Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Utvärdering av tumörinfiltrerande Leukocyte Subsets i en subkutan tumör Model

doi: 10.3791/52657 Published: April 13, 2015

Abstract

Specialiserade immunceller som infiltrerar tumören mikromiljö reglera tillväxten och överlevnaden av neoplasi. Maligna celler måste undkomma eller undergräva antitumörimmunsvar för att överleva och blomstra. Tumörer dra fördel av ett antal olika mekanismer för immun "flykt", inklusive rekrytering av tolerogena DC, immunsuppressiva regulatoriska T-celler (tregs), och myeloida-härledda suppressorceller (MDSC) som hämmar cytotoxiska antitumörsvar. Omvänt kan antitumör effektorceller immunceller bromsa tillväxten och expansionen av maligniteter: immunstimulerande dendritiska celler, naturliga mördarceller som hyser medfödda antitumörimmunitet, och cytotoxiska T-celler kan alla delta i tumörsuppression. Balansen mellan pro- och antitumör leukocyter slutligen bestämmer beteende och öde transformerade celler; en mängd kliniska studier har burit ut det här. Således detaljerad analys av leukocyter delmängder inomtumören mikromiljö har blivit allt viktigare. Här beskriver vi en metod för att analysera infiltrerande leukocyter delmängder närvarande i tumörmikromiljön i en mus-tumörmodell. Mus B16 melanom-tumörceller inokulerades subkutant i C57BL / 6-möss. Vid en viss tidpunkt, var tumörer och omgivande hud resekterades klump och bearbetas till enkelcellsuspensioner, som sedan färgas för flera färger flödescytometri. Med hjälp av en mängd olika leukocyt delmängd markörer, kunde vi jämföra de relativa procentandelar av infiltrerande leukocyter delmängder mellan kontroll och chemerin uttryck tumörer. Utredarna får använda ett sådant verktyg för att studera immun närvaro i tumören mikromiljö och i kombination med traditionella bromsok storlek mätningar av tumörtillväxt, potentiellt ger dem möjlighet att belysa effekterna av förändringar i immun sammansättning på tumörtillväxt. En sådan teknik kan tillämpas på vilken tumör som helst modell där tumören och dess mikromiljö cen resekeras och bearbetas.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Balansen mellan tumörtillväxt och främjande och regression är delvis beroende av balansen mellan pro- och antitumör infiltrerande leukocyter som finns i mikromiljön 1,2. För att studera tumörmikro (TME) och specifikt identifiera infiltrerande leukocyter subpopulationer, utvecklade vi en metod för utvärdering av subkutana tumörer i en murin tumörmodell. Vikten av att studera tumörens mikromiljö är välkänd och stöds i litteraturen. Ett flertal studier har visat att balansen mellan pro- och antitumör infiltrerande immunceller kan påverka resultaten av tumörtillväxt, inte bara i mus utan också humanstudier (granskas i 3,4). Till exempel, Curiel et al. Visade att försämrats kliniska utfall i ovarian cancerpatienter var korrelerade med närvaron av ökande procentandelar av tumörinfiltrerande regulatoriska CD4 + T-celler (tregs) 5. Vårt eget arbete visade också effekten av ett nejvel leukocyt chemoattractant på förhållandet leukocyter delmängder i en mus melanom modell 6, som också korrelerad med minskad tumörtillväxt. Således är de detaljerade analyser av leukocyter delmängder inom en tumör nu mer allmänt erkänt och allt viktigare.

Det finns många sätt att utvärdera tumören mikromiljö för infiltrerande leukocyter; till exempel grupper har konstruerats transgena möss för att uttrycka olika fluorescerande proteiner för att bilden TME 7, klassisk immunohistokemi och immunofluorescens bevarade avsnitten 8, inklusive olika avbildningsmetoder såsom MRI, PET, konfokalmikroskopi 9-11 - några med förmågan att övervaka intravitally 10,12. Dessa kan användas med olika molekylavbildningsmedel, såsom nanopartiklar 13 eller nya kontrastmedel 14 som märka immunceller. Vår metod är en flödescytometri baserad metod och har flera fördelar.Först kan hela tumören mikromiljö provtas; vid tidpunkten för analysen, är hela subkutan tumör och omgivande periferin kirurgiskt opererande för bearbetning. Detta eliminerar varje eventuellt provtagning förspänning inom en enda tumör och ger en mer "globala" analys av tumören som helhet. För det andra, med hjälp av multi flödescytometri för att analysera leukocyt delmängder tillåter oss att mer specifikt bedöma fenotypen av infiltrerande leukocyter. Beroende på antalet färger som används, kan mycket specifika delmängder identifieras. Detta är viktigt eftersom det finns flera leukocyter delmängder inom en viss celltyp - eller till och med i en allmän subtyp klassificering - som har skilda funktioner som har en stor potential i att bestämma ödet för tumören. Exempelvis har plasmacytoid dendritiska celler (PDC) implicerats i antitumörimmunitet 15. Däremot har CCR9 + delmängd av pDCs visats vara tolerogena 16, och flytta över det balans av en sådan delmängd kan ha en inverkan på tumörtillväxt.

Vår metod är lämplig för subkutan eller andra tumörer som kan resekterade klump. I våra händer, var tumörerna likformigt resekterades vid tidpunkten för eutanasi. Det är dock tänkbart, så som har skett i vissa studier, att en subkutan tumör kunde helt opererande med nedläggningen av den omgivande huden i en överlevnads kirurgi 17, vilket möjliggör ytterligare utvärdering av djuret. Analysen utförs sedan på den resekterade tumören. Således, de resultat representerar en enda tidpunkt i tumörens utveckling. Även om detta gör att en detaljerad inblick i mikromiljön, är det också en statisk bild av vad som är utan tvekan en dynamisk process. Men isolerade leukocyter (t.ex. via magnetisk separation eller densitetsgradient) kan sedan analyseras separat från tumören epitel och stroma, eller användas i andra, funktionella analyser för att ytterligare definiera deras fenotyp, vilket har varit PREVígare beskrivits 18. Denna metod, då, skulle vara bra för alla utredare är intresserade av att förstå sammansättningen av leukocyter inom tumörmikro vid en given tidpunkt, vare sig i inställningen av den naturliga sjukdomsförloppet, eller efter en specifik terapeutisk störning. Även om det inte görs av oss, variationer av detta förfarande skulle även kunna utnyttjas för att analysera specifika delar av en tumör i isolering. Till exempel, med tanke på storleken av tumören, den perifera zonen (er) kunde dissekeras bort från den centrala, möjligen nekrotiska kärnan av tumören för att ge forskaren en mer rumsligt segregerad vy av tumörens mikromiljö.

I den spirande området tumörimmunologi, kommer det utan tvekan vara en exponentiellt växande antal studier som utvärderar nya immunmodulerande medel i murina tumörmodeller. Flera rapporter har belyst skillnaderna i specifik leukocytfunktion inom tumören kontra perifera svmiljön. Exempelvis Shafer-Weaver et al., Visade i en musmodell som antigenspecifik T effektor CD8 + -celler, medan aktiv i periferin, transformerades in i CD8 + T-suppressorceller när de trafikerade i tumörmikromiljön 19. Detta berodde delvis på grund av TGFp, men andra faktorer är sannolikt inblandade också. Således, utvärdera leukocyter delmängder - siffror och nyckeltal, samt funktionell status - kommer inom själva tumören ge en mer korrekt bild av effekten av en viss immunmodule på tumör öde.

Vår teknik tillåter detaljerad analys av tumören och förser forskaren tillfälle att närmare identifiera förändringar i leukocytpopulationer än tidigare metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Alla djurförsök har utförts i enlighet med godkända Stanford, Palo Alto VA HCS, och National Institutes of Health Institutionell AnimalCare och användning kommittén riktlinjer.

1. Förberedelser för Provtagning och Processing (Tidsåtgång: ~ 10-15 min)

  1. Inokulera murina B16F0-melanomceller (0,5-1 x 10 6) subkutant vid eller nära mittlinjen på buken i C57BL / 6-möss, såsom beskrivits tidigare sex. Alternativt, ympa tumörceller vid ytterligare anatomiska ställen (t.ex. flank, juverfett pad, etc).
    OBS: Valfritt antal tumörer (implanteras eller spontant) kan användas och utvärderas med hjälp av detta protokoll. Exempelvis kan andra vanligen använda syngena tumörer i C57BL / 6 inkluderar colon linjen MC38, Lewis lungkarcinom (LLC), och prostata TRAMP-C2 linje. Medan mänskliga xenografter ympades i immundefekta möss kan också utvärderas på detta sätt, bör det noteras att profiles av tumörinfiltrerande leukocyter kommer med nödvändighet att ändras i enlighet med immunbrist tillstånd värd musen.
    1. Använd komplett medium (t.ex. RPMI innehållande 10% FBS och tillsatser) eller ett annat lämpligt proteininnehållande buffert (t.ex. HBSS eller PBS + 1% FBS eller 1% BCS). Chill media eller buffert till 4 ° C före euthanization.
  2. Inrätta insamlings rör och filter för resekterade tumörer; placera dessa på is.
    1. Använd en 50 ml koniska rör per tumör som ska resekeras. Sätt i en 40-70 um cellsuspension filter i varje. Alternativt kan du använda 15 ml koniska rör med metallfilter mesh. Använd en 5 ml sprutkolv eller tjock penna för att skapa en skålformad filtret vid toppen av 15 ml tub.
  3. Förbered instrument för resektion och tumör behandling; använda kirurgiska pincett och fina sax för att resekera och process tumörer. Använd 70% etanol för att rengöra instrumenten mellan resektioner / tumörprover. För större antal of prover (t.ex.> 10), rekommenderar vi samtidig bearbetning av prover från flera forskare att undvika stora skillnader i handläggningstid mellan tumörprover.

2. tumörresektion (Tidsåtgång: ~ 5 min / tumör)

  1. Euthanize B16 tumörbärande möss individuellt med hjälp av koldioxid eller annan godkänd metod.
  2. Säkra musen på en kirurgisk skede. Spraya tumörområdet med 70% etanol och torka överskottet av; Detta hjälper till att förhindra spridning av något hår närvarande. För icke-nakna möss, raka hudområdet runt tumören före resektion efter behov.
  3. Använda pincett och sax, resekera subkutan tumör i klump, inklusive överliggande och omgivande hud. Mängden "marginal" hud tas kan varieras, men vanligtvis resekera 2-3 mm för huden runt tumören.
    1. Väg resekterade tumörer (+/- omgivande hud) på denna punkt. Placera opererande hud / tumör avsnittet i filtret fäst i plastic koniskt rör.

3. Förbereda en enda cell tumör Suspension (Tidsåtgång: ~ 5-7 min / tumör)

  1. Använd pincett och sax för att skräda tumör och överliggande / omgivande hud. Finhacka provet med sax tills alla stora delar av vävnaden bearbetas till 1-2 mm sektioner.
    OBS: Normalt är hela tumörer behandlas; alternativt för större tumörer, representativa sektioner av tumörer kunde malet och bearbetas.
  2. Med hjälp av en kolv från en engångs 5 ​​eller 10 ml spruta, mekaniskt dela upp det malda tumörvävnad mot säkrade filtret.
  3. Med hjälp av en pipett, tvätta den bearbetade tumörvävnad med 5-10 ml kall medier eller buffert. Detta kommer att spola de enstaka celler genom filtret.
  4. Upprepa ovanstående två steg flera gånger, se till att det totala antalet och volymer av tvättningar är ungefär densamma för liknande storlek tumörer.
    1. Efter tvättning av bearbetade tumörvävnad, observerasmå fragment av hud och / eller annan bindväv bör kvar i filtret.
    2. Alternativt, för tumörer där mekanisk uppdelning ensam inte kan vara tillräckligt, matsmältning med kollagenas och / eller andra enzymer kan utföras före malningen förfarandet. Detta kommer att möjliggöra en mer grundlig encellssuspension. Det bör dock noteras att sådana matsmältning protokoll kan påverka ytantigen uttryck 20, så försiktighet bör iakttas vid tolkning av dessa resultat.
  5. Tvätta och pelletera cellerna genom tillsats av medium / buffert och centrifugering vid 4 ° C 500 x g under 5 min.

4. FACS Färgning av Single Cell Suspension (Tidsåtgång: ~ 30-60 min)

  1. Resuspendera cellerna i iskall FACS buffert (PBS + 1% FBS).
  2. Räkna levande celler med hjälp trypan blå och en hemacytometer eller automatiserade cellräknare.
  3. Bestäm total livsduglig cellutbyte per volym. Denna data kan användas för att extrapoleraabsoluta antalet tumörinfiltrerande leukocyter i kombination med FACS data.
  4. Bestäm antalet celler som skall färgas och analyseras med FACS. Detta kommer att påverkas av flera faktorer (t.ex. tumörhistologi typ, tumör ålder och storlek, genomsnittlig procentsats av infiltrerande leukocyter, etc).
    OBS: I B16 melanom, fann vi en låg andel av tumörinfiltrerande leukocyter (TIL, typiskt <5%) jämfört med tumörceller. Således var minst 1 x 10 6 totalt tumör (tumör + infiltrerande leukocyter) celler normalt in via FACS för analys.
    1. Använda trypan-färgade räkningsuppgifter, till beräknade volymen av celler färgas för FACS. Till exempel, om TIL utgör typiskt 5% av den totala tumörceller (många av tumörcellerna kommer att vara döda på trypan fläck), att faktor detta till det totala antalet tumörenkelcellsuspension färgas.
    2. För mindre vanliga leukocyter delmängder t.ex. CCR9 + PDC) använder ett större antal av totala tumörceller (t.ex. 2-3 x 10 6) för FACS-färgning, med tanke på den relativt låga frekvensen av dessa celler i enkelcellsuspension.
  5. Fläck tumören enkelcellsuspension för FACS.
    1. För levande / döda diskriminering, använd en fixable fläck eller icke-fastställbara färgämne (t.ex. propidiumjodid) kan användas. Om cellen är färgade utan levande / döda diskriminering, måste försiktighet iakttas med tanke på risken för icke-specifik bindning av antikroppar.
    2. Fläck cellsuspensionen för specifika leukocyter delmängder med en vanlig FACS färgningsprotokollet. Block celler att reducera icke-specifik antikroppsbindning med PBS / FBS innehållande 1% råttserum och Fc-block (anti-CD16 / 32) under 10 minuter före färgning med antigenspecifika antikroppar. Inkludera rätt isotyp kontrollantikroppar att säkerställa färgning är specifik.
    3. Vid denna punkt, efter FACS färgning är klar, fixa prover med 4% formaldehyd eller annan liknande fixeringsmedel. Förvara proverna vid 4 ° C i dark (för att undvika släckning av fluoroforer) förrän vid insamling och analys.
      OBS: Lagra fasta prover för långa perioder kan leda till förändring i signal och intensitet fluoroforema 21.
    4. Samla proverna på en flödescytometer. Optimal flödescytometer inställningarna varierar beroende på typ av instrument och laser / detektor setup.
      OBS: Dessutom kan det finnas variationer mellan experiment, även om du använder samma maskin. Således utför lämpliga inställningsmaskin (t.ex. med kalibreringspärlor) för att säkerställa lämplig kompensation inställning före FACS insamling och analys av varje experiment.
  6. Analys av leukoctye delmängder
    1. Använda FACS dataanalys programvara för att analysera data. För en levande / död fläck, börja med att grinda ut döda celler. Använd antikropp mot en leukocyt specifik markör (t.ex. anti-CD45) för att identifiera leukocyter inom levande celler.
      1. Efter detta använder olika Gating system för att identifiera specifika undergrupper, beroende på färgningsprotokollet. Till exempel, för att identifiera CD4 + T-celler, markerar SSC lo region från CD45 + befolkningen och välja CD19-CD3 + celler; från denna CD4 + T-celler kan identifieras 22.
    2. Analysera data och presentera den på ett antal olika sätt att säkerställa konsekvens och identifiera mönster eller trender (dvs använda totala siffror, procentsatser, eller förhållanden att kvantifiera delmängder).
      OBS: Till exempel, vi tittade på totala levande CD45 + celler i procent av totala tumörceller som samlats (Figur 1). Dessutom är vi sedan beräknat andelen varje leukocyt delmängd (t.ex. CD4 + T-celler) i tumören och jämförde dessa som förhållandet mellan kontroll och testgrupper (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Våra resultat visade att tvingas överuttryck av chemerin i murina B16 tumörer förstärkt andelen tumörinfiltrerande leukocyter (TIL). Dessutom har ändringar i relativa förhållandet mellan leukocyter delmängder representerade inom tumörmikromiljö i samband med chemerin uttryck identifieras. Åter ut med tillstånd från Pachynski et al. 6.

Figur 1 visar att det fanns en signifikant ökning av totala CD45 + celler (TIL) inom de tumörer som uttryckt chemerin jämfört med kontroller, som bestäms genom FACS-analys av resekterade dag 17 tumörer. Använda målat, cryosectioned B16 tumörer, ökningen i infiltrerande CD45 + celler genom immunfluorescens av tumörer bekräftades (figur 2).

Ytterligare analys av FACS data visar en relativ ökning i genomsnitt av NK-celler, T-celler, och konventionella DC (Lin-B220- CD11c +) i tumörerna där chemerin var överuttryckt jämfört med kontrolltumörer (Figur 3). Det fanns en relativ minskning av andelen leukocyter delmängder som har en roll i att undertrycka eller kan undertrycka immunsvar, speciellt myeloid-härledda suppressorceller (Lin-CD11b + GR1 +) och PDC (Lin- B220 + CD11c int PDCA1 +) 16,23 .

Ett ökande antal studier har visat att förhållandet mellan leukocyter delmängder inom tumören mikromiljön är en viktig faktor, både vad gäller tumörtillväxt och kliniska resultat 4,24,25. Vår FACS uppgifter analyserades vidare för att visa antalet T-celler (totala CD3 +) och NK-celler per tumörcell; dessa celltyper var alltmer representerade i chemerin uttryck tumörer jämfört med kontroller (Figur 4).

En direkt jämförelse av effektor (dvs. NK- och T-celler) och suppressor-cell (dvs. MDSC och PDC) populationer inom tumören microenviron ment för båda tumörgrupperna var då utföras. Figur 5 visar betydande ökningar i förhållandet mellan effektor till suppressor cellpopulationer inom chemerin-uttryck tumörer jämfört med kontroller.

Sammantaget de representativa resultaten visar effekterna av chemerin uttryck inom tumören mikromiljö på leukocyt delmängd populationer, och den gynnsamma skev av dessa populationer och nyckeltal på ett sätt som överensstämmer med den kliniska nyttan sett.

Figur 1
. Figur 1: Ökade tumörinfiltrerande leukocyter i chemerin-uttryck tumörer Tumörer utmönstras från chemerin uttryck vs kontroll på dag 17 analyserades för CD45 + leukocytinfiltration (% av livsdugliga celler) med flödescytometri; * P <0,05 med två-tailed Students t-test som visar medelvärde ± SEM av med 4 eller fler möss per grupp.

2 "src =" / filer / ftp_upload / 52.657 / 52657fig2.jpg "/>
. Figur 2: Imaging av B16 melanom TIL Immun bilder illustrerar CD45 + cellinfiltrat (vita pilar) i kontroll och chemerin uttryck melanom utskurna vid dag 9; stapel representerar 25 pm.

Figur 3
. Figur 3: Förändrad representation av leukocyter delmängder i chemerin-uttryck tumörer FACS analyserar data omvandlades via log 2 förhållande av TIL delmängd frekvens i chemerin- uttrycker vs tumörer kontroll för PDC (plasmacytoid DC; Lin- CD11c int B220 + PDCA1 +), CDC (konventionella DC, Lin-CD11c hi B220-), CD4 (CD3 + CD4 +) T-celler, CD8 (CD3 + CD8 +) T-celler, totalt T-celler (CD3 + CD4 + och CD3 + CD8 +), NK-celler (CD3-NK1. 1+), CD11b (Lin-CD11b +) monocyter / makrofager, MDSC (myeloida härlett suppressorceller, Lin-CD11b + GR1 +) och CD19 + B-celler (CD3-CD19 +).

gur 4 "src =" / filer / ftp_upload / 52.657 / 52657fig4.jpg "/>
Figur 4:. Förändrad förhållanden av effektor till suppressor leukocyter i B16 tumörer Dag 17 B16 melanomtumörer analyserades med FACS som beskrivits. Individuella leukocyter delmängder identifierades genom gating. Förhållandet mellan NK eller totala T-celler till MDSC eller pDC i varje tumörtyp beräknades sedan.

Figur 5
Figur 5:. Ökad effektorceller i chemerin uttryck B16 tumörer Kontroll eller chemerin-uttryck tumörer analyserades med FACS. Absoluta antalet T och NK-celler per 10.000 totalt tumörceller beräknades med hjälp av FACS uppgifter. Resultaten är från ett representativt experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utföra detaljerad analys av tumören mikromiljö är kritisk för att bestämma de mekanismer och effekter av immunmodule. Med den ökande förekomsten av immunotherapeutics i den humana kliniska sfären, förstå effekterna av dessa medel på tumörinfiltrerande leukocyter blir nödvändiga för att definiera deras verkningsmekanism. I människor, ofta existerar kliniska och / eller logistiska svårigheter att erhålla och analysera tumörvävnad för leukocyt delmängdsanalys, och sålunda analys av det perifera immunsvaret utförs ofta. Utföra prekliniska studier i djurmodeller tillåter forskaren att mer fullständigt undersöka effekterna av immunmodulerande medel på immunsystemet inom själva tumören, vilket ger ytterligare insikt i mekanismer som kan påverka de kliniska resultaten.

Vår teknik tillåter detaljerad analys av tumörinfiltrerande leukocyter. Eftersom hela tumörmikromiljön kanprovtas, kan bedömas en mer global syn på immun närvaro inom tumören. Och, slutligen, kan balansen mellan pro-tumör suppressorceller och antitumör effektorceller har en betydande inverkan på tumörtillväxt och kliniska resultat 4. Således är denna typ av analys värdefullt att ge forskaren med detaljerad information om de specifika leukocyter delmängder närvarande. Denna detaljerade uppgifter kan användas i kombination med andra funktionella data för att ytterligare klarlägga immunmekanismer inom tumören.

Den relativa enkelhet protokollet gör att man kan utvärdera större kohorter av tumörer för att minimera variabiliteten inom grupperna. Jämfört med den mer typiska och utbredda synsätt avbildning (antingen genom IHC eller immunofluorescens), möjliggör identifiering av mycket specifika leukocyter delmängder genom att utnyttja flera färger flödescytometri vår teknik. Förmågan att sampla antingen hela tumören (inklusive periferi) eller ett avsnitt avtumören ger forskaren ytterligare flexibilitet när det gäller provtagning och analys. Detta gör också att sammanställa betydligt fler uppgifter om leukocyter än kunde erhållas genom analys av flera vävnadssnitt från avbildning, vilket ger en mer rättvisande bild av tumören mikromiljö.

Vi utnyttjade denna teknik på subkutana tumörer, som ofta används i musmodeller med tanke på den relativa lätthet av tumörinokulation och mätningar. Således skulle detta protokoll gälla för troligt en majoritet av tumörmodeller som används. Emellertid skulle tekniken även appliceras på tumörer resekterade från orthotopic eller spontana tumörmodeller, om än med ytterligare steg för tumörresektion. Och medan B16-melanom inte krävde enzymdigerering för att erhålla en enkelcellsuspension, kan det finnas andra tumörtyper, där detta steg krävs för att erhålla en enhetlig, representativ enkelcellsuspension. Det finns också fördelar som avbildning av tumör avsons ger som inte kan bedömas med vår teknik. Till exempel kan mer specifika uppgifter om leukocyt lokalisering inom tumören mikromiljö erhållas via IHC / IF, och detta kan ofta vara ett värdefullt komplement till de uppgifter som FACS-analys.

Sammanfattningsvis vår teknik för utvärdering av leukocyter delmängder inom tumörmikromiljö tillåter forskaren att utföra detaljerade analyser av immun närvaro inom en tumör med hjälp av en relativt enkelt protokoll. Det kan appliceras på en majoritet av mus tumörmodeller och kan hjälpa belysa värdefull information om leukocyt typ, antal och nyckeltal närvarande inom tumören.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag R01-CA169354   och R01-047822   från National Institutes of Health och en Merit Award från Department of Veterans Affairs (ECB). RKP stöddes av NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, Kalifornien Breast Cancer Research Project Fellowship, och en American Cancer Society mentor Research Scholar Grant; BAZ stöddes av NIH bidrag AI079320. JM stöddes av stipendier från NIH T-32 utbildningsstipendium T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 och American Cancer Society Postdoktor PF-12-052-01-CSM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Cellgro 10-040 http://cellgro.com; keep on ice
FBS Cellgro 35-011-CV http://cellgro.com
50 ml conical tubes Falcon 14-432-22 fischersci.com
40 μm filter Falcon 08-771-1 fischersci.com
5 ml syringe BD 14-823-35 fischersci.com
surgical scissors/forceps Roboz RS-5910 roboz.com
PBS Cellgro MT-21-030-CM http://cellgro.com; keep on ice
trypan blue Cellgro MT-25-900-CI fischersci.com
hemacytometer Hausser Scientifice  02-671-54  fischersci.com
Live/Dead stain Life Technologies L34957 lieftechnologies.com
FlowJo software TreeStar, Inc flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14, (3), 155-160 (2004).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6, (10), 715-727 (2006).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14, (10), 1014-1022 (2013).
  4. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12, (4), 298-306 (2012).
  5. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10, (9), 942-949 (2004).
  6. Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209, (8), 1427-1435 (2012).
  7. Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
  8. Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46, (6), 12-13 (2014).
  9. Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
  10. Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2, (11), e26677 (2013).
  11. Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, (3), 281-290 (2010).
  12. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8, (2), e57135 (2013).
  13. Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13, (3), 1-11 (2014).
  14. Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2, (2), e23034 (2013).
  15. Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118, (3), 1165-1175 (2008).
  16. Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9, (11), 1253-1260 (2008).
  17. McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21, (4), 363-369 (2004).
  18. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
  19. Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183, (8), 4848-4852 (2009).
  20. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  21. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71, (6), 379-385 (2007).
  22. Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
  23. Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59, (10), 1593-1600 (2010).
  24. Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (9), 4275-4280 (2010).
  25. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331, (6024), 1565-1570 (2011).
Utvärdering av tumörinfiltrerande Leukocyte Subsets i en subkutan tumör Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).More

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter