Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Оценка опухоли инфильтрирующие лейкоцитов подмножеств в подкожной опухоли модели

doi: 10.3791/52657 Published: April 13, 2015

Abstract

Специализированный иммунные клетки, которые проникают в микроокружение опухоли регулировать рост и выживание неоплазии. Злокачественные клетки должны ускользать или подорвать противоопухолевые иммунные ответы, чтобы выжить и процветать. Опухоли воспользоваться рядом различных механизмов иммунной "побега", включая вербовку толерогенную округ Колумбия, иммунодепрессанты регуляторные Т-клетки (регуляторные Т-клетки), и миелоидного происхождения супрессоров (MDSC), которые ингибируют цитотоксические реакции противоопухолевые. С другой стороны, противоопухолевый эффекторные иммунные клетки могут замедлить рост и расширение злокачественных новообразований: иммуностимулирующих дендритных клеток, естественных клеток-киллеров, которые несут врожденный иммунитет против опухоли, и цитотоксических Т-клеток все могут участвовать в подавлении опухоли. Баланс между про- и анти-опухолевых лейкоцитов в конечном счете определяет поведение и судьбу трансформированных клеток; Множество клинических исследованиях у человека уже это подтвердили. Таким образом, детальный анализ лейкоцитов подмножеств вмикросреда опухоль становится все более важным. Здесь мы опишем метод для анализа Проникнув лейкоцитов подмножеств, присутствующие в опухоли микроокружения в опухолевой модели мыши. Мышь В16 опухолевые клетки меланомы инокулировали подкожно в мышей C57BL / 6. В указанное время, опухоли и окружающую кожу иссекают единым блоком и обрабатываются в отдельных клеточных суспензий, которые затем окрашивали в течение многоцветной проточной цитометрии. Используя различные лейкоцитов подмножества маркеров, мы смогли сравнить относительные проценты проникновения лейкоцитов подмножеств между контролем и chemerin-выражения опухоли. Исследователи могут использовать такой инструмент для изучения иммунной присутствие в опухоли микроокружения и в сочетании с традиционными измерения размеров суппорт опухолевого роста потенциально позволит им выяснить влияние изменений в иммунной композиции на рост опухоли. Такой метод может быть применен к любой модели опухоли, в котором опухоль и его микроокружение Cбыть резекции и обрабатывается.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Баланс между ростом опухоли и поощрения и регрессии, в частности, зависит от баланса про- и анти-опухолевых проникновения лейкоцитов, присутствующих в микросреде 1,2. С целью изучения микросреды опухоли (TME) и, в частности выявления Проникновение субпопуляций лейкоцитов, мы разработали метод для оценки подкожных опухолей на мышиной модели опухоли. Важность изучения микроокружение опухоли хорошо известна и поддерживается в литературе. Многочисленные исследования показали, что баланс про- и анти-опухолевых проникновения иммунных клеток может повлиять на результаты роста опухоли, а не только в мыши, но и человеческие исследования (обзор в 3,4). Например, Curiel и др. Показали, что ухудшило клинические результаты в больных раком яичников коррелировали с присутствием увеличение процентного содержания опухолевых-проникновения регулирующих CD4 + Т-клеток (Tregs) 5. Наша собственная работа также показал эффективность НетVel лейкоцитов хемоаттрактант от соотношения лейкоцитов подмножеств в модели меланомы мыши 6, в котором также коррелирует со снижением роста опухоли. Таким образом, подробный анализ лейкоцитов подмножеств в опухоли в настоящее время более широко признается и большее значение.

Есть много способов, чтобы оценить микросреду опухоли для проникновения лейкоцитов; например группы разработаны трансгенных мышей, чтобы выразить различные флуоресцентные белки для того, чтобы изображение TME 7, классическая иммуногистохимии и иммунофлуоресценции сохранившихся участков 8, в том числе различных методов визуализации, таких как МРТ, ПЭТ, конфокальной микроскопии 9-11 - некоторые со способностью следить прижизненно 10,12. Они могут быть использованы с различными молекулярными агентов визуализации, таких как наночастицы или 13 новых контрастных веществ 14, что метка иммунные клетки. Наш подход метод проточной цитометрии основе и имеет ряд преимуществ.Во-первых, вся микросреда опухоль можно попробовать; во время анализа, весь подкожной опухоли и окружающие периферии хирургическим резекции для обработки. Это исключает какой-либо потенциально дискретизации уклон в пределах одного опухоли и дает более «глобальный» анализ опухоли в целом. Во-вторых, с помощью многоцветной проточной цитометрии, чтобы проанализировать лейкоцитов подмножеств позволяет более конкретно оценить фенотип проникают лейкоцитов. В зависимости от количества используемых цветов, очень специфические подмножества могут быть определены. Это важно, поскольку есть несколько лейкоцитов подмножеств в конкретном типе клеток - или даже в генеральной классификации подтипа - которые имеют разнородные функции, которые являются потенциально значимым в определении судьбы опухоли. Например, плазмоцитов дендритные клетки (PDC) были вовлечены в противоопухолевого иммунитета 15. Тем не менее, CCR9 + подмножество PDCs было показано, что толерогенную 16, и смещение бакопье такого подмножества могут иметь влияние на рост опухоли.

Наш способ подходит для подкожного или других опухолей, которые могут быть резекции единым блоком. В наших руках, опухоли были равномерно резекции во время эвтаназии. Тем не менее, можно предположить, как это было сделано в некоторых исследованиях, которые подкожной опухоли может быть полностью резекции с закрытием окружающей кожи в хирургии выживания 17, таким образом позволяя дополнительную оценку животного. Анализ затем выполняется на удаленной опухоли. Таким образом, результаты представляют собой единый временной точке в развитии опухоли. Хотя это позволяет детально рассмотреть в микросреде, это также статическая картинка того, что, несомненно, динамичный процесс. Тем не менее, отдельные лейкоциты (например, с помощью магнитной сепарации или градиент плотности) может быть проанализирован отдельно от эпителия опухоли и стромы, или использоваться в других, функциональных анализов для дальнейшего определения их фенотип, как это было previменно описано 18. Этот метод, то было бы полезно для всех исследователей, заинтересованных в понимании состава лейкоцитов в пределах опухолевого микроокружения в данный момент времени, независимо от того в условиях естественного течения заболевания, или после определенного терапевтического возмущения. Хотя это и не сделано нами, вариации этой процедуры могут также потенциально быть использованы для анализа конкретных участков опухоли в изоляции. Например, если размер опухоли, периферийной зоной (ы) может быть отсечен от центральной, возможно, некротических ядро ​​опухоли, чтобы дать исследователю более пространственно отделены вид на микроокружение опухоли.

В растущей области иммунологии опухолей, не будет, без сомнения, растет в геометрической прогрессии количество исследований, оценивающих новейших иммуномодулирующих агентов в мышиных моделях опухолей. Несколько отчетов выделяются различия в конкретных функциональных лейкоцитов в опухоли по сравнению с периферической ENсреды. Например, Шафер-Weaver и др. Показали на мышиной модели, что антиген-специфических Т-эффекторы CD8 + клеток, в то время как активность в периферии, были преобразованы в CD8 + Т-супрессорных клеток, когда они продают в опухоли микроокружения 19. Это было отчасти из-за TGF-beta, но и другие факторы, вероятно, участвует также. Таким образом, оценивая лейкоцитов подмножеств - числа и коэффициенты, а также функциональное состояние - в самой опухоли даст более точное представление о влиянии конкретной иммуномодуляцию на судьбе опухоли.

Наша методика позволяет детальный анализ опухоли и обеспечивает исследователю возможность более тесно определить изменения в лейкоцитарной населения по сравнению с предыдущими подходами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденным Стэнфорд, Пало-Альто А. ЖКХ, а также Национальные институты здравоохранения Институциональная AnimalCare и использования Комитетом руководящих принципов.

1. Подготовка для образца сбора и обработки (Необходимое время: ~ 10-15 мин)

  1. Посев мышиных клеток меланомы B16F0 (0,5-1 × 10 6) подкожно на или вблизи средней линии живота в женских C57BL / 6 мышей, как описано ранее 6. Кроме того, инокуляции опухолевых клеток на дополнительных анатомических участков (например, боковая, жировой ткани молочной железы и т.д.).
    Примечание: Любое количество опухолей (имплантированные или спонтанное) могут быть использованы и оценены с использованием этого протокола. Например, другие обычно используется сингенные опухоли у мышей C57BL / 6, включают толстой кишки линии МС38, карцинома легких Льюис (LLC), а простаты TRAMP-C2 линию. В то время как человека ксенотрансплантатов инокулировали в иммунодефицитных мышей также может быть оценена, таким образом, следует отметить, что рrofiles опухоли-проникновение лейкоцитов обязательно быть изменены в соответствии с иммунодефицитом состояния хост-мыши.
    1. Используйте полный средства массовой информации (например, RPMI, содержащей 10% FBS и добавки) или другого соответствующего белка, содержащего буфер (например, HBSS или PBS + 1% FBS или 1% BCS). Холод носитель или буфер до 4 ° С до euthanization.
  2. Настроить собрание трубы и фильтры для резекции опухоли; разместить их на льду.
    1. Используйте один 50 мл коническую трубку в опухоли, подлежащей резекции. Вставьте суспензии клеток фильтр 40-70 мкм в каждом из них. Кроме того, использование 15 мл конические пробирки с металлическим фильтром сетки. Использование 5 мл шприца или толстую ручку, чтобы создать чашеобразную фильтр в верхней части 15 мл пробирку.
  3. Подготовка документов для резекции и опухолевой обработки; использовать хирургические щипцы и тонких ножниц резекцию и опухоли процесса. Используйте 70% этанола, чтобы очистить инструменты между образцами резекции / опухолей. Для большего количества OОбразцы F (например,> 10), мы рекомендуем одновременную обработку образцов при нескольких исследователей, чтобы избежать существенных различий во времени обработки между образцов опухоли.

2. Резекция опухоли (Необходимое время: ~ 5 мин / опухоль)

  1. Эвтаназии В16 опухоли мышей по отдельности, используя диоксид углерода или другой утвержденный метод.
  2. Безопасный мыши на хирургическом этапе. Спрей области опухоли с 70% этанола и протрите излишки офф; это помогает предотвратить распространение любых современных волос. Для не-ню мышей, бриться участок кожи вокруг опухоли до резекции по мере необходимости.
  3. Использование щипцов и ножниц, резекцию подкожной опухоли единым блоком, в том числе наружным и кожу вокруг. Количество «Маржа» кожи мер может быть разнообразным, но обычно резекцию 2-3 мм кожи вокруг опухоли.
    1. Взвесьте резекции опухоли (+/- окружающей кожи) в этой точке. Поместите Резецированная раздел кожа / опухоли в фильтре крепится внутри PLASTIC коническую трубку.

3. Подготовка Single Cell опухоли подвеска (Необходимое время: ~ 5-7 мин / опухоль)

  1. Используйте пинцет и ножницы, чтобы пропустить через мясорубку опухоли и облегающего / окружающей кожи. Фарш образец с помощью ножниц, пока все большие участки ткани не будут обработаны в 1-2 мм разделах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, целые опухоли обрабатываются; С другой стороны, для более крупных опухолей, репрезентативные участки опухоли могут быть измельчают и обрабатывают.
  2. Использование поршень из шприца одноразового 5 или 10 мл, механически разбить фарш опухолевой ткани от обеспеченного фильтра.
  3. Использование пипетки, вымыть обработанную ткань опухоли с 5-10 мл холодной массовой информации или буфера. Это флеш единичные клетки через фильтр.
  4. Повторите описанные выше действия несколько раз, убедившись, что общее количество и объемы промывок примерно то же самое для аналогичного размера опухоли.
    1. После промывки обработанного опухолевой ткани, наблюдаетсянебольшие фрагменты кожи и / или другой соединительной ткани должны быть оставлены в фильтре.
    2. Кроме того, для опухолей, где одна механическая разбивка может быть недостаточно, пищеварения коллагеназы и / или других ферментов могут быть выполнены перед процедурой мясорубки. Это позволит более тщательного суспензии отдельных клеток. Тем не менее, следует отметить, что такие протоколы пищеварения может влиять поверхностного антигена выражение 20, так что следует соблюдать осторожность при интерпретации этих результатов.
  5. Вымойте и осаждения клеток путем добавления СМИ / буфера и центрифугирования при 4 ° C 500 мкг в течение 5 мин.

4. FACS окрашивание отдельных клеток подвеска (Необходимое время: ~ 30-60 мин)

  1. Ресуспендируют клеток в ледяной FACS буфера (PBS + 1% FBS).
  2. Граф жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего и гемацитометра, или автоматизированного счетчика клеток.
  3. Определите суммарную жизнеспособного выхода клеток на единицу объема. Эти данные могут быть использованы для экстраполяцииАбсолютное число опухолевых проникновения лейкоцитов в сочетании с данными FACS.
  4. Определить количество клеток, которые будут окрашивали и анализировали с помощью FACS. Это будет зависеть от нескольких факторов (например, опухоли Гистологический тип, возраст и размера опухоли, средний процент Лейкоциты проникают, и т.д.).
    Примечание: В меланомы В16, мы обнаружили, низкий процент опухолевых проникновения лейкоцитов (TIL; как правило, <5%) по сравнению с опухолевыми клетками. Таким образом, по крайней мере, 1 × 10 6 Общий опухоли (опухоль + Лейкоциты проникают) клетки, как правило, собирают с помощью FACS анализа.
    1. Используя данные Трипановый окрашенных подсчета, рассчитывается объем ячейки, которые будут окрашены для FACS. Например, если TIL как правило, составляют 5% от общего количества опухолевых клеток (многие из опухолевых клеток будет мертвым на трипанового пятна), фактор это в общем количестве опухоли суспензии одной клетки должны быть окрашены.
    2. Для менее распространённых лейкоцитов подмножеств, например, CCR9 + PDC) использовать больший общее количество опухолевых клеток (например 2-3 × 10 6) для окрашивания FACS, с учетом относительной низкой частоты этих клеток в суспензии отдельных клеток.
  5. Пятно опухоли одного суспензии клеток для FACS.
    1. Для живого / мертвого дискриминации, используйте поправимо пятно или без поправимо пятно (например, пропидийиодидом) могут быть использованы. Если в ячейке окрашивают без живой / мертвый дискриминации, следует проявлять осторожность посоветовали, учитывая потенциал для неспецифического связывания антител.
    2. Пятно клеточной суспензии для конкретных лейкоцитов подмножеств с использованием стандартного протокола окрашивания FACS. Блок для уменьшения клетки неспецифического связывания антитела с PBS / FBS, содержащей 1% сыворотки крыс и Fc Block (анти-CD16 / 32) в течение 10 мин до окрашивания антиген-специфических антител. Включить правильные антитела контрольного изотипа для обеспечения окрашивание является специфическим.
    3. В этот момент, после того, как окрашивание FACS завершена, исправить образцы с 4% формальдегидом или другого подобного закрепляющего агента. Магазин образцы при 4 ° С в ДПгк (как, чтобы избежать тушения флуорофоров) до момента сбора и анализа.
      Примечание: Хранение фиксированные образцы в течение длительных периодов времени может привести к изменению в сигнале и интенсивности флуорофоров 21.
    4. Сбор образцов на цитометра потока. Оптимальное проточный цитометр настройки будут изменяться в зависимости от типа инструмента и установки лазерного / детектор.
      Примечание: Кроме того, могут быть изменчивости между экспериментами, даже при использовании той же машине. Таким образом, выполняют соответствующие настройки устройства (например, с использованием калибровочных бусы), чтобы обеспечить соответствующую настройку компенсации до сбора и анализа каждого эксперимента FACS.
  6. Анализ leukoctye подмножеств
    1. Использование программного обеспечения для анализа данных FACS, анализировать данные. Для Live / Dead пятна, начните с Память мертвые клетки. Использование антитела против лейкоцитов специфического маркера (например, анти-CD45), чтобы определить лейкоцитов в живых клетках.
      1. После этого, используют различные гатинг схемы, чтобы определить конкретные подмножества, в зависимости от протокола окрашивания. Например, чтобы определить CD4 + Т-клеток, выберите регион, SSC ло от населения CD45 + и выберите + клеток CD19-CD3; из этого CD4 + Т-клеток могут быть идентифицированы 22.
    2. Анализ данных и представить его в ряде различных способов обеспечения согласованности и выявления закономерностей или тенденций (т.е. использовать общие цифры, проценты, или отношения количественно подмножества).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, мы смотрели на в живом CD45 + клеток в процентах от общего числа опухолевых клеток, собранных (рисунок 1). Кроме того, мы затем рассчитывается процент от каждой лейкоцитов подмножества (например, CD4 + Т-клеток) в опухоли и сравнили их как отношения между контрольной и опытных групп (рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Наши результаты показали, что вынуждены сверхэкспрессии chemerin в мышиных опухолей В16 увеличивало процент опухолевых проникновения лейкоцитов (Tīls). Кроме того, были выявлены изменения в относительной пропорции лейкоцитов подмножеств, представленных в опухоли микроокружения, связанного с выражением chemerin. Повторная печать с разрешением от Pachynski и др. 6.

Рисунок 1 показывает, что существует значительное увеличение в общем объеме CD45 + клеток (TILS) в в опухолях, которые выразили chemerin по сравнению с контрольной группой, как определено FACS анализа удаленной день 17 опухолей. Использование загрязнен, cryosectioned B16 опухоли, увеличение проникновения CD45 + клеток с помощью иммунофлюоресценции опухолей было подтверждено (рис 2).

Дальнейший анализ данных FACS показывает относительное увеличение, в среднем, НК-клеток, Т-клеток, и обычные DC (Lin-B220- CD11c +) в опухолях где chemeРин сверхэкспрессируется по сравнению с контрольными опухолями (рисунок 3). Был относительное снижение в процентном соотношении лейкоцитов подмножеств, которые играют роль в подавлении или может подавить иммунный ответ, в частности, миелоидный полученных из супрессоров (Lin-CD11b + GR1 +) и PDC (линейно B220 + CD11c INT PDCA1 +) 16,23 ,

Все большее число исследований показали, соотношение количества лейкоцитов подмножеств в опухоли микроокружения быть важным фактором, как с точки зрения роста опухоли и клинических исходов 4,24,25. Наши данные FACS дополнительно анализируют, чтобы показать количество Т-клеток (общее CD3 +) и NK-клеток в опухолевой клетке; Эти типы клеток более представлены в chemerin-выражения опухоли по сравнению с контролем (рис 4).

Прямое сравнение эффектов (т.е. NK и Т-клетки) и супрессоров клетки (т.е. MDSC и PDC) населения во microenviron опухоли ние в обеих группах опухолевых затем выполняется. Фиг.5 показывает значительное увеличение соотношения эффектора к популяции клеток супрессоров в пределах chemerin экспрессирующих опухолей по сравнению с контрольной группой.

В целом, показательные результаты показали, что эффект chemerin выражение в опухоли микроокружения на популяции лейкоцитов подмножество и благоприятным перекос этими группами населения и показателей в соответствии с клиническим эффектом видел.

Фигура 1
. Рисунок 1: Увеличение опухоли Лейкоциты проникают в chemerin-выражения опухоли Опухоли вырезали из chemerin-выражения по сравнению с контролем на 17-й день были проанализированы на CD45 + лейкоцитарной инфильтрацией (% жизнеспособных клеток) с помощью проточной цитометрии; * Р <0,05 Т-теста два-Стьюдента средние показатели ± SEM из 4 или более мышей в группе.

2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52657 / 52657fig2.jpg "/>
. Рисунок 2: Визуализация меланомы В16 TIL изображения иммунофлюоресценции показывают CD45 + клеток инфильтраты (белые стрелки) в контроле и chemerin-выражения меланомы вырезанные на 9-й день; бар представляет 25 мкм.

Рисунок 3
. Рисунок 3: Измененное представление лейкоцитов подмножеств chemerin-выражения опухоли FACS анализ данных был преобразован с помощью журнала 2 отношение Тиль частоты подмножество в chemerin- выражения против контрольных опухолей для PDC (плазмоцитов DC; линейно CD11c INT B220 + PDCA1 +), CDC (обычные DC; Lin-CD11c привет B220-), CD4 (CD3 + CD4 +) Т-клеток, CD8 (CD3 + CD8 +) Т-клетки, всего Т-клетки (CD3 + CD4 + и CD3 + CD8 +), NK-клетки (CD3-NK1. 1+), CD11b (Lin-CD11b +) моноциты / макрофаги, MDSC (миелоидных происходит супрессоры; Lin-CD11b + GR1 +), и CD19 + В-клетки (CD3-CD19 +).

цифра 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52657 / 52657fig4.jpg "/>
Рисунок 4:. Измененные отношения эффектор-супрессоров лейкоцитов в В16 опухолей день 17 B16 опухоли меланомы были проанализированы с помощью FACS, как описано. Индивидуальные подмножества лейкоцитов были выявлены стробирования. Отношение общего количества NK или Т-клеток в MDSC или PDC в каждого типа опухоли затем вычисляется.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Увеличение эффекторные клетки в chemerin-выражения В16 опухолей контроля или chemerin-выражения опухоли были проанализированы с помощью FACS. Были рассчитаны абсолютные числа Т и NK клеток на 10000 полных опухолевых клеток, используя данные FACS. Результаты из типичного эксперимента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Выполнение подробный анализ микросреды опухоли имеет решающее значение в определении механизмов и последствий иммуномодуляцию. С увеличением присутствия иммунотерапевтических в клинической сфере человека, понимания воздействия этих препаратов на опухолевые проникновения лейкоцитов становится реквизит в определении механизма их действия. У человека часто существуют клинические и / или логистических трудностей в получении и анализе опухолевой ткани для анализа лейкоцитов подмножества, и, таким образом, анализ периферической иммунной реакции часто выполняется. Выполнение доклинических исследований на животных моделях позволяет исследователю более полно изучить влияние иммуномодулирующих агентов на иммунную систему в самой опухоли, тем самым давая дополнительное понимание механизмов, которые могли бы повлиять на клинические исходы.

Наша методика позволяет детальный анализ опухолевых инфильтрирующие лейкоцитов. Потому что вся микросреда опухоль можетотбор проб, более глобальный взгляд иммунной присутствия в опухоли может быть оценена. И, наконец, баланс супрессорных клеток про-опухолевых клеток-эффекторов и противоопухолевых может оказать значительное воздействие на рост опухоли и клинических исходов 4. Таким образом, этот вид анализа является ценным в предоставлении исследователю с подробной информацией о конкретных лейкоцитов подмножеств присутствующих. Это подробные данные могут быть использованы в сочетании с другими функциональными данных для дальнейшего выяснения иммунные механизмы в опухоли.

Относительная простота протокола позволяет оценить более крупные когорты опухолей, чтобы минимизировать вариабельность в пределах групп. По сравнению с более типичной и распространенной подхода томографии (либо IHC или иммунофлюоресценции), наша методика позволяет выявить весьма специфических лейкоцитов подмножеств путем использования многоцветной проточной цитометрии. Способность к образцу либо весь опухоли (в том числе периферии) или разделОпухоль дает исследователю дополнительную гибкость с точки зрения отбора проб и анализа. Это также позволяет составление значительно больше данных, касающихся лейкоцитов, чем можно было бы получить при анализе нескольких разделах ткани изображений, таким образом давая более точную картину микроокружения опухоли.

Мы использовали эту технику на подкожных опухолей, которые широко используются в моделях мыши Учитывая относительную легкость прививки и измерений опухоли. Таким образом, этот протокол будет применяться для вероятного большинства моделей опухолей используется. Тем не менее, метод может быть применен и к опухолям резекции от ортотопических или спонтанных опухолевых моделях, хотя и с дополнительным мерам по резекции опухоли. И в то время как меланомы В16 не требуют ферментативного расщепления, чтобы получить суспензии отдельных клеток, могут быть и другие типы опухолей, где этот шаг необходим, чтобы получить форму, представитель суспензии отдельных клеток. Есть также преимущества, которые визуализация опухоли sectiДополнения дает, что не может быть оценена с нашей техникой. Например, более конкретные данные о локализации лейкоцитов в опухоли микроокружения может быть получено с помощью IHC / IF, и это часто может быть ценным дополнением к данным анализа FACS.

В заключение, наша техника для оценки лейкоцитов подмножеств в рамках микросреды опухоли позволяет исследователю проводить детальный анализ иммунной наличии в опухоли с помощью относительно простой протокол. Это может быть применено к большинству моделей опухолей мыши и может помочь выяснить ценную информацию о типе лейкоцитов, количества и соотношений настоящего в опухоли.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами R01-CA169354   и R01-047822   из Национального института здоровья и поощрительных выплат от Департамента по делам ветеранов (ЕЦБ). РКП была поддержана NIH T32 CA009287-30A1, в ASCO для молодых исследователей Award, Калифорния груди Cancer Research Project стипендий и Американского общества рака наставником ученый-исследователь гранта; БАЗ была поддержана NIH грант AI079320. Миссия была поддержана стипендий от НИЗ T-32 субсидия на обучение T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 и Американского онкологического общества после защиты докторской диссертации общение PF-12-052-01-CSM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Cellgro 10-040 http://cellgro.com; keep on ice
FBS Cellgro 35-011-CV http://cellgro.com
50 ml conical tubes Falcon 14-432-22 fischersci.com
40 μm filter Falcon 08-771-1 fischersci.com
5 ml syringe BD 14-823-35 fischersci.com
surgical scissors/forceps Roboz RS-5910 roboz.com
PBS Cellgro MT-21-030-CM http://cellgro.com; keep on ice
trypan blue Cellgro MT-25-900-CI fischersci.com
hemacytometer Hausser Scientifice  02-671-54  fischersci.com
Live/Dead stain Life Technologies L34957 lieftechnologies.com
FlowJo software TreeStar, Inc flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14, (3), 155-160 (2004).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6, (10), 715-727 (2006).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14, (10), 1014-1022 (2013).
  4. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12, (4), 298-306 (2012).
  5. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10, (9), 942-949 (2004).
  6. Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209, (8), 1427-1435 (2012).
  7. Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
  8. Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46, (6), 12-13 (2014).
  9. Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
  10. Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2, (11), e26677 (2013).
  11. Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, (3), 281-290 (2010).
  12. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8, (2), e57135 (2013).
  13. Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13, (3), 1-11 (2014).
  14. Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2, (2), e23034 (2013).
  15. Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118, (3), 1165-1175 (2008).
  16. Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9, (11), 1253-1260 (2008).
  17. McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21, (4), 363-369 (2004).
  18. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
  19. Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183, (8), 4848-4852 (2009).
  20. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  21. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71, (6), 379-385 (2007).
  22. Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
  23. Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59, (10), 1593-1600 (2010).
  24. Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (9), 4275-4280 (2010).
  25. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331, (6024), 1565-1570 (2011).
Оценка опухоли инфильтрирующие лейкоцитов подмножеств в подкожной опухоли модели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).More

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter