (שנסקרו ב3,4). לדוגמא, קוריאל et al. הראה שהחמיר תוצאות קליניות בחולי סרטן השחלות היו מתואמות עם הנוכחות של הגדלת האחוזים של תאים שחדר-גידול רגולציה CD4 + T (Tregs) 5. העבודה שלנו הראתה גם ההשפעה לאchemoattractant ויקוציטים vel על היחס של תת ויקוציטים במודל מלנומה עכבר 6, שגם בקורלציה עם הירידה בצמיחת גידול. לפיכך, הניתוחים מפורטים של תת ויקוציטים בתוך גידול עכשיו הכירו באופן רחב יותר וחשובים יותר ויותר.
ישנן דרכים רבות להעריך את מייקרו-הסביבה של הגידול לחדירה לויקוציטים; למשל קבוצות מהונדסות עכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון שונים על מנת תמונה 7 TME, אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence סעיפים השתמרו 8, כוללים שיטות הדמיה שונות, כגון MRI, PET, מיקרוסקופיה confocal 9-11 הקלסית - חלקם עם היכולת לפקח intravitally 10,12. אלה יכולים לשמש עם סוכנים שונים מולקולריים הדמיה, כגון חלקיקים 13 או סוכנים בניגוד רומן 14 שתווית תאים חיסוניים. השיטה שלנו היא גישה מבוססת cytometry זרימה ויש לו כמה יתרונות.ראשית, כל מייקרו-הסביבה של הגידול ניתן לדגום; בעת הניתוח, הגידול תת עורי כל והפריפריה שמסביב שעברו כריתה כירורגית לעיבוד. זו מבטלת כל הטיה פוטנציאלית דגימה בתוך גידול יחיד ונותנת ניתוח יותר "גלובלי" של הגידול בכללותו. שנית, באמצעות זרימת ססגוניות cytometry לנתח את תת ויקוציטים מאפשר לנו לאמוד את הפנוטיפ של לויקוציטים מסתנן באופן יותר ספציפי. בהתאם למספר של צבעים המשמשים, ניתן לזהות תת מאוד ספציפיים. זה חשוב כמו שיש כמה תת ויקוציטים בסוג תא מסוים - או אפילו בסיווג תת סוג כללי - שיש פונקציות שונות, כי הם עלולים להיות משמעותיים בקביעת גורלו של הגידול. לדוגמא, תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) היו מעורבים בחסינות אנטי גידול 15. עם זאת, קבוצת משנה CCR9 + של pDCs הוכח להיות 16 tolerogenic, והסטת baרומח של משנה כאמור יכול להיות השפעה על צמיחת גידול.
השיטה שלנו היא מתאימה לתת עורית או גידולים אחרים שניתן שעברו כריתה כמקשה אחת. בידיים שלנו, שעברו כריתת גידולים אחידות בזמן של המתת חסד. עם זאת, מתקבלים על הדעת, כפי שנעשה בחלק מהמחקרים, כי גידול תת עורי יכול להיות שעבר כריתה מלאה עם סגירת העור שמסביב בניתוח הישרדות 17, ובכך מאפשרת הערכה נוספת של בעלי החיים. הניתוח מבוצע לאחר מכן על גידול resected. לפיכך, התוצאות מייצגות נקודת זמן בהתפתחותו של הגידול. אמנם זה מאפשר מבט מפורט למייקרו-הסביבה, היא גם תמונה סטטית של מה הוא ללא ספק תהליך דינמי. עם זאת, לויקוציטים המבודדים (למשל באמצעות מגנטי הפרדה או שיפוע צפיפות) אז יכול להיות מנותח בנפרד מepithelia הגידול וסטרומה, או בשימוש במבחנים אחרים, פונקציונליים להגדיר הפנוטיפ שלהם עוד יותר, כפי שהיה previלכן תיארו 18. שיטה זו, אם כן, תהיה שימושית עבור כל חוקרים מעוניינים להבין את ההרכב של כדוריות הדם לבנות במייקרו-הסביבה של הגידול בנקודת זמן נתונה, אם בהגדרה של מהלך המחלה הטבעי, או לאחר ההפרעות טיפוליות ספציפיות. למרות שלא נעשה על ידי אותנו, וריאציות של הליך זה יכול גם פוטנציאל לשמש כדי לנתח חלקים מסוימים של גידול בבידוד. לדוגמא, בהתחשב בגודלו של הגידול, אזור הפריפריה (ים) יכול להיות גזור מהליבה המרכזית, אולי נימקי של הגידול לתת החוקר יותר מרחבית נפרדת נוכח מייקרו-הסביבה של הגידול.
בתחום המתפתח של אימונולוגיה גידול, שם יהיה ללא ספק מספר גדל באופן אקספוננציאלי של מחקרי הערכת סוכני המערכת החיסונית רומן במודלים עכבריים גידול. מספר דוחות הדגישו את ההבדלים בתפקוד ויקוציטים ספציפיים בתוך הגידול לעומת פריפרית environment. לדוגמא, שפר-יבר et al. הראה במודל של עכברים שמפעיל T אנטיגן ספציפי לתאי CD8 +, בעוד פעיל בפריפריה, הפכו לתאים המדכאים CD8 + T ברגע שהם הוברחו לתוך מייקרו-הסביבה של גידול 19. זה היה בין שאר בשל TGFβ, אבל גורמים אחרים קרוב לוודאי מעורבים גם כן. לפיכך, הערכה תת ויקוציטים - מספרים ויחסים, כמו גם מצב תפקודי - בתוך הגידול עצמו תיתן ייצוג מדויק יותר של ההשפעה של תפקוד מערכת חיסון בפרט על גורל גידול.
הטכניקה שלנו מאפשרת ניתוח מפורט של הגידול ומספקת החוקר הזדמנות לזהות באופן הדוק יותר לשינויים באוכלוסיות לויקוציטים מגישות קודמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים בבעלי החיים נערכו בהתאם לסטנפורד אושר, Palo Alto VA HCS, ומכונים לאומי לבריאות הנחיות המוסדית AnimalCare ועדת השימוש.
1. הכנה לאוסף דוגמאות ועיבוד (זמן הנדרש: ~ דקות 10-15)
- לחסן תאים מלנומה B16F0 עכבריים (0.5-1 x 10 6) תת עורי ליד או קו האמצע של הבטן בC57BL / 6 נקבות עכברים כפי שתואר לעיל 6. לחלופין, לחסן תאים סרטניים באתרים אנטומיים נוספים (למשל אגף, כרית שומן החלב, וכו ').
הערה: כל מספר של גידולים (מושתל או ספונטני) יכול לשמש והוערכו באמצעות פרוטוקול זה. לדוגמא, אחרים נפוץ גידולי syngeneic בC57BL / 6 כוללים את קו המעי הגס MC38, לואיס ריאות Carcinoma (LLC), וקו-נווד C2 ערמונית. אמנם גם ניתן להעריך xenografts אדם מחוסן לעכברי immunodeficient בדרך זו, יש לציין כי profiles של לויקוציטים הסתננות-הגידול בהכרח לשינוי בהתאם למצב immunodeficient של עכבר המארח.- להשתמש במדיה מלאים (לדוגמא RPMI המכיל 10% FBS ותוספים) או אחר חיץ המכיל חלבון מתאים (למשל HBSS או FBS + 1% PBS או BCS 1%). צ'יל תקשורת או חיץ עד 4 מעלות צלזיוס לפני euthanization.
- הגדרת צינורות איסוף ומסננים לגידולים שעברו כריתה; במקום אלה על קרח.
- השתמש בצינור חרוטי מיליליטר אחד 50 לגידול לכריתה. הכנס מסנן השעיה תא 40-70 מיקרומטר בכל אחד. לחלופין, להשתמש בצינורות חרוטי 15 מיליליטר עם מסנן רשת מתכת. השתמש בוכנת מזרק 5 מיליליטר או עט עבה כדי ליצור מסנן בצורת כוס בחלק העליון של צינור 15 מיליליטר.
- הכן מכשירים לעיבוד כריתה וגידול; להשתמש במלקחיים כירורגיים ומספריים עדינים ללכרות וגידולי תהליך. השתמש 70% אתנול לניקוי מכשירים בין דגימות כריתות / גידול. לo מספר גדולה יותרדגימות f (למשל> 10), אנו ממליצים עיבוד בו זמני של דגימות על ידי חוקרים רבים כדי להימנע מהבדלים משמעותיים בזמן עיבוד בין דגימות גידולים.
2. כריתת גידול (זמן הנדרש: ~ 5 דקות / גידול)
- להרדים עכברי נושאי גידול B16 בנפרד באמצעות פחמן דו חמצני או שיטה אחרת שתאושר.
- לאבטח את העכבר על במה כירורגי. לרסס את אזור הגידול עם 70% אתנול ולנגב את העודפים; זה מסייע במניעת הפצה של כל נוכחים שיער. לעכברים שאינם עירום, לגלח את העור סביב אזור הגידול לפני הכריתה לפי צורך.
- בעזרת מלקחיים ומספריים, לכרות את הגידול תת עורי כמקשה אחת, ובכלל זה שמעליה ומקיף את העור. הסכום של עור "שוליים" שצולם יכול להיות מגוון, אך בדרך כלל לכרות 2-3 מ"מ של עור סביב הגידול.
- שוקל גידולים שעברו כריתה (+/- עור שמסביב) בשלב זה. הנח את סעיף עור / גידול שעבר כריתה במסנן מובטח בתוך plצינור חרוטי astic.
3. הכנת השעיה גידול תא בודד (זמן הנדרש: ~ 5-7 דק '/ גידול)
- מלקחיים שימוש ומספריים כדי לרכך גידול ושמעליה / עור שמסביב. ברר במדגם באמצעות מספריים עד שכל החלקים הגדולים של רקמה מעובדים למקטעים מ"מ 1-2.
הערה: בדרך כלל, כל גידולים מעובדים; לחלופין, במקרים של גידולים גדולים יותר, חלקי נציג של גידולים יכולים להיות טחונים ומעובד. - באמצעות בוכנה של מזרק 5 או 10 מיליליטר חד פעמי, מכאני disaggregate רקמת גידול הטחון נגד המסנן המאובטח.
- שימוש pipettor, לשטוף את רקמת גידול מעובד עם 5-10 MLS של תקשורת או חיץ קר. זה לשטוף את התאים בודדים דרך המסנן.
- חזור על שני שלבים מעל מספר פעמים, על מנת להבטיח כי המספר והכרכים של כביסות בסך הכל הם בערך אותו דבר עבור גידולים בגודל דומה.
- לאחר שטיפת רקמת גידול מעובד, להתבונןשברים קטנים של עור ו / או רקמת חיבור אחרת צריכים להישאר מאחור במסנן.
- לחלופין, לגידולים שבי disaggregation המכני לבד לא יכול להיות מספיק, עיכול עם collagenase ו / או אנזימים אחרים יכול להתבצע לפני ההליך המצועצע. זה יאפשר להשעית תא בודדת יסודית יותר. עם זאת, יש לציין כי פרוטוקולי עיכול כזה יכול להשפיע על ביטוי אנטיגן שטח 20, כך זהירות יש לנקוט בפרשנות תוצאות אלה.
- לשטוף וגלולת התאים על ידי הוספת תקשורת / חיץ וצנטריפוגה ב 4 ° C XG 500 במשך 5 דקות.
מכתים 4. FACS של תרחיף תא בודד (זמן הנדרש: ~ 30-60 דקות)
- תאי Resuspend במאגר FACS הקר כקרח (PBS + 1% FBS).
- ספירת תאי קיימא באמצעות trypan הכחול וhemacytometer, או נגד תא אוטומטי.
- לקבוע תשואת תא קיימא הכוללת לכל נפח. נתונים אלה יכולים לשמש כדי להסיקמספרים מוחלטים של לויקוציטים גידול שחדר בשילוב עם נתונים FACS.
- לקבוע את מספר התאים להיות מוכתם ונותח על ידי FACS. זה יהיה מושפע ממספר גורמים (סוג היסטולוגיה למשל גידול, גיל גידול וגודל, אחוז הממוצע של לויקוציטים הסתננות, וכו ').
הערה: מלנומה B16, שמצאנו אחוז נמוך של כדוריות דם לבנות גידול הסתננות (TIL; בדרך כלל <5%) בהשוואה לתאים סרטניים. כך, תאים (לויקוציטים חדירת גידול +) לפחות 1 x 10 6 גידול כולל נאספו בדרך כלל באמצעות FACS לניתוח.- השימוש בנתונים של הספירה מוכתמת trypan, נפח מחושב של תאים להיות מוכתם עבור FACS. לדוגמא, אם TIL בדרך כלל מהווה 5% מכלל תאי גידול (רב של התאים הסרטניים יהיה מת על כתם trypan), גורם זה למספר הכולל של השעיה תא בודד גידול להיות מוכתם.
- לתת ויקוציטים פחות נפוצים כגון CCR9 + PDC) להשתמש במספר גדול יותר של תאי גידול כולל (למשל 2-3 x 10 6) מכתים FACS, בהתחשב בתדירות הנמוכה היחסית של תאים אלה בהשעית התא בודדת.
- להכתים את ההשעיה תא בודד גידול לFACS.
- לאפליה חיות / מת, להשתמש כתם ניתן לתקן או כתם שאינה ניתן לקביעה (למשל propidium יודיד) ניתן להשתמש. אם תא מוכתמים ללא אפליה חיות / מת, יש להיזהר יעץ בהתחשב בפוטנציאל לכריכה הלא ספציפית של נוגדנים.
- להכתים את ההשעיה התא לתת ויקוציטים ספציפיים באמצעות פרוטוקול מכתים FACS סטנדרטי. תאי בלוק כדי להפחית נוגדן שאינו ספציפי מחייב עם PBS / FBS המכיל 1% בסרום חולדה ובלוק Fc (אנטי-CD16 / 32) במשך 10 דקות לפני צביעה עם נוגדני אנטיגן ספציפי. כולל נוגדנים לשלוט אלוטיפ הנכונים כדי להבטיח מכתים הוא ספציפי.
- בשלב זה, לאחר צביעת FACS הושלמה, לתקן דגימות עם פורמלין 4% או סוכן מקבע דומה אחר. דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס בdaRK (כדי למנוע מרווה של fluorophores) עד הזמן של איסוף וניתוח.
הערה: אחסון דגימות קבועות לפרקי זמן ארוכים עלולה לגרום לשינוי באות ועוצמת fluorophores 21. - לאסוף את הדגימות על cytometer זרימה. זרימה אופטימלית cytometer הגדרות תשתנה בהתאם לסוג המכשיר והתקנת לייזר / גלאי.
הערה: בנוסף, לא יכולה להיות שונות בין הניסויים גם אם משתמש באותו מחשב. לפיכך, לבצע התקנת מכונה מתאימה (למשל באמצעות חרוזים כיול) כדי להבטיח הגדרת פיצוי מתאימה לפני אוסף FACS וניתוח של כל ניסוי.
- ניתוח של תת leukoctye
- שימוש בתוכנת ניתוח נתונים FACS, כדי לנתח את הנתונים. לכתם חי / מת, להתחיל על ידי gating את תאים מתים. השתמש נוגדנים נגד סמן ספציפי לויקוציטים (למשל אנטי CD45) לזהות leukocytes בתוך תאי חיים.
- אחרי זה, השתמש בgati השוניםתוכניות ng לזהות תת ספציפיים, בהתאם לפרוטוקול מכתים. לדוגמא, כדי לזהות תאי CD4 + T, בחר אזור SSC lo מאוכלוסיית CD45 + ובחר את התאים + CD19-CD3; מתאי CD4 + T זה יכול להיות מזוהה 22.
- לנתח את הנתונים ולהציג אותו במספר הדרכים שונות על מנת להבטיח עקביות ולזהות דפוסים או מגמות (כלומר להשתמש כולל מספרים, אחוזים, או יחסים לכמת תת).
הערה: לדוגמא, הסתכלנו CD45 החי הכולל + תאים כאחוז מתאי גידול כולל שנאספו (איור 1). בנוסף, אנו חשבנו את האחוז של כל תת-קבוצה ויקוציטים (למשל תאי CD4 + T) בתוך הגידול והשוואה אלה כיחסים בין השליטה וקבוצות בדיקה (איור 3).
- שימוש בתוכנת ניתוח נתונים FACS, כדי לנתח את הנתונים. לכתם חי / מת, להתחיל על ידי gating את תאים מתים. השתמש נוגדנים נגד סמן ספציפי לויקוציטים (למשל אנטי CD45) לזהות leukocytes בתוך תאי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות שלנו הראו שאילצו את יתר הביטוי של chemerin בגידולי B16 העכבריים augmented אחוז של לויקוציטים גידול הסתננות (המח"טים). בנוסף, שינויים במשקל היחסי של תת ויקוציטים ייצוג בתוך מייקרו-הסביבה של גידול הקשורים לביטוי chemerin זוהו. להדפיס מחדש באישור et al Pachynski. 6.
איור 1 מראה כי חלה עלייה משמעותית בCD45 + תאים כולל (המח"טים) בתוך בגידולים אשר בטאה chemerin השוואה לקבוצת ביקורת, כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS של יום resected 17 גידולים. באמצעות צבעוני, cryosectioned B16 גידולים, הגידול בחדירת CD45 + תאים על ידי immunofluorescence של גידולים אושר (איור 2).
ניתוח נוסף של נתוני FACS תערוכות גידול יחסי, בממוצע, של תאי NK, תאי T, וקונבנציונלי DC (Lin-B220- CD11c +) בגידולים בי chemeרין היה בא לידי ביטוי על-השוואה לגידולי שליטה (איור 3). חלה ירידה יחסית באחוזים תת ויקוציטים שיש להם תפקיד בדיכוי או עלול לדכא את המערכת חיסונית, תאים המדכאים במיוחד מיאלואידית-נגזרו (Lin-CD11b + GR1 +) וPDC (B220 + + PDCA1 Lin- CD11c int) 16,23 .
מספר גדל והולך של מחקרים הראה היחס של תת ויקוציטים במייקרו-הסביבה של הגידול להיות גורם חשוב, גם במונחים של צמיחת גידול ותוצאות קליניות 4,24,25. נתונים FACS נותחו נוסף כדי לחשוף את מספר תאי T (סה"כ CD3 +) ותאי NK לתאים סרטניים; אלו סוגי תא היו מיוצגים יותר ויותר בגידולים להביע chemerin השוואה לקבוצת ביקורת (איור 4).
השוואה ישירה של מפעיל (כלומר תאי NK וT) ותא מדכא (MDSC כלומר וPDC) אוכלוסיות בתוך microenviron הגידול ment עבור שני קבוצות הגידול היה אז ביצע. איור 5 מראה עלייה משמעותית ביחסים של מפעיל לאוכלוסיות תאים המדכאים בתוך הגידולים להביע chemerin השוואה לקבוצת ביקורת.
בסך הכל, תוצאות הנציג להראות את ההשפעות של chemerin ביטוי במייקרו-הסביבה של הגידול באוכלוסיות משנה לויקוציטים, והעיקום החיובי של אוכלוסיות אלה ויחסים באופן עקבי עם התועלת הקלינית ראתה.
. איור 1: גידולי leukocytes גידול חדירה מוגברת בגידולים להביע chemerin נכרת מן chemerin להביע vs שליטה ביום 17 נותחו לCD45 + חדירה לויקוציטים (% מתאי קיימא) על ידי cytometry זרימה; * P <0.05 על ידי מבחן t שני זנב מראה ממוצע ± SEM של עם 4 או יותר עכברים לכל קבוצה.
2 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,657 / 52657fig2.jpg "/>
. איור 2: הדמיה של מלנומה B16 TIL תמונות Immunofluorescence להמחיש מחלחל CD45 + תא (חיצים לבנים) בשליטה ולנומה נכרת ביום 9 להביע chemerin; בר מייצג 25 מיקרומטר.
. איור 3: ייצוג Altered של תת ויקוציטים בגידולים להביע chemerin FACS מנתח את הנתונים הוסב באמצעות יומן 2 יחס של תדירות משנה TIL בchemerin- להביע vs גידולי שליטה לPDC (plasmacytoid DC; B220 Lin- int CD11c + PDCA1 +), CDC (DC קונבנציונלי; B220- היי לין-CD11c) תאי T, CD4 (CD3 + CD4 +), תאי CD8 (CD3 + CD8 +) T, תאים כולל T (CD3 + CD4 + וCD3 + CD8 +), תאי NK (CD3-NK1. 1+), מונוציטים / מקרופאגים, MDSC (תאי CD11b (Lin-CD11b +) מיאלואידית נגזרת מדכא; לין-CD11b + GR1 +), וCD19 + B תאים (CD3-CD19 +).
"Src =" תרשים 4 "/> / קבצים / ftp_upload / 52,657 / 52657fig4.jpg
איור 4:. Altered יחסים של מפעיל לויקוציטים המדכאים בB16 גידולי יום 17 B16 גידולים מלנומה נותחו על ידי FACS כפי שתואר. תת ויקוציטים בודדים זוהו על ידי gating. היחס של NK או תאי T הכולל לMDSC או PDC בכל סוג גידול היה אז מחושב.
איור 5:. תאי מפעיל מוגבר בגידולי להביע chemerin B16 בקרה או גידולים להביע chemerin נותחו על ידי FACS. מספרים מוחלטים של T וNK תאים לכל 10,000 תאי גידול כולל חושבו באמצעות נתוני FACS. תוצאות מניסוי נציג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביצוע ניתוח מפורט של מייקרו-הסביבה של הגידול הוא קריטי בקביעת המנגנונים ואת ההשפעות של תפקוד מערכת חיסון. עם הנוכחות הגוברת של immunotherapeutics בתחום הקליני בבני האדם, הבנת ההשפעה של גורמים אלה על leukocytes גידול חדירה הופך הנדרשת בהגדרת מנגנון הפעולה שלהם. בבני אדם, יש לעתים קרובות קיימים קשיים קליניים ו / או לוגיסטיים בקבלת וניתוח רקמת גידול לניתוח משנה לויקוציטים, ובכך ניתוח של התגובה החיסונית ההיקפית מבוצע לעתים קרובות. ביצוע ניסויים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים מאפשר לחוקר לחקור באופן מלא יותר את ההשפעה של סוכני המערכת החיסונית על המערכת החיסונית בגידול עצמו, ובכך נותן תובנה נוספת לתוך מנגנונים שעשויים להשפיע על תוצאות קליניות.
הטכניקה שלנו מאפשרת ניתוח מפורט של לויקוציטים הסתננות-גידול. מכיוון יכולה כל מייקרו-הסביבה של הגידוללהיות שנדגמו, מבט גלובלי יותר של הנוכחות החיסונית בתוך הגידול ניתן להעריך. וסופו של דבר, את האיזון של תאים המדכאים פרו-סרטניים ותאי מפעיל אנטי גידול יכול להיות השפעה משמעותית על צמיחת גידול ותוצאות קליניות 4. לפיכך, ניתוח מסוג זה הוא בעל ערך במתן החוקר עם מידע מפורט על תת ויקוציטים הספציפיים הנוכחיים. נתונים מפורטים זה עשויים לשמש בשילוב עם נתונים תפקודיים אחרים על מנת להבהיר עוד יותר מנגנוני חיסון בתוך הגידול.
הפשטות היחסית של הפרוטוקול מאפשרת להעריך קבוצות גדולות יותר של גידולים במטרה למזער את השונות בתוך קבוצות. בהשוואה לגישה יותר טיפוסית ונפוצה של הדמיה (בין אם על ידי IHC או immunofluorescence), הטכניקה שלנו מאפשרת זיהוי של תת ויקוציטים מאוד ספציפיים על ידי שימוש בצבע רב cytometry זרימה. היכולת לטעום גם את הגידול כולו (כולל פריפריה) או סעיף שלהגידול נותן גמישות נוספת חוקר במונחים של דגימה וניתוח. זה גם מאפשר לאוסף של יותר באופן משמעותי נתונים לגבי כדוריות דם לבנות ממה שאפשר להשיג על ידי ניתוח של סעיפי רקמות מרובים על-ידי הדמיה, ובכך נותנים תמונה מדויקת יותר של מייקרו-הסביבה של הגידול.
אנו מנוצלים בטכניקה זו על גידולים תת-עורי, הנמצא בשימוש נרחב במודלים של עכברים נתון הקלות היחסית של חיסון גידול ומדידות. כך, פרוטוקול זה יהיה ישים עבור סביר רוב דגמי גידול בשימוש. עם זאת, הטכניקה יכולה להיות מיושמת גם לגידולים שעברו כריתה מדגמי גידול orthotopic או ספונטניים, אם כי בצעדים נוספים לכריתת גידול. ובעוד מלנומה B16 לא דורשים עיכול אנזים לקבל השעיה תא בודדת, ייתכן שיש סוגים אחרים של גידול שבו צעד זה נדרש לקבל אחיד, השעיה תא בודדת נציג. יש גם יתרונות הדמיה של secti גידולתוספות מאפשרת שלא ניתן להעריך בטכניקה שלנו. לדוגמא, ניתן לקבל נתונים ספציפיים יותר על לוקליזציה לויקוציטים במייקרו-הסביבה של הגידול באמצעות IHC / IF, וזה עשוי לעתים קרובות להיות תוספת רבת ערך לנתונים שסופקו על ידי ניתוח FACS.
לסיכום, הטכניקה שלנו להערכה של תת ויקוציטים במייקרו-הסביבה של הגידול מאפשרת לחוקר לבצע ניתוחים מפורטים של הנוכחות החיסונית בתוך גידול באמצעות פרוטוקול פשוט יחסית. זה יכול להיות מיושם על רוב דגמי גידול עכבר ויכול לעזור בהבנת מידע רב ערך על סוג ויקוציטים, מספר, ויחסים הנוכחיים בתוך הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01-CA169354 וR01-047822 מהמכון הלאומי לבריאות ופרס הצטיינות מהמחלקה לענייני יוצאי צבא (ECB). RKP נתמכה על ידי NIH T32 CA009287-30A1, פרס חוקר צעיר ASCO, שד קליפורניה לחקר סרטן פרויקט מלגה, ואגודה אמריקנית לסרטן המודרך מחקר Scholar גרנט; BAZ נתמכה על ידי AI079320 מענק NIH. JM נתמכה על ידי מלגות ממענק אימון T-32 NIH 25 T32-AI07290-, T32-AI07290-24 ואגודה האמריקנית לסרטן מלגת פוסט-דוקטורט PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
