Abstract
Gespecialiseerde immuuncellen die de tumor micro infiltreren reguleren de groei en overleving van neoplasie. Kwaadaardige cellen moet ontwijken of te ondermijnen anti-tumor immuunrespons om te overleven en te bloeien. Tumoren maken van een aantal verschillende mechanismen van het immuunsysteem "escape", waaronder de werving van tolerogene DC, immunosuppressieve regulerende T-cellen (Tregs) en myeloide suppressor cellen (MDSC) dat cytotoxische anti-tumor responsen te remmen. Immunostimulerende dendritische cellen, natuurlijke killer cellen die aangeboren anti-tumor immuniteit haven en cytotoxische T-cellen allemaal kunnen deelnemen aan tumorsuppressie: Omgekeerd kunnen anti-tumor effector immuuncellen de groei en uitbreiding van maligniteiten vertragen. De balans tussen pro- en anti-tumor leukocyten bepaalt uiteindelijk het gedrag en het lot van de getransformeerde cellen; een veelheid van menselijke klinische studies hebben aangetoond dit uit. Zo, gedetailleerde analyse van leukocyten subsets binnende tumor micro-omgeving is steeds belangrijker geworden. Hier beschrijven we een werkwijze voor het analyseren infiltrerende leukocyten subsets aanwezig in de tumor micro-omgeving in een muizen tumormodel. Muis B16 melanoma tumorcellen werden subcutaan geïnoculeerd in C57BL / 6 muizen. Op een bepaald tijdstip, werden tumoren en de omliggende huid weggesneden en bloc en in enkele cel suspensies, die vervolgens werden gekleurd voor multi-color flowcytometrie verwerkt. Hand van diverse leukocyten deelverzameling markers, konden we de relatieve percentages van infiltrerende leukocyten subsets tussen controle en chemerin expressie tumoren vergelijken. Onderzoekers kunnen dergelijke gebruiken om de immune aanwezigheid in de tumor micro-omgeving en in combinatie met traditionele schuifmaat maat metingen van tumorgroei, zal mogelijk kunnen zij het effect van veranderingen in immune samenstelling op tumorgroei helderen bestuderen. Een dergelijke techniek kan worden toegepast op elk tumormodel waarin de tumor en de micro Ceen worden gereseceerd en verwerkt.
Introduction
Het evenwicht tussen groei en bevordering tumor regressie is gedeeltelijk afhankelijk van de balans tussen pro- en anti-tumor-infiltrerende leukocyten aanwezig in de micro 1,2. Om de tumor micro studie (TME) en specifiek de infiltrerende leukocyten subpopulaties, ontwikkelden we een methode voor de evaluatie van subcutane tumoren in een murine tumormodel. Het belang van het bestuderen van de tumor micro-omgeving is bekend en ondersteund in de literatuur. Talrijke studies hebben aangetoond dat de balans van pro- en anti-tumor infiltrerende immuuncellen kan invloed hebben op de resultaten van tumorgroei, niet alleen in muizen maar ook menselijke studies (besproken in 3,4). Bijvoorbeeld Curiel et al. Toonde aan dat verslechterd klinische resultaten bij eierstokkankerpatiënten werden gecorreleerd met de aanwezigheid van toenemende percentages van tumor-infiltrerende regulerende CD4 + T-cellen (Tregs) 5. Onze eigen werk toonde ook het effect van een nietvel leukocyt chemoattractant van de verhouding van leukocyt populaties in een muizen melanoma model 6, die ook gecorreleerd met verminderde tumorgroei. Zo wordt de gedetailleerde analyses van de leukocyten subsets binnen een tumor nu breder erkend en steeds belangrijker.
Er zijn vele manieren om de tumor micro-omgeving voor het infiltreren van leukocyten te evalueren; bijvoorbeeld groepen hebben transgene muizen ontworpen om verschillende fluorescerende eiwitten om het imago van de TME 7, klassieke immunohistochemie en immunofluorescentie van conserven secties 8, met inbegrip van verschillende beeldvormende modaliteiten zoals MRI, PET, confocale microscopie 9-11 uitdrukken - sommige met de mogelijkheid om monitoren intravitally 10,12. Deze kunnen worden gebruikt met verschillende moleculaire beeldvormende middelen, zoals nanodeeltjes 13 of nieuwe contrastmiddelen 14 dat immuuncellen label. Onze werkwijze is een flowcytometrie-aanpak en heeft verschillende voordelen.Ten eerste kan de gehele tumor micro-omgeving worden bemonsterd; bij de analyse, wordt de gehele subcutane tumor en omliggende rand chirurgisch weggesneden voor verwerking. Dit elimineert potentieel bemonsteren voorspanning in één tumor en geeft een "globale" analyse van de tumor als geheel. Ten tweede gebruikt multicolor flowcytometrie de leukocyt subgroepen te analyseren kunnen we meer specifiek meten het fenotype van infiltrerende leukocyten. Afhankelijk van het aantal gebruikte kleuren kunnen zeer specifieke subsets worden geïdentificeerd. Dit is belangrijk omdat er verschillende leukocyt subgroepen binnen een bepaald celtype - of zelfs een subtype algemene classificatie - dat uiteenlopende functies kunnen aanzienlijk het bepalen van het lot van de tumor. Zo hebben plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) betrokken bij anti-tumor immuniteit 15. Echter, de CCR9 + subset van pDCs is aangetoond dat tolerogene 16 en verschuiven van de balans van zo'n sub invloed kunnen zijn op tumorgroei.
Onze werkwijze is geschikt voor subcutane of andere tumoren die kunnen worden weggesneden en bloc. In onze handen werden tumoren gelijkmatig gereseceerd bij de euthanasie. Het is echter denkbaar, zoals is gedaan in een aantal studies, dat een subcutane tumor volledig kon worden uitgesneden met sluiting van de omringende huid in een overleving operatie 17, waardoor extra evaluatie van het dier. De analyse wordt dan uitgevoerd op het gereseceerde tumor. Dus de resultaten vormen een tijdstip in de ontwikkeling van de tumor. Hoewel dit kan een gedetailleerd blik in de micro-omgeving, maar ook een statisch beeld van wat ongetwijfeld een dynamisch proces. Echter, geïsoleerde leukocyten (bijvoorbeeld via magnetische afscheiding of dichtheidsgradiëntcentrifugatie) kan vervolgens afzonderlijk worden geanalyseerd vanuit de tumor epitheel en stroma, of gebruikt worden in andere, functionele assays om hun fenotype verder te definiëren, zoals Previ geweestDUREND beschreven 18. Deze methode zou dan nuttig voor onderzoekers geïnteresseerd in het begrijpen van de samenstelling van de leukocyten in de tumor micro-omgeving op een bepaald tijdstip, ongeacht of in de omgeving van het natuurlijke ziekteverloop of na een bepaalde therapeutische verstoring. Hoewel niet door ons, variaties van deze procedure kan ook eventueel worden gebruikt om specifieke delen van een tumor afzonderlijk analyseren. Gegeven bijvoorbeeld de grootte van de tumor, de randzone (s) worden van de centrale, mogelijk necrotische kern van de tumor ontleed de onderzoeker een ruimtelijk gescheiden gezien de tumor micro geven.
In de snel groeiende gebied van de tumor immunologie, zal er ongetwijfeld een exponentieel groeiend aantal studies evalueren van immunomodulerende verbindingen in muizen tumor modellen. Verschillende rapporten hebben de verschillen in specifieke leukocytfunctie gemarkeerd in de tumor ten opzichte van de perifere enving. Bijvoorbeeld Shafer-Weaver et al. Toonden in een muismodel dat antigeen-specifieke effector T CD8 + cellen, terwijl actief in de periferie, werden getransformeerd in CD8 + T-suppressor-cellen eenmaal verhandeld in de tumor micro-omgeving 19. Dit was gedeeltelijk te wijten aan TGFO, maar ook andere factoren zijn waarschijnlijk betrokken ook. Aldus evalueren leukocyt subgroepen - getallen en verhoudingen, alsmede functionele status - binnen de tumor zelf een nauwkeurigere voorstelling van het effect van een bepaalde immunomodulatie op tumor lot geven.
De techniek maakt gedetailleerde analyse van de tumor en geeft de onderzoeker de mogelijkheid om veranderingen in leukocyt populaties dan eerdere benaderingen beter identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde Stanford, Palo Alto VA HCS, en de National Institutes of Health Institutionele AnimalCare en gebruik Comite richtlijnen.
1. Voorbereiding voor bemonstering en Processing (Benodigde tijd: ~ 10-15 min)
- Inoculeer muizen B16F0-melanoomcellen (0,5-1 x 10 6) subcutaan of nabij de middellijn van het abdomen bij vrouwelijke C57BL / 6 muizen zoals eerder 6 beschreven. Als alternatief te enten tumorcellen tegen extra anatomische plaatsen (bijv flank, uiervet pad, etc).
OPMERKING: aantal tumoren (geïmplanteerd of spontane) worden gebruikt en geëvalueerd met behulp van dit protocol. Bijvoorbeeld, andere veelgebruikte syngene tumoren in C57BL / 6 worden de colon lijn MC38, Lewis Lung Carcinoma (LLC) en de prostaat TRAMP-C2 lijn. Terwijl menselijke xenotransplantaten geïnoculeerd in immunodeficiënte muizen ook op die wijze kan worden geëvalueerd moet worden opgemerkt dat de profiles van de tumor-infiltrerende leukocyten noodzakelijkerwijs volgens de immunodeficiënte toestand van de ontvangende muis worden gewijzigd.- Gebruik compleet medium (bijvoorbeeld RPMI met 10% FBS en additieven) of een andere geschikte eiwithoudende buffer (bijvoorbeeld HBSS of PBS + 1% FBS en 1% BCS). Chill media of buffer tot 4 ° C voordat euthanization.
- Set up collectie buizen en filters voor resected tumoren; plaats deze op ijs.
- Gebruik een 50 ml conische buis per tumor te worden gereseceerd. Plaats een 40-70 micrometer celsuspensie filter in elk. U kunt ook gebruik maken van 15 ml conische buizen met metalen filter gaas. Gebruik 5 ml zuiger of dik pen een komvormig filter maken bovenaan de 15 ml buis.
- Bereid instrumenten voor resectie en tumor verwerking; Gebruik chirurgische tang en fijne schaar om reseceren en proces tumoren. Gebruik 70% ethanol aan instrumenten tussen resections / tumor samples te reinigen. Voor grotere aantal of monsters (bv> 10), adviseren wij gelijktijdige verwerking van de monsters door meerdere onderzoekers tot aanzienlijke verschillen in doorlooptijd tussen tumor monsters te voorkomen.
2. tumorresectie (Benodigde tijd: ~ 5 min / tumor)
- Euthanaseren B16-muizen met een tumor individueel met behulp van kooldioxide of andere goedgekeurde methode.
- Zet de muis op een chirurgische podium. Spray de tumor met 70% ethanol en veeg overtollige af; Dit helpt voorkomen dat de verspreiding van enige haren aanwezig. Voor niet-naakt muizen, scheren de huid rondom de tumor voorafgaand aan de resectie als dat nodig is.
- Met behulp van een tang en schaar, reseceren de onderhuidse tumor en bloc, inclusief bovenliggende en de omliggende huid. De hoeveelheid van "marge" skin taken kan worden gevarieerd, maar gewoonlijk resectie 2-3 mm van de huid rondom de tumor.
- Weeg uitgesneden tumoren (+/- omliggende huid) op dit punt. Plaats de gereseceerd huid / tumor sectie in het filter verzekerd binnen het plastic conische buis.
3. Het voorbereiden van een Single Cell Tumor Suspension (Benodigde tijd: ~ 5-7 min / tumor)
- Gebruik een tang en schaar om de tumor en overliggende / omliggende huid blad voor de mond. Hak het monster met behulp van een schaar tot alle grote delen van het weefsel worden verwerkt tot 1-2 mm secties.
OPMERKING: Typisch, worden geheel tumoren verwerkt; Als alternatief voor de grotere tumoren, representatieve delen van tumoren kan worden gehakt en verwerkt. - Met behulp van een zuiger van een wegwerp 5 of 10 ml spuit, mechanisch disaggregeren het gehakt tumorweefsel tegen de beveiligde filter.
- Met behulp van een pipet, was de verwerkte tumorweefsel met 5-10 ml koud media of buffer. Dit zal de enkele cellen spoelen door het filter.
- Herhaal de bovenstaande twee stappen meerdere keren, zodat het totale aantal en hoeveelheden waswater ongeveer hetzelfde voor vergelijkbare grootte tumoren.
- Na het wassen van de verwerkte tumorweefsel, observerenkleine fragmenten van huid en / of ander bindweefsel dient achter in het filter worden gelaten.
- Als alternatief voor tumoren waarbij mechanische disaggregatie alleen niet voldoende zijn, digestie met collagenase en / of andere enzymen kunnen worden uitgevoerd voorafgaand aan het hakken procedure. Dit zal zorgen voor een meer diepgaande enkele celsuspensie. Er moet echter worden opgemerkt dat dergelijke spijsvertering protocollen kunnen beïnvloeden oppervlakte-antigeen-expressie 20, zodat voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van deze resultaten.
- Was pellet en de cellen door toevoeging media / buffer en centrifugeren bij 4 ° C 500 xg gedurende 5 minuten.
4. FACS kleuring van enkele celsuspensie (Benodigde tijd: ~ 30-60 min)
- Resuspendeer cellen in ijskoude FACS buffer (PBS + 1% FBS).
- Count levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw en een hemacytometer, of geautomatiseerde celgetalmeter.
- Bepaal de totale levensvatbare cel opbrengst per volume. Deze gegevens kunnen gebruikt worden geëxtrapoleerdabsolute aantallen tumor infiltrerende leukocyten in combinatie met FACS data.
- Bepaal het aantal cellen worden gekleurd en geanalyseerd door FACS. Dit wordt beïnvloed door verschillende factoren (bv tumor histologie type tumor leeftijd en grootte, gemiddelde percentage van infiltrerende leukocyten, enz.).
Opmerking: In B16 melanoma, vonden we een laag percentage van tumor-infiltrerende leukocyten (TIL; meestal <5%) in vergelijking met tumorcellen. Zo werden ten minste 1 x 10 6 totaal tumor (tumor + infiltreren leukocyten) cellen meestal verzameld via FACS voor analyse.- De trypan gekleurde counting data, berekende hoeveelheid cellen worden gekleurd voor FACS. Als bijvoorbeeld TIL vormen typisch 5% van de totale tumorcellen (veel van de tumorcellen doden van trypan vlek is), dit element in het totale aantal tumorcellen enkele celsuspensie te worden gekleurd.
- Voor minder vaak leukocyt subgroepen bijv CCR9 + PDC) gebruikt een groter totaal aantal tumorcellen (bijvoorbeeld 3/2 x 10 6) voor FACS kleuring, gezien de relatief lage frequentie van deze cellen in de enkele celsuspensie.
- Vlekken op de tumor enkele celsuspensie voor FACS.
- Voor levende / dode discriminatie gebruik een fixeerbaar beits of niet fixeerbaar vlek (bijvoorbeeld propidiumjodide) worden gebruikt. Wanneer cellen worden gekleurd zonder levende / dode discriminatie moet voorzichtigheid geboden worden gezien de mogelijkheid tot niet-specifieke binding van antilichamen.
- Vlekken op de celsuspensie voor specifieke leukocyten subsets met behulp van een standaard FACS kleuringsprotocol. Block cellen om niet-specifieke antilichaambinding met PBS / FBS bevattende 1% rattenserum en Fc block (anti-CD16 / 32) gedurende 10 min voor kleuren met antigeenspecifieke antilichamen verminderen. Neem de juiste isotype controle antilichamen te zorgen kleuring specifiek is.
- Op dit punt, na de FACS kleuring is voltooid, stelt de monsters met 4% formaldehyde of soortgelijke fixeermiddel. WINKEL monsters bij 4 ° C in de dark (als om het doven van fluoroforen vermijden) op het moment van het verzamelen en analyseren.
Opmerking opslaan gefixeerde monsters gedurende langere tijd kan leiden tot verandering van het signaal en de intensiteit van de fluoroforen 21. - Het verzamelen van de monsters op een flowcytometer. Optimale doorstroomcytometer instellingen is afhankelijk van het type instrument en de setup laser / detector.
OPMERKING: Daarnaast kan er variabiliteit tussen experimenten, zelfs bij gebruik van dezelfde machine. Zo verrichten passende machine setup (bijvoorbeeld met behulp van kalibratie kralen) op een passende vergoeding instelling voorafgaand aan FACS verzamelen en analyseren van elk experiment te verzekeren.
- Analyse van leukoctye subsets
- Met FACS data-analyse software, om de gegevens te analyseren. Voor een live / dead vlek, te beginnen door gating uit dode cellen. Gebruik antilichaam tegen een leukocyten specifieke marker (bijvoorbeeld anti-CD45) om leukocyten te identificeren binnen de levende cellen.
- Na deze, gebruik maken van diverse gating regelingen aan specifieke subsets identificeren, afhankelijk van de kleuring protocol. Bijvoorbeeld om CD4 + T-cellen te identificeren, selecteer de regio SSC lo van de CD45 + populatie en selecteer de CD19-CD3 + cellen; van deze CD4 + T-cellen kunnen worden geïdentificeerd 22.
- Analyseren van gegevens en presenteren die op een aantal verschillende manieren om te zorgen voor samenhang en identificeren van patronen of trends (dwz gebruik maken van de totale aantallen, percentages, of ratio's om subsets te kwantificeren).
OPMERKING: Zo hebben we gekeken naar het totale levend CD45 + cellen als een percentage van de totale tumorcellen verzameld (figuur 1). Daarnaast vervolgens berekend we het percentage van elke leukocyt deelverzameling (bijv CD4 + T-cellen) in de tumor en vergeleken als verhoudingen tussen de controle- en testgroepen (figuur 3).
- Met FACS data-analyse software, om de gegevens te analyseren. Voor een live / dead vlek, te beginnen door gating uit dode cellen. Gebruik antilichaam tegen een leukocyten specifieke marker (bijvoorbeeld anti-CD45) om leukocyten te identificeren binnen de levende cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze resultaten toonden dat geforceerde overexpressie van chemerin in muriene B16 tumoren vergroot het percentage van tumor-infiltrerende leukocyten (TIL). Bovendien, veranderingen in de relatieve verhouding van leukocyten subsets vertegenwoordigd in de tumor micro verbonden chemerin expressie geïdentificeerd. Re-print met toestemming van Pachynski et al. 6.
Figuur 1 toont dat er een aanzienlijke toename van de totale CD45 + cellen (TIL's) binnen in de tumoren die chemerin uitgedrukt vergeleken met controles, zoals bepaald door FACS-analyse van resectie dag 17 tumoren. Met gekleurd, cryosectioned B16 tumoren, de toename infiltrerende CD45 + cellen door immunofluorescentie van tumoren werd bevestigd (figuur 2).
Verdere analyse van FACS gegevens blijkt een relatieve stijging gemiddeld NK-cellen, T-cellen, en conventionele DC (Lin-B220- CD11c +) in de tumoren waar ChemErin was over-expressie vergeleken met de controle tumoren (figuur 3). Er was een relatieve afname van de percentages van leukocyt subgroepen die een rol spelen bij het onderdrukken of kunnen immuunresponsen, specifiek myeloïde afgeleide suppressor cellen (Lin-CD11b + GR1 +) en PDC (Lin-B220 + CD11c int PDCA1 +) 16,23 onderdrukken .
Een toenemend aantal studies hebben de verhouding van leukocyten subsets getoond binnen de tumor micro-omgeving een belangrijke factor zijn, zowel in termen van tumorgroei en de klinische resultaten 4,24,25. Onze FACS data werd verder geanalyseerd om het aantal T-cellen (totaal CD3 +) en NK cellen per tumorcel onthullen; deze celtypen werden steeds vertegenwoordigd in de chemerin expressie tumoren vergeleken met controles (Figuur 4).
Een directe vergelijking van effector (dwz NK en T cellen) en suppressor cellen (dwz MDSC en PDC) populaties binnen de tumor microenviron ment beide tumorgroepen werd vervolgens uitgevoerd. Figuur 5 toont aanzienlijke verhogingen van de verhoudingen van effector suppressor celpopulaties binnen de chemerin expressie tumoren vergeleken met controles.
Over het algemeen, de representatieve resultaten tonen de effecten van chemerin expressie in de tumor micro-omgeving op leukocyten deelverzameling bevolkingsgroepen, en de gunstige scheeftrekken van deze populaties en verhoudingen op een wijze die in overeenstemming met het klinisch voordeel gezien.
. Figuur 1: Verhoogde tumor infiltrerende leukocyten in chemerin expressie tumoren tumoren uitgesneden uit chemerin-expressie versus controle op dag 17 werden geanalyseerd op CD45 + leukocyt infiltratie (% levensvatbare cellen) door flowcytometrie; * P <0,05 bij tweezijdige t-toets toont gemiddelde ± SEM van 4 of meer muizen per groep.
2 "src =" / files / ftp_upload / 52.657 / 52657fig2.jpg "/>
. Figuur 2: Beeldvorming van B16 melanoom TIL Immuunfluorescentie beelden illustreren CD45 + celinfiltraten (witte pijlen) in de controle en chemerin-uiting melanomen weggesneden op dag 9; balk vertegenwoordigt 25 pm.
. Figuur 3: Veranderde representatie van leukocyten subsets in-chemerin uiten tumoren FACS analyseert gegevens werd omgezet via log 2 verhouding van TIL deelverzameling frequentie in chemerin- uiten tov controle tumoren voor PDC (plasmacytoïde DC; Lin- CD11c int B220 + PDCA1 +), CDC (conventionele DC; Lin-CD11c hi B220-), CD4 (CD3 + CD4 +) T-cellen, CD8 (CD3 + CD8 +) T-cellen, totale T-cellen (CD3 + CD4 + en CD3 + CD8 +), NK-cellen (CD3-NK1. 1+), CD11b (Lin-CD11b +) monocyt / macrofagen, MDSC (myeloide suppressor cellen; Lin-CD11b + GR1 +) en CD19 + B-cellen (CD3-CD19 +).
guur 4 "src =" / files / ftp_upload / 52.657 / 52657fig4.jpg "/>
Figuur 4:. Veranderde verhoudingen van effector suppressor leukocyten in B16 tumoren Dag 17 B16 melanoma tumoren werden geanalyseerd door FACS zoals beschreven. Individuele leukocyten subsets werden geïdentificeerd door gating. De verhouding van NK of totale T-cellen MDSC of pDC in elk type tumor werd vervolgens berekend.
Figuur 5:. Verhoogde effectorcellen in chemerin expressie B16 tumoren control of chemerin expressie tumoren werden geanalyseerd door FACS. Absolute aantallen T- en NK-cellen per 10.000 totaal tumorcellen werden berekend met de FACS gegevens. De resultaten zijn afkomstig uit een representatief experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het uitvoeren gedetailleerde analyse van de tumor micro kritisch bepalen van de mechanismen en gevolgen van immunomodulatie. Met de toenemende aanwezigheid van immunotherapeutische in de menselijke klinische rijk begrijpen van de invloed van deze middelen op de tumor infiltrerende leukocyten steeds vereiste vaststelling van hun werkingsmechanisme. Bij mensen bestaan vaak klinische en / of logistieke problemen bij het verkrijgen en analyseren van tumorweefsel voor leukocyt deelanalyse en daarmee analyse van de perifere immuunrespons wordt vaak uitgevoerd. Het uitvoeren van preklinische studies in diermodellen Hiermee kan de onderzoeker om de impact van immunomodulerende middelen op het immuunsysteem in de tumor zelf meer volledig te verkennen, waardoor meer inzicht geven in de mechanismen die van invloed kunnen klinische resultaten.
De techniek maakt gedetailleerde analyse van tumor-infiltrerende leukocyten. Omdat de gehele tumor micro kanbemonsterd worden, kan een meer globale visie van het immuunsysteem aanwezigheid in de tumor worden beoordeeld. En, tenslotte, het saldo van pro-tumor suppressor cellen en anti-tumor effector cellen kunnen een significant effect op tumorgroei en klinische resultaten 4 hebben. Zo, dit type analyse is waardevol bij het verstrekken van de onderzoeker met gedetailleerde informatie over de specifieke leukocyten subsets aanwezig. Deze gedetailleerde gegevens kunnen worden gebruikt in combinatie met andere functionele gegevens aan de opheldering immuun mechanismen in de tumor.
De relatieve eenvoud van het protocol kan men grotere cohorten van tumoren te evalueren om de variabiliteit binnen groepen minimaliseren. In vergelijking met de typische en gebruikte techniek van beeldvorming (door IHC of immunofluorescentie), onze techniek maakt de identificatie van zeer specifieke leukocyt subgroepen door gebruik veelkleurige flowcytometrie. Het vermogen monsters ofwel de gehele tumor (inclusief omtrek) of een deel vande tumor geeft de onderzoeker extra flexibiliteit op het gebied van bemonstering en analyse. Dit maakt het ook mogelijk de samenstelling van aanzienlijk meer gegevens met betrekking tot leukocyten dan zou kunnen worden verkregen door analyse van meerdere coupes door beeldvorming, waardoor een nauwkeuriger beeld van de tumor micro geven.
We gebruikt deze techniek op subcutane tumoren, die wijd in muismodellen gezien het relatieve gemak van tumor inoculatie en metingen. Aldus zou dit protocol toepasbaar voor waarschijnlijk de meeste tumormodellen gebruikt worden. Echter, kan de techniek ook worden toegepast om tumoren uitgesneden uit orthotope of spontane tumormodellen, zij het met extra stappen voor resectie. En terwijl B16 melanoma enzymdigestie niet nodig om een enkele celsuspensie te verkrijgen, kunnen er andere tumortypes voor zover dit vereist is om een uniforme verkrijgen representatieve enkele celsuspensie. Er zijn ook voordelen die beeldvorming van de tumor sections biedt dat niet kan worden beoordeeld met onze techniek. Zo kan nadere informatie over leukocyt lokalisatie binnen de tumor micro worden verkregen via IHC / IF, en kan vaak een waardevolle aanvulling op de door FACS-analyse gegevens.
Concluderend onze techniek voor evaluatie van leukocyten subsets in de tumor micro-omgeving kan de onderzoeker gedetailleerde analyse van het immuunsysteem aanwezigheid in een tumor met een relatief eenvoudige protocol uitvoeren. Het kan worden toegepast op de meeste muizen tumormodellen en kan helpen verduidelijken waardevolle informatie over het type leukocyten, het aantal en verhoudingen aanwezig in de tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies R01-CA169354 en R01-047822 van de National Institutes of Health en een Merit Award van het Department of Veterans Affairs (ECB). RKP werd ondersteund door NIH T32 CA009287-30A1, een ASCO Young Investigator Award, Californië Breast Cancer Research Project Fellowship en een American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ werd ondersteund door NIH-subsidie AI079320. JM werd ondersteund door beurzen van NIH T-32 training subsidie T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 en American Cancer Society post-doctorale beurs PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
