Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Evaluering af tumorinfiltrerende leukocytundergrupper i en subkutan Tumor Model

doi: 10.3791/52657 Published: April 13, 2015

Abstract

Specialized immunceller, der infiltrerer tumormikromiljøet regulere væksten og overlevelsen af ​​neoplasi. Maligne celler skal undvige eller undergrave anti-tumor immunrespons for at overleve og trives. Tumorer drage fordel af en række forskellige mekanismer immun "escape" herunder rekruttering af tolerogenisk DC, immunosuppressive regulatoriske T-celler (tregs) og myeloide afledte suppressorceller (MDSC), som inhiberer cytotoksiske anti-tumor respons. Omvendt kan anti-tumor effektor immunceller langsom vækst og ekspansion af maligniteter: immunstimulerende dendritiske celler, naturlige dræberceller, som huser medfødte anti-tumor immunitet, og cytotoksiske T-celler alle kan deltage i tumor suppression. Balancen mellem pro- og anti-tumor leukocytter i sidste ende afgør opførsel og skæbne for transformerede celler; et væld af humane kliniske undersøgelser har båret dette ud. Således detaljeret analyse af leukocytundergrupper indentumormikromiljøet er blevet stadig vigtigere. Her beskriver vi en fremgangsmåde til analyse af infiltrerende leukocytundergrupper stede i tumormikromiljøet i en mus tumormodel. Mouse B16 melanoma-tumorceller blev inokuleret subkutant i C57BL / 6-mus. På et bestemt tidspunkt, blev tumorer og omgivende hud reseceret en bloc og forarbejdet til enkeltcelle-suspensioner, som derefter blev farvet for flerfarvede flowcytometri. Ved hjælp af en bred vifte af leukocyt delmængde markører, var vi i stand til at sammenligne de relative procentdele af infiltrerende leukocytundergrupper mellem kontrol og chemerin-udtrykkende tumorer. Efterforskere kan bruge sådan et værktøj til at studere immun tilstedeværelse i tumormikromiljøet og når det kombineres med traditionelle skydelære størrelse målinger af tumorvækst, potentielt vil give dem mulighed for at belyse effekten af ​​ændringer i immun sammensætning på tumorvækst. En sådan teknik kan anvendes på en hvilken som helst tumor model, hvor tumoren og dens mikromiljø Cen skal resekteres og behandles.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Balancen mellem tumorvækst og fremme og regression er delvist afhængig af balancen mellem pro- og anti-tumor infiltrerende leukocytter til stede i mikromiljø 1,2. For at undersøge tumormikromiljøet (TME) og specifikt at identificere de infiltrerende leukocytunderpopulationer, har vi udviklet en metode til vurdering af subkutane tumorer i en murin tumormodel. Vigtigheden af ​​at studere tumormikromiljøet er velkendt og støttet i litteraturen. Talrige undersøgelser har vist, at balancen i pro- og anti-tumor infiltrerende immunceller kan påvirke resultaterne af tumorvækst, ikke kun i mus, men også humane undersøgelser (oversigt i 3,4). For eksempel Curiel et al., Viste, at forværret kliniske resultater i ovariecancerpatienter blev korreleret med tilstedeværelse af stigende procentdele af tumor-infiltrerende regulatoriske CD4 + T-celler (tregs) 5. Vores eget arbejde viste også virkningen af ​​et ikkeVel leukocyt kemoattraktant på forholdet mellem leukocytundergrupper i en mus melanom model 6, som også korreleret med nedsat tumorvækst. Således de detaljerede analyser af leukocytundergrupper inden for en tumor er nu mere bredt anerkendt og stadig vigtigere.

Der er mange måder at evaluere tumormikromiljøet for infiltrerende leukocytter; for eksempel grupper har udviklet transgene mus til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner med henblik på at afbilde TME 7 klassisk immunhistokemi og immunofluorescens af konserverede afsnit 8, herunder forskellige afbildningsmodaliteter såsom MRI, PET, konfokal mikroskopi 9-11 - nogle med evnen til at overvåge intravitally 10,12. Disse kan anvendes med forskellige molekylære imagografimidler, såsom nanopartikler 13 eller hidtil ukendte kontrastmidler 14 mærket immunceller. Vores metode er en flowcytometri tilgang og har flere fordele.For det første kan tages prøver hele tumormikromiljøet; på tidspunktet for analysen, er hele subkutan tumor og omkringliggende periferien kirurgisk reseceret til forarbejdning. Dette eliminerer enhver potentielt prøveudtagning forspænding inden for en enkelt tumor, og giver en mere "global" analyse af tumoren som helhed. For det andet, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri at analysere leukocytundergrupper giver os mulighed for mere specifikt at måle fænotypen af ​​infiltrerende leukocytter. Afhængig af antallet af anvendte farver, kan identificeres meget specifikke delmængder. Dette er vigtigt, da der er flere leukocytundergrupper inden for en bestemt celletype - eller endda i en generel subtype klassificering - som har forskellige funktioner, som er potentielt betydning for, skæbne tumoren. For eksempel har plasmacytoide dendritiske celler (PDC) været impliceret i anti-tumor immunitet 15. CCR9 + delmængde af pdCs har imidlertid vist sig at være tolerogen 16 og flytte balanse af sådan en delmængde kan have en indvirkning på tumorvækst.

Vores metode er egnet til subkutan eller andre tumorer, der kan resektion en bloc. I vores hænder blev tumorer ensartet resekteret på tidspunktet for eutanasi. Det er imidlertid tænkeligt, som er blevet gjort i nogle undersøgelser, at en subkutan tumor kunne resektion med lukning af den omgivende hud i en overlevelse kirurgi 17, således at yderligere vurdering af dyret. Analysen udføres derefter på den resekterede tumor. Således repræsenterer resultaterne en enkelt tidspunkterne i tumoren udvikling. Mens dette giver et detaljeret indblik i mikromiljøet, er det også et statisk billede af, hvad der er ingen tvivl om en dynamisk proces. Imidlertid isolerede leukocytter (fx via magnetisk separation eller densitetsgradient) kan derefter analyseres separat fra tumoren epitel og stroma eller anvendes i andre, funktionelle assays til yderligere at definere deres fænotype, som det har været tidli-gere beskrevet 18. Denne metode ville så være nyttig for alle forskere interesseret i at forstå sammensætningen af ​​leukocytterne i tumormikromiljøet på et givet tidspunkt, enten i indstillingen af ​​det naturlige sygdomsforløb, eller efter en bestemt terapeutisk perturbation. Selvom det ikke er gjort af os, variationer af denne procedure kan også potentielt anvendes til at analysere specifikke dele af en tumor i isolation. For eksempel, givet størrelsen af ​​tumoren, den perifere zone (r) kan dissekeres væk fra den centrale, eventuelt nekrotisk kerne af tumoren for at give forskeren en mere rumligt adskilt visning af tumormikromiljøet.

I den spirende området tumor immunologi, vil der uden tvivl være en eksponentielt stigende antal studier, der evaluerer nye immunmodulerende midler i murine tumormodeller. Adskillige rapporter har understreget forskellene i specifik leukocyt funktion i tumoren versus den perifere enjø. For eksempel Shafer-Weaver et al. Viste i en musemodel som antigen-specifik T-effektorceller CD8 + celler, medens aktiv i periferien, blev transformeret ind i CD8 + T-suppressor-celler, når de solgt til tumormikromiljøet 19. Dette var til dels på grund TGFp, men andre faktorer er sandsynligvis involveret. Således evaluering leukocytundergrupper - tal og forhold, samt funktionelle status - vil i tumoren selv give en mere nøjagtig gengivelse af effekten af ​​en særlig immunmodulation på tumor skæbne.

Vores teknik gør det muligt detaljeret analyse af tumor og giver forskeren mulighed for at tættere finde ændringer i leukocytpopulationer end tidligere metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med godkendte Stanford, Palo Alto VA HCS, og National Institutes of Health Institutionelle AnimalCare og brug udvalgets retningslinjer.

1. Forberedelse til prøvetagning og Processing (Tidsforbrug: ~ 10-15 min)

  1. Podes murine B16F0 melanomceller (0,5-1 x 10 6) subkutant på eller nær midterlinien af maven i C57BL / 6-mus som beskrevet tidligere 6. Alternativt pode tumorceller på ekstra anatomiske steder (f.eks flanke yverfedt pad, osv).
    BEMÆRK: Antallet af tumorer (implanteret eller spontan) kan anvendes og evalueres ved hjælp af denne protokol. For eksempel kan andre almindeligt anvendte syngene tumorer i C57BL / 6 omfatter colon line MC38, Lewis lungecarcinom (LLC) og prostata TRAMP-C2 linje. Mens humane xenotransplantater inokuleret i immundefekte mus også kan undersøges på denne måde, skal det bemærkes, at profiles af tumor-infiltrerende leukocytter vil nødvendigvis blive ændret i overensstemmelse med immundeficient tilstand af værten musen.
    1. Brug komplette medier (f.eks RPMI indeholdende 10% FBS og additiver) eller en anden passende protein-holdige puffer (f.eks HBSS eller PBS + 1% FBS eller 1% BCS). Chill medier eller buffer til 4 ° C før aflivning.
  2. Opsætning indsamling rør og filtre til resektion tumorer; placere disse på is.
    1. Brug en 50 ml konisk rør per tumor skal resekteret. Indsæt en 40-70 um cellesuspension filter i hver enkelt. Alternativt kan du bruge 15 ml koniske rør med metal filter mesh. Brug en 5 ml sprøjte stempel eller tyk pen til at skabe en kop-formet filter på toppen af ​​15 ml rør.
  3. Forbered instrumenter til resektion og tumor behandling; bruge kirurgiske tænger og fine sakse til resecere og behandle tumorer. Brug 70% ethanol til rengøring instrumenter mellem resektion / tumor prøver. For større antal of prøver (f.eks> 10), anbefaler vi samtidig behandling af prøver ved flere forskere til at undgå væsentlige forskelle i behandlingstid mellem tumor prøver.

2. tumorresektion (Tidsforbrug: ~ 5 min / tumor)

  1. Aflive B16 tumorbærende mus individuelt ved hjælp af kuldioxid eller en anden godkendt metode.
  2. Fastgør musen på en kirurgisk scene. Spray tumor med 70% ethanol og tørres overskydende off; dette hjælper med at forhindre spredning af enhver hår til stede. For ikke-nøgne mus, barbere hudområdet omkring tumoren før resektion efter behov.
  3. Brug pincet og saks, resecere den subkutane tumor en bloc, herunder overliggende og omgivende hud. Mængden af ​​"margin" skin taget kan varieres, men typisk resecere 2-3 mm af huden omkring svulsten.
    1. Operativt fjernede tumorer (+/- omgivende hud) på dette tidspunkt afvejes. Placer resekterede hud / tumor sektion i filteret fastgjort inden i plASTIC konisk rør.

3. Forberedelse af en enkelt celle Tumor Suspension (Tidsforbrug: ~ 5-7 min / tumor)

  1. Brug pincet og saks til at hakke tumor og overliggende / omgivende hud. Hakke prøven med en saks, indtil alle store dele af væv forarbejdes til 1-2 mm sektioner.
    BEMÆRK: Typisk hele tumorer behandles; Alternativt, for større tumorer repræsentative dele af tumorer kunne hakket og behandlet.
  2. Ved hjælp af et stempel fra en engangs 5 ​​eller 10 ml sprøjte, mekanisk disaggregere det hakkede tumorvæv mod sikrede filter.
  3. Ved hjælp af en pipette, vaske forarbejdede tumorvæv med 5-10 ml kold medier eller buffer. Dette vil skylle de enkelte celler gennem filteret.
  4. Gentag to ovennævnte trin flere gange, sikrer, at det samlede antal og mængder af skyllevand er omtrent den samme for samme størrelse tumorer.
    1. Efter vask forarbejdet tumorvæv, observeresmå fragmenter af huden og / eller andet bindevæv skal tilbage i filteret.
    2. Alternativt kan for tumorer, hvor mekanisk opdeling alene måske ikke er tilstrækkelig, fordøjelse med collagenase og / eller andre enzymer udføres før hakningen procedure. Dette vil give mulighed for en mere grundig enkelt cellesuspension. Dog skal det bemærkes, at sådanne fordøjelse protokoller kan påvirke overflade antigenekspression 20, så der skal udvises forsigtighed ved fortolkningen af disse resultater.
  5. Vask og pelletere cellerne ved tilsætning media / puffer og centrifugering ved 4 ° C 500 x g i 5 min.

4. FACS Farvning af Single Cell Suspension (Tidsforbrug: ~ 30-60 min)

  1. Resuspender cellerne i iskold FACS buffer (PBS + 1% FBS).
  2. Tæl levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt og et hæmacytometer eller automatiseret celletæller.
  3. Bestem samlede rentable celleudbytte per volumen. Disse data kan anvendes til at ekstrapolereabsolutte antal tumorinfiltrerende leukocytter i kombination med FACS data.
  4. Bestem antallet af celler, der skal farves og analyseret ved FACS. Dette vil blive påvirket af flere faktorer (f.eks tumor histologi typen, tumor alder og størrelse, Gennemsnit antal infiltrerende leukocytter, etc.).
    BEMÆRK: I B16 melanom, fandt vi en lav procentdel af tumorinfiltrerende leukocytter (TIL; typisk <5%) i forhold til tumorceller. Således blev mindst 1 x 10 6 total tumor (tumor + infiltrerende leukocytter) celler typisk indsamlet via FACS til analyse.
    1. Brug Trypan bejdset tælle data, beregnede mængde celler farvet for FACS. For eksempel, hvis TIL udgør typisk 5% af den samlede tumorceller (mange af tumorcellerne vil være døde på trypan plet), at faktor dette i det samlede antal af tumor enkelt cellesuspension farves.
    2. For mindre almindelige leukocytundergrupper f.eks CCR9 + PDC) anvender et større antal totale tumorceller (f.eks 2-3 x 10 6) til FACS-farvning, i betragtning af den relativt lave hyppighed af disse celler i enkelt cellesuspension.
  5. Farv tumoren enkelt cellesuspension for FACS.
    1. For levende / dead diskrimination bruge en fixable plet eller ikke-fixable farvning (f.eks propidiumiodid) kan anvendes. Hvis celle farves uden levende / døde diskrimination, skal rådes givet forsigtighed potentialet for ikke-specifik binding af antistoffer.
    2. Farv cellesuspensionen specifikke leukocytundergrupper hjælp af en standard FACS farvningsprotokol. Bloker celler for at reducere ikke-specifik antistofbinding med PBS / FBS indeholdende 1% rotteserum og Fc blok (anti-CD16 / 32) i 10 minutter forud for farvning med antigenspecifikke antistoffer. Medtag de korrekte isotypekontrol antistoffer for at sikre farvningen er specifik.
    3. På dette tidspunkt, efter FACS-farvning er færdig, fix prøver med 4% formaldehyd eller lignende fiksativ agent. Opbevar prøver ved 4 ° C i dark (for at undgå quenching af fluoroforer), indtil tidspunktet for indsamling og analyse.
      BEMÆRK: Lagring faste prøver i lange perioder, kan føre til ændring i signalet og intensitet fluoroforerne 21.
    4. Saml prøverne på et flowcytometer. Optimal flowcytometer indstillinger varierer afhængigt af instrumenttype og laser / detektor setup.
      BEMÆRK: Derudover kan der være variation mellem forsøg, selv om anvendelse af den samme maskine. Således gennemfører en passende maskine setup (fx anvendelse kalibrering perler) for at sikre passende indstilling før FACS indsamling og analyse af hvert forsøg kompensation.
  6. Analyse af leukoctye delmængder
    1. Anvendelse af FACS dataanalyse software til at analysere dataene. For en levende / død plet, starte med gating ud døde celler. Brug antistof mod et leukocyt specifik markør (f.eks anti-CD45) for at identificere leukocytter i de levende celler.
      1. Efter dette, bruge forskellige Gating ordninger at identificere specifikke undergrupper afhængigt af farvningsprotokol. For eksempel for at identificere CD4 + T-celler, vælge SSC lo region fra CD45 + populationen og vælg CD19-CD3 + celler; fra dette CD4 + T-celler kan identificeres 22.
    2. Analysere data og præsentere det på en række forskellige måder at sikre sammenhæng og identificere mønstre eller tendenser (dvs. anvender de samlede tal, procenter eller forhold at kvantificere delmængder).
      BEMÆRK: For eksempel har vi set på samlede levende CD45 + celler som en procentdel af de samlede tumorceller indsamlede (Figur 1). Desuden har vi derefter beregnes den procentdel af hver leukocyt delmængde (fx CD4 + T-celler) i tumoren og sammenlignet disse som forholdet mellem kontrol og forsøgsgrupper (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vores resultater viste, at tvungen overekspression af chemerin i murine B16 tumorer augmented procentdelen af ​​tumorinfiltrerende leukocytter (TIL'er). Derudover blev identificeret ændringer i relative forhold mellem leukocytundergrupper repræsenteret i tumormikromiljøet forbundet med chemerin ekspression. Re-print med tilladelse fra Pachynski et al. 6.

Figur 1 viser, at der var en betydelig stigning i de samlede CD45 + celler (tils) inden i tumorer, der udtrykt chemerin sammenlignet med kontroller, som bestemt ved FACS-analyse af opereret dag 17 tumorer. Brug farvede, cryosectioned B16 tumorer, stigningen i infiltrerende CD45 + celler ved immunofluorescens af tumorer blev bekræftet (figur 2).

Yderligere analyse af FACS data viser en relativ stigning i gennemsnit af NK-celler, T-celler, og konventionel DC (Lin-B220- CD11c +) i kræftsvulster, hvor Chemerin var overudtrykt i forhold til kontrol- tumorer (Figur 3). Der var et relativt fald i den procentvise andel af leukocytundergrupper, der har en rolle i at undertrykke eller kan undertrykke immunrespons, specielt myeloid-afledte suppressorceller (Lin-CD11b + GR1 +) og PDC (Lin- B220 + CD11c int PDCA1 +) 16,23 .

Et stigende antal undersøgelser har vist, at forholdet mellem leukocytundergrupper i tumormikromiljøet at være en vigtig faktor, både i form af tumorvækst og kliniske resultater 4,24,25. Vores FACS data blev yderligere analyseret for at vise antallet af T-celler (total CD3 +) og NK-celler pr tumorcelle; disse celletyper i stigende grad blev repræsenteret i chemerin-udtrykkende tumorer sammenlignet med kontroller (figur 4).

En direkte sammenligning af effektor (dvs. NK- og T-celler) og suppressor celle (dvs. MDSC og PDC) populationer i tumoren microenviron ment for begge tumor grupper blev derefter udført. Figur 5 viser betydelige stigninger i forholdene mellem effektor suppressor cellepopulationer inden for chemerin-udtrykkende tumorer sammenlignet med kontrolgruppen.

Samlet set de repræsentative resultater viser effekterne af chemerin udtryk i tumormikromiljøet på leukocyt undergruppe befolkninger, og den gunstige skævvridning af disse populationer og nøgletal i overensstemmelse med den kliniske fordel set.

Figur 1
. Figur 1: Øget tumorinfiltrerende leukocytter i chemerin-udtrykkende tumorer tumorer udskåret fra chemerin-udtrykkende vs kontrol på dag 17 blev analyseret for CD45 + leukocytinfiltration (% af levedygtige celler) ved flowcytometri; * P <0,05 ved to-tailed T-test viser middel ± SEM af med 4 eller flere mus pr gruppe.

2 "src =" / files / ftp_upload / 52657 / 52657fig2.jpg "/>
. Figur 2: Billedbehandling af B16 melanom TIL Immunfluorescens billeder illustrerer CD45 + celle infiltrater (hvide pile) i kontrol og chemerin-udtrykkende melanomer udskåret på dag 9; søjle repræsenterer 25 um.

Figur 3
. Figur 3: Ændret repræsentation af leukocytundergrupper i chemerin-udtrykkende tumorer FACS analyserer data blev konverteret via log 2 forhold mellem TIL delmængde frekvens i chemerin- udtrykker vs kontrol tumorer for PDC (plasmacytoide DC; Lin- CD11c int B220 + PDCA1 +), CDC (konventionelle DC; Lin-CD11c hi B220-), CD4 (CD3 + CD4 +) T-celler, CD8 (CD3 + CD8 +) T-celler, samlede T-celler (CD3 + CD4 + og CD3 + CD8 +), NK-celler (CD3-NK1. 1+), CD11b (Lin-CD11 +) monocyt / makrofager, MDSC (myeloide afledt suppressorceller; Lin-CD11 + GR1 +), og CD19 + B-celler (CD3-CD19 +).

gur 4 "src =" / files / ftp_upload / 52657 / 52657fig4.jpg "/>
Figur 4:. Altered forhold af effektor suppressor leukocytter i B16 tumorer dag 17 B16 melanomtumorer blev analyseret ved FACS som beskrevet. Individuelle leukocytundergrupper blev identificeret ved gating. Forholdet mellem NK eller totale T-celler til MDSC eller PDC hver tumortype blev derefter beregnet.

Figur 5
Figur 5:. Øget effektorceller i chemerin-udtrykkende B16 tumorer Kontrol eller chemerin-udtrykkende tumorer blev analyseret ved FACS. Absolutte tal for T- og NK-celler pr 10.000 totale tumorceller blev beregnet ved hjælp af FACS data. Resultaterne er fra et repræsentativt eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Udførelse detaljeret analyse af tumormikromiljøet, er afgørende for de mekanismer og effekter af immunmodulering. Med den stigende forekomst af ImmunoTherapeutics i den humane kliniske rige, forstå virkningen af ​​disse midler på tumorinfiltrerende leukocytter bliver nødvendige i at definere deres virkningsmekanisme. Hos mennesker ofte findes der kliniske og / eller logistiske problemer med at opnå og analysere tumorvæv for leukocyt delmængde analyse, og dermed analyse af svaret perifere immun udføres ofte. Udførelse prækliniske studier i dyremodeller tillader forskeren til mere fuldt ud at udforske virkningerne af immunmodulerende midler på immunsystemet i selve tumoren, hvilket giver yderligere indsigt i mekanismer, der kan påvirke de kliniske resultater.

Vores teknik gør det muligt detaljeret analyse af tumor-infiltrerende leukocytter. Fordi hele tumormikromiljøet kander udtages prøver, kan et mere globalt syn på immunsystemet tilstedeværelse i tumor skal vurderes. Og i sidste ende, kan balancen i pro-tumor suppressor celler og anti-tumor effektorceller have en betydelig indvirkning på tumorvækst og kliniske resultater 4. Således er denne type analyse er værdifuldt i at give forskeren med detaljerede oplysninger om de specifikke leukocytundergrupper stede. Denne detaljerede data kan anvendes i kombination med andre funktionelle data til yderligere at belyse immunmekanismer i tumoren.

Den relative enkelhed af protokollen tillader en at vurdere større kohorter af tumorer for at minimere variabilitet inden for grupper. Sammenlignet med den mere typiske og udbredt fremgangsmåde imaging (enten ved IHC eller immunfluorescens), vores teknik muliggør identifikationen af ​​meget specifikke leukocytundergrupper ved anvendelse flerfarvede flowcytometri. Evnen til at prøve enten hele tumoren (herunder omkreds) eller en sektion aftumoren giver forskeren yderligere fleksibilitet med hensyn til prøvetagning og analyse. Dette giver også udarbejdelse af betydeligt flere data om leukocytter end der kan opnås ved analyse af flere vævssnit ved billedbehandling, hvilket giver et mere præcist billede af tumormikromiljøet.

Vi udnyttede denne teknik på subkutane tumorer, der er almindeligt anvendt i musemodeller givet den relativt lette tumorinokulation og målinger. Således ville denne protokol være gældende for sandsynligt et flertal af tumormodeller anvendes. Imidlertid kunne teknik også anvendes til tumorer resektion fra ortotopisk eller spontane tumormodeller, dog med yderligere skridt til tumorresektion. Og mens B16 melanom ikke krævede enzym fordøjelse at opnå en enkelt celle suspension, kan der være andre tumortyper, hvor der kræves dette trin for at opnå en ensartet, repræsentativ enkelt celle suspension. Der er også fordele, som billeddannelse af tumor sections giver, der ikke kan vurderes med vores teknik. For eksempel kan mere konkrete oplysninger om leukocyt lokalisering i tumormikromiljøet fås gennem IHC / IF, og det kan ofte være et værdifuldt supplement til de data, som FACS-analyse.

Afslutningsvis vores teknik til evaluering af leukocytundergrupper i tumormikromiljøet tillader forskeren at udføre detaljerede analyser af immunsystemet tilstedeværelse i en tumor ved hjælp af en forholdsvis enkel protokol. Det kan anvendes til et flertal af musetumormodeller og kan hjælpe belyse værdifulde oplysninger om leukocyt type, nummer og nøgletal stede i tumoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud R01-CA169354   og R01-047822   fra National Institutes of Health og en Merit Award fra Institut for Veterans Affairs (ECB). RKP blev støttet af NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, Californien Breast Cancer Research Project Fellowship, og en American Cancer Society mentored Research Scholar Grant; BAZ blev støttet af NIH tilskud AI079320. JM blev støttet af stipendier fra NIH T-32 uddannelse tilskud T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 og American Cancer Society ph.d.-stipendium PF-12-052-01-CSM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Cellgro 10-040 http://cellgro.com; keep on ice
FBS Cellgro 35-011-CV http://cellgro.com
50 ml conical tubes Falcon 14-432-22 fischersci.com
40 μm filter Falcon 08-771-1 fischersci.com
5 ml syringe BD 14-823-35 fischersci.com
surgical scissors/forceps Roboz RS-5910 roboz.com
PBS Cellgro MT-21-030-CM http://cellgro.com; keep on ice
trypan blue Cellgro MT-25-900-CI fischersci.com
hemacytometer Hausser Scientifice  02-671-54  fischersci.com
Live/Dead stain Life Technologies L34957 lieftechnologies.com
FlowJo software TreeStar, Inc flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14, (3), 155-160 (2004).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6, (10), 715-727 (2006).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14, (10), 1014-1022 (2013).
  4. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12, (4), 298-306 (2012).
  5. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10, (9), 942-949 (2004).
  6. Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209, (8), 1427-1435 (2012).
  7. Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
  8. Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46, (6), 12-13 (2014).
  9. Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
  10. Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2, (11), e26677 (2013).
  11. Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, (3), 281-290 (2010).
  12. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8, (2), e57135 (2013).
  13. Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13, (3), 1-11 (2014).
  14. Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2, (2), e23034 (2013).
  15. Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118, (3), 1165-1175 (2008).
  16. Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9, (11), 1253-1260 (2008).
  17. McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21, (4), 363-369 (2004).
  18. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
  19. Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183, (8), 4848-4852 (2009).
  20. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  21. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71, (6), 379-385 (2007).
  22. Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
  23. Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59, (10), 1593-1600 (2010).
  24. Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (9), 4275-4280 (2010).
  25. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331, (6024), 1565-1570 (2011).
Evaluering af tumorinfiltrerende leukocytundergrupper i en subkutan Tumor Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).More

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter