פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכה מפורטת של תת-קבוצות לויקוציטים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול במודל גידול עכבר. תאי מלנומה B16 המבטאים כימרין הושתלו תת עורית בעכברים סינגניים. לאחר מכן נצבעו תאים ממיקרו-סביבת הגידול ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה, מה שמאפשר ניתוחים מפורטים של תת-קבוצות לויקוציטים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים חיסוניים מיוחדים הלחדור מייקרו-הסביבה של הגידול להסדיר את הצמיחה והישרדות של neoplasia. תאים ממאירים חייבים להתחמק או לחתור תחת תגובות חיסוני אנטי-סרטנית על מנת לשרוד ולשגשג. גידולים לנצל מספר המנגנונים השונים של חיסון "בריחה", ובכלל זה הגיוס של DC tolerogenic, תאי T רגולטורים לדיכוי המערכת החיסונית (Tregs), ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSC) המעכבים תגובות אנטי-סרטניים רעילות לתאים. לעומת זאת, תאים חיסוניים מפעיל אנטי-סרטני יכולים להאט את הצמיחה והתרחבות של גידולים ממאירים: תאים דנדריטים immunostimulatory, תאי רוצח טבעיים שנמל חסינות אנטי גידול מולדת, ותאי T ציטוטוקסי כל יכולים להשתתף בדיכוי גידולים. האיזון בין כדוריות דם לבנות בעד ונגד גידול סופו של דבר קובע את התנהגותו וגורלו של תאים הפכו; מספר רב של מחקרים קליניים בבני אדם נשא את זה. לפיכך, ניתוח מפורט של תת ויקוציטים במייקרו-הסביבה של הגידול הפכה להיות חשובה יותר ויותר. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח תת ויקוציטים להסתנן לתוכם נוכחי במייקרו-הסביבה של הגידול במודל גידול עכבר. תאי גידול מלנומה B16 העכבר היו מחוסן תת עורי בעכברי C57BL / 6. בזמן מסוים, גידולים ועור שמסביב היו כריתה כמקשה אחת ומעובדים להשעיות תא בודדות, אשר לאחר מכן היו מוכתמת עבור צבע רב cytometry זרימה. תוך שימוש במגוון של סמני משנה לויקוציטים, היינו יכול להשוות את האחוזים היחסי של חדירה תת ויקוציטים בין שליטה וגידולים להביע chemerin. חוקרים ישתמשו בכלי כזה כדי ללמוד את נוכחות החיסון במייקרו-הסביבה של הגידול ובשילוב עם מדידות גודל קליפר מסורתיות של צמיחת גידול, יהיה פוטנציאל לאפשר להם לברר את ההשפעה של שינויים בהרכב חיסון על צמיחת גידול. כגון טכניקה יכולה להיות מיושמת על כל מודל גידול שבו הגידול וג מייקרו-הסביבה שלהלהיות כריתה ועיבוד.
מבוא
האיזון בין צמיחת גידול וקידום ונסיגה הוא, בחלקו, תלוי באיזון של לויקוציטים הנוכחי במייקרו-הסביבה 1,2 פרו ואנטי-סרטני שחדר. כדי ללמוד מייקרו-הסביבה של הגידול (TME) ובמיוחד לזהות את תת-אוכלוסיות לויקוציטים להסתנן לתוכם, פיתחנו שיטה להערכה של גידולים תת עורית במודל עכברי גידול. החשיבות של לימוד מייקרו-הסביבה של הגידול ידועה ונתמך בספרות. מחקרים רבים הראו כי המאזן של תאי מערכת חיסון פרו ואנטי-סרטניים שחדר יכול להשפיע על התוצאות של גידול, לא רק בעכבר, אלא גם מחקרים בבני אדם (שנסקרו ב3,4). לדוגמא, קוריאל et al. הראה שהחמיר תוצאות קליניות בחולי סרטן השחלות היו מתואמות עם הנוכחות של הגדלת האחוזים של תאים שח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הניסויים בבעלי החיים נערכו בהתאם לסטנפורד אושר, Palo Alto VA HCS, ומכונים לאומי לבריאות הנחיות המוסדית AnimalCare ועדת השימוש.
1. הכנה לאוסף דוגמאות ועיבוד (זמן הנדרש: ~ דקות 10-15)
- לחסן תאים מלנומה B16F0 עכבריים (0.5-1 x 10 6) תת עורי ליד או קו האמצע של הבטן בC57BL / 6 נקבות עכברים כפי שתואר לעיל 6. לחלופין, לחסן תאים סרטניים באתרים אנטומיים נוספים (למשל אגף, כרית שומן החלב, וכו ').
הערה: כל מספר של גידולים (מושתל או ספונ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות שלנו הראו שאילצו את יתר הביטוי של chemerin בגידולי B16 העכבריים augmented אחוז של לויקוציטים גידול הסתננות (המח"טים). בנוסף, שינויים במשקל היחסי של תת ויקוציטים ייצוג בתוך מייקרו-הסביבה של גידול הקשורים לביטוי chemerin זוהו. להדפיס מחדש באישור et al Pachynski. 6.
איור 1 מראה כי חלה עלייה משמעותית בCD45 + תאים כולל (המח"טים) בתוך בגידולים אשר בטאה chemerin השווא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ביצוע ניתוח מפורט של מייקרו-הסביבה של הגידול הוא קריטי בקביעת המנגנונים ואת ההשפעות של תפקוד מערכת חיסון. עם הנוכחות הגוברת של immunotherapeutics בתחום הקליני בבני האדם, הבנת ההשפעה של גורמים אלה על leukocytes גידול חדירה הופך הנדרשת בהגדרת מנגנון הפעולה שלהם. בבני אדם, יש לעתים קרובות קיימים קשיים קליניים ו / או לוגיסטיים בקבלת וניתוח רקמת גידול לניתוח משנה לויקוציטים, ובכך ניתוח של התגובה החיסונית ההיקפית מבוצע לעתים קרובות. ביצוע ניסויים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים מאפשר ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01-CA169354 וR01-047822 מהמכון הלאומי לבריאות ופרס הצטיינות מהמחלקה לענייני יוצאי צבא (ECB). RKP נתמכה על ידי NIH T32 CA009287-30A1, פרס חוקר צעיר ASCO, שד קליפורניה לחקר סרטן פרויקט מלגה, ואגודה אמריקנית לסרטן המודרך מחקר Scholar גרנט; BAZ נתמכה על ידי AI079320 מענק NIH. JM נתמכה על ידי מלגות ממענק אימון T-32 NIH 25 T32-AI07290-, T....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; שמור על קרח |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| צינורות חרוטיים 50 מ"ל | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μ m filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 מ"ל מזרק | BD | 14-823-35 | |
| fischersci.com מספריים/מלקחיים כירורגיים | Roboz | RS-5910 | |
| roboz.com PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; שמור על קרח |
| כחול | Cellgro | MT-25-900-CI | |
| fischersci.com המציטומטר | האוסר סיינטיפיק | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead | stain Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| תוכנת FlowJo | TreeStar, Inc | flowjo.com |
מקורות
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunos....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
