Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Published: May 1, 2015 doi: 10.3791/52691
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1Murdoch Childrens Research Institute, The Royal Children’s Hospital, 2Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 3Department of Anatomy and Developmental Biology, Faculty of Medicine, Nursing and Health Sciences, Monash University, Clayton

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا البطانية المبطنة اللمفاوية تشوه اللمفاوي السفن وغلفة مثل الكيس البشرية باستخدام الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS). زراعة الخلايا اللاحقة والتوسع في هذه الخلايا تسمح مستوى جديد من التطور التجريبي للدراسات الجينية، البروتين والفنية وتمايز الخلايا.

Abstract

اضطرابات الجهاز اللمفاوي مثل وذمة لمفية الأولية، والتشوهات اللمفاوية وأورام اللمفاوية هي الحالات النادرة التي تسبب اعتلال كبير ولكن لا يعرف الكثير عن علم الأحياء الخاصة بهم. ان عزل خلايا نقي للغاية الإنسان اللمفاوية البطانية (موظفين المدنيين المحليين) من الأنسجة المريضة والسليمة تسهيل الدراسات البطانة اللمفاوية عند مستويات الوراثية، الجزيئية والخلوية. ومن المتوقع أن هذه التحقيقات قد تكشف عن أهداف لعلاجات جديدة يمكن أن تغير الإدارة السريرية لهذه الشروط. ويرد بروتوكول يصف عزل القلفة البشرية موظفين المدنيين المحليين وتشوه اللمفاوي الخلايا البطانية اللمفاوية (LM موظفين المدنيين المحليين). للحصول على ومفروم واحدة الأنسجة تعليق خلية وتعامل إنزيمي استخدام dispase الثاني وكولاجيناز II. ثم وصفت مما أدى تعليق خلية واحدة مع الأجسام المضادة لمجموعة من التمايز (CD) علامات CD34، CD31، الأوعية الدموية غشائي عامل نمو 3 (VEGFR-3) وPODOPLANIN. STAIتم فرز خلايا قابلة للحياة نيد على فارز خلية تنشيط fluorescently (FACS) لفصل CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGFR-3 نقاط البيع PODOPLANIN نقاط البيع LM LEC السكان من البطانية وغيرها من الخلايا غير البطانية. وLM موظفين المدنيين المحليين مرتبة كانت مثقف وتوسعت في قوارير فبرونيكتين المغلفة للاستخدام مزيد من التجارب.

Introduction

وثمة وظيفة رئيسية من الأوعية الدموية اللمفية هي لاستيعاب الليمفاوية، وهو السائل الخلالي الزائد تحتوي على الدهون والبروتينات والمكونات الخلوية، وإجراء ذلك إلى الجهاز الوريدي الدم. وهناك شبكة من الشعيرات الدموية الليمفاوية توجه الليمفاوية إلى الغدد الليمفاوية حيث يتم عرض الفيلم لوجود مستضدات الخارجية، وهي عملية هامة في مراقبة المناعة ونشر خلايا الدم البيضاء لتحييد المستضدات الأجنبية.

يبدأ الجهاز اللمفاوي أحادي الاتجاه في الأنسجة مع الشعرية اللمفاوي الأولي، بنية فريدة من نوعها مع طبقة واحدة متقطعة من الخلايا البطانية مسطحة رقيقة الجدران مع تقاطعات الخلية المتخصصة التي تسمح دخول الليمفاوية 1،2. وترد هذه الشعيرات الدموية إلى المصفوفة النسيج الضام المجاورة عبر ترسيخ خيوط لمنع انهيار سفينة في وجود زيادة الضغط الخلالي 3. الشعيرات الدموية اللمفاوية الأولية فارغة إلى جمع الشعيرات الدموية اللمفاويةأن تتجمع في الأوعية الليمفاوية أو الأوردة الكبيرة. مقارنة المبدئي السفن الشعرية اللمفاوية، وجمع الأوعية اللمفاوية لها جدران الأوعية سمكا، والصمامات اللمفاوية تقرن والمغطى من قبل الغشاء القاعدي متقطع التي هي جزء لا يتجزأ بضع خلايا العضلات الملساء 4. افتتاح منسق وإغلاق الصمامات اللمفاوية وانكماش خلايا العضلات الملساء يسهل تدفق الليمفاوية 3. في البشر، والأوردة الليمفاوية من مناطق مختلفة من الجسم الانضمام لتشكيل جذوع اللمفاوية التي الاندماج لتكوين اثنين من القنوات اللمفاوية: القناة الصدرية والقناة اللمفية اليمنى. القناة الصدرية يستنزف الليمفاوية من الجانب الأيسر من الجسم ومن الجانب الأيمن تحت الصدر في حين أن الصحيح اللمفاوي تستنزف القناة الليمفاوية من الذراع الأيمن والجانب الأيمن من الرأس والعنق والصدر. كلا القنوات الليمفاوية تجري في عروق تحت الترقوة في الرقبة 5.

يتم تجميع اضطرابات في الجهاز الليمفاوي على نطاق واسع في اكتسبتالثاني الخلقية (الجدول 1). أمثلة للظروف التي حصلت هي التهاب الأوعية اللمفاوية وذمة لمفية ثانوية. التهاب الأوعية اللمفاوية هو التهاب سفينة اللمفاوية بسبب عدوى بكتيرية. الأوعية اللمفاوية المصابة تمدد وملء مع الافرازات التي تحتوي على خلايا النوى. في الجلد، وهذه الأوعية اللمفاوية واضحة كما أحمر، والشرائط تحت الجلد المؤلم كثيرا ما يكون مصحوبا توسيع استنزاف العقدة الليمفاوية المرتبطة بها (الغدد الليمفاوية) 6. تنشأ وذمة لمفية ثانوية نتيجة وقوع اضرار او عرقلة لاللمفاوية سفينة أو العقدة الليمفاوية انسداد. وهذا يؤدي إلى تورم التدريجي المزمن بسبب تراكم الليمفاوية البعيدة للضرر أو إعاقة. في البلدان المتقدمة، ويرتبط وذمة لمفية ثانوية الأكثر شيوعا مع الخباثة حيث تعرقل الأورام المتفاقمة الأوعية اللمفاوية أو الغدد الليمفاوية الإقليمية، أو نتيجة للعلاج مضاد للسرطان عقب الاستئصال الجراحي للالغدد الليمفاوية، والتليف بعد التشعيع وthrom آخر للالتهاباتbosis وتندب 7. في أجزاء أخرى من العالم، قد تكون وذمة لمفية ثانوية الثانوية لعرقلة اللمفاوية التي تسببها الديدان الطفيلية مثل الفخرية البنكروفتية 6.

اضطرابات في الأوعية الدموية اللمفية
مكتسب خلقي منذ الولادة
العقد اللمفية
وذمة لمفية ثانوية 		وذمة لمفية الابتدائية 10 متفرقة تشوهات اللمفاوي 13 اللمفاوية التشوهات المصاحبة المتلازمات 13
على سبيل المثال
ميلروي متلازمة
ميج متلازمة 		بسيطة:
التشوهات اللمفاوية 		على سبيل المثال
كليبل-Tranaunay متلازمة
الحدائق ويبر متلازمة
متلازمة ستيرج ويبر
جنبا إلى جنب:
التشوهات-الشعرية اللمفاوي
تشوه الشعرية-اللمفاوية-وريدي
تشوه الشعرية-اللمفاوية-الشرايين والأوردة
الشعرية-اللمفاوي تشوه وريدي شرياني-

الجدول 1. نظرة عامة على اضطرابات الأوعية الدموية اللمفية.

وتشمل الاضطرابات الخلقية من الجهاز اللمفاوي الابتدائية (مجهول السبب) وذمة لمفية يعتقد أن سببها الطفرات الجينية، توسع الأوعية اللمفية والشذوذ من 8،9 الجهاز اللمفاوي. وذمة لمفية الأولية يمكن أن يكون متقطعا المفترض أنها ناتجة عن دي نوفو الطفرات، أو الموروثة. يمكن أن الاضطرابات اللمفاوية أيضا أن تكون معزولة أو تشمل جزءا من متلازمة أكثر عمومية 10. في عدد من الأطفال و 97٪ من الليمفاويةوذمة غير متقطعة مع تشوهات في الهيكل السفينة اللمفاوية التي تعيق الليمفاوية الإقليمي الصرف 11. مرض ميلروي مثال على ذمة لمفية الأولية الناجمة عن طفرة في الجين VEGFR-3 واضحا عند الولادة أو بعد وقت قصير من 12. على الرغم من حالة معظمها العائلية، كما يمكن التعرف على المرض ميلروي في الرضع دون تاريخ عائلي من مرض ميلروي 32. شدة أي وذمة لمفية تعتمد على كمية الإنتاج الليمفاوية والقدرة على نقل الليمفاوية مرة أخرى إلى الدورة الدموية الوريدية 6.

بناء على الأعراض السريرية وخارج الموقع تكاثر الخلايا البطانية في، تصنف الحالات الشاذة من الجهاز اللمفاوي كما الأورام اللمفاوية أو تشوهات اللمفاوية 13. Kaposiform lymphangiomatosis مثال ورم LEC 14. ويعتقد أن التشوهات اللمفاوية أن تنشأ أثناء التطور الجنيني والنمو في نسبة للطفل 15،16. ونادرا ما تتراجع ولكن يمكن remaiن أعراض حتى الصدمة أو الإصابة رواسب النمو السريع مما يؤدي إلى مضاعفات السريرية. وزعزع هيكل منظم للشبكة اللمفاوية والتوصيل الليمفاوية من الأنسجة إلى الدورة الدموية الوريدية المذكورة أعلاه في تشوهات اللمفاوية التي تتكون من مجموعات المترجمة من الهياكل الكيسي غير طبيعية مليئة السائل اللمفاوي. في حين لا يوجد أي دليل سريري أو التجريبية التي ترتبط هذه السفن الكيسي إلى الدورة اللمفاوية أو أنها تحتوي على صمامات اللمفاوية وظيفية، وتأكيد هويتهم اللمفاوية التي كتبها التعبير عن مجموعة من علامات الخلية اللمفاوية مثل PODOPLANIN، CD31، اللمفاوي سفينة غشائي مستقبلات 1 (LYVE-1)، بروسبيرو homeobox البروتين 1 (PROX-1) وVEGFR-3 15،17،18. ويمكن لهذه الهياكل الكيسي يكون إما صغيرة (التكيسات الدقيقة) أو كبيرة (macrocystic)، ولكن معظم التشوهات الليمفاوية تحتوي على كل التكيسات الدقيقة والمكونات macrocystic (الشكل 1) 16. بعد الجراحة، injectioن الطب النفسي و / أو الترددات اللاسلكية التشوهات اللمفاوية غالبا ما تتكرر.

الشكل 1
الشكل 1. مورفولوجية الأوعية اللمفاوية البشرية والتشوهات اللمفاوية. اللمفاوية الإنسان العادي (A) والأوعية اللمفاوية تشوه (B و C) المسمى مع الأجسام المضادة لPODOPLANIN (التسمية البني، السهم). وتتميز السفن تشوه اللمفاوية البشرية من خلال التوسع الملحوظ والتفاوت الكبير في حجم التجويف. ويمكن لهذه الهياكل الكيسي غير طبيعية محلية تكون إما صغيرة (التكيسات الدقيقة، *) (B) أو كبيرة (macrocystic، #) (C). معظم التشوهات الليمفاوية تحتوي على كل مكونات التكيسات الدقيقة وmacrocystic. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. </ P>

وقد اقترح بعض الباحثين أن التشوهات الليمفاوية تمثل اضطراب النمو من الأوعية الدموية اللمفية التي موظفين المدنيين المحليين لا تملك إمكانات نمو غير طبيعي ولكن بدلا من ذلك فشلت في الاتصال التداول العادي 19. ومع ذلك، فقد وجدنا أن موظفين المدنيين المحليين LM تتكاثر بشكل أسرع وأكثر مقاومة للموت الخلايا المبرمج من القلفة موظفين المدنيين المحليين 15 مما يدل على أن هناك خلل أساسي في LM موظفين المدنيين المحليين. عندما يتم زرعها LM موظفين المدنيين المحليين في نموذج الفأر طعم أجنبي، فإنها تشكل هياكل تذكر من التشوهات اللمفاوية 15. وهذا يدعم فرضية أن التشوهات اللمفاوية قد يكون سبب واحد أو أكثر الطفرات الجسدية التي تنشأ في LM موظفين المدنيين المحليين أثناء التطور الجنيني. في الواقع، وقد حددت التقارير الأخيرة واحدة من هذه الطفرة في الوحيدات الحفاز p110α من فسفوإينوزيتيد-3-كيناز (PIK3CA) جين 20.

وبالنظر إلى التقدم في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي، والطفرات ذات الصلة جولد تحديدها بسهولة أكبر في معزولة LM موظفين المدنيين المحليين، وتوجيه الدراسات المستقبلية من هذه الشروط. ان عزل موظفين المدنيين المحليين قابلة للحياة تسهيل المقارنات بين موظفين المدنيين المحليين غير طبيعية وعادية في المقايسات مثل الهجرة، والانتشار، أنبوب تشكيل القدرة والبقاء على قيد الحياة في استجابة لانخفاض توافر المواد الغذائية أو العوامل المؤيدة لأفكارك 15. سوف موظفين المدنيين المحليين معزولة كذلك تمكننا من تنفيذ خلية محددة التعبير الجيني والدراسات البروتين، لتحديد الفئات السكانية LEC جديدة واكتشاف كلاء الدوائية الرواية مناسبة لإدارة السريرية للتشوهات اللمفاوية.

نشرنا سابقا طريقة عزل LEC على أساس الفصل المغناطيسي حبة من موظفين المدنيين المحليين من القلفة حديثي الولادة والتشوهات اللمفاوية 15. أبلغنا استراتيجية فصل موظفين المدنيين المحليين السليمة والمصابة من خلايا بطانة الأوعية الدموية على أساس عدم وجود CD34 التعبير، تليها إخضاع CD34 NEG جزء الخلية لاختيار إيجابية للCD31.ومع ذلك، وقد أعاق هذا الأسلوب من خلال وجود خلايا غير البطانية المتبقية. كان هذا مستقلة عن إزالة البشرة قبل لاحق الهضم النسيج الضام. انتشرت هذه الملوثات عادة بسرعة أكبر، وبالتالي overgrew في نهاية المطاف مزارع الخلايا البطانية على الرغم من المحاولات اللاحقة لتكرار LEC العزلة. في الواقع، كان تلوث الأولي من الخلايا غير البطانية منخفضة تصل إلى 2٪ إلى 5٪ كافية لتطغى على السكان LEC 15. ودفع هذا لنا لاستكشاف تنشيط الخلايا fluorescently فرز طريقة كخيار لتحسين LEC العائد الخلية والنقاء. بالإضافة إلى ذلك، كنا متعددة المعلمة الفرز لتعزيز خصوصية السكان LEC، مضيفا VEGFR-3 وPODOPLANIN إلى علامات التحديد إلى تحديد CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGFR-3 نقاط البيع PODOPLANIN نقاط البيع موظفين المدنيين المحليين.

واستند الأساس المنطقي لاختيار هذه العلامات على التقارير أنه في حين أن موظفين المدنيين المحليين والأوعية الدموية الدم البطانية مLLS دينا العديد من علامات سطح الخلية المشتركة مثل CD31، تظهر موظفين المدنيين المحليين التباين المظهري في التعبير عنها من CD34، PODOPLANIN وVEGFR-3 خلية علامة السطح بالمقارنة مع خلايا الدم بطانة الأوعية الدموية 21-23. CD31 هو بروتين سكري الغشاء 130 كيلو دالتون المعروف أيضا باسم الصفائح الدموية جزيء التصاق الخلايا البطانية 1 (PECAM-1). وهو يعتبر أن يكون علامة الخلية عموم البطانية منذ يتم التعبير عن ذلك على جميع أنواع الدم والأوعية اللمفاوية 21،24،25. CD34 هو 110 كيلو دالتون عبر الغشاء بروتين سكري موجودة على معظم السلف المكونة للدم والخلايا، وخلايا بطانة الأوعية الدموية وبعض الأوعية اللمفاوية 26 الجذعية.

VEGFR-3، ومستقبلات للنمو بطانة الأوعية الدموية عوامل C و D، هو في البداية موجودة على الأوردة النامية في جنين الفأر، ولكن المواصفات التالية اللمفاوية التي تنظمها النسخ العوامل المرتبطة SRY-HMG-مربع (SOX) -18، ج hicken س valbumin ش pstreaم ص ر romoter ranscription و الممثل 2 (COUPTF-II) وPROX-1، يتم فقدان VEGFR-3 التعبير الوريدي ويصبح مقتصرا على الجنينية موظفين المدنيين المحليين 25،27. PODOPLANIN، وهو غشاء كيلو دالتون 38 بروتين مخاطي، ويلاحظ أولا على الأوعية اللمفاوية في الجنينية تقريبا يوم 11 (~ E11.0) من الماوس التطور الجنيني 28 وبينما هو أعرب بقوة من قبل الاوعية الدموية الدقيقة الأوعية اللمفاوية، PODOPLANIN التعبير البطانة اللمفاوية macrocystic في تشوهات اللمفاوية هو أكثر متغير 15. التدفق الخلوي التجارب تشير إلى أن ما لا يقل عن بعض الخلايا البطانية CD34 CD31 العليا بوس تعبر عن علامة اللمفاوية PODOPLANIN 29. على الرغم من أن التقييم المنهجي للLYVE-1 وPODOPLANIN تلطيخ في تشوهات اللمفاوية البشرية أظهرت أن كلاهما فعال في تلطيخ اللمفاوية تشوه البطانة 30، في الأنسجة الطبيعية، أفيد LYVE-1 أن يكون حاضرا بقوة في اللمفاوية الأوليالبطانة الشعرية لكنها خفضت وحتى غائبة في البطانة اللمفاوية جمع 31. كما هدفنا هو عزل كل من الخلايا البطانية اللمفاوية الأولية وجمع اخترنا عدم استخدام LYVE-1 كجزء من استراتيجية اختيار خلية لدينا. أخيرا، واستند قرار لتوظيف هذه العلامات أيضا على توافر الأجسام المضادة التي تستخدم في التشخيص لوصفها الأوعية اللمفاوية للتصوير المجهري، وهي الميزة التي من شأنها أن تسمح العلاقة بين التدفق الخلوي والدراسات مناعي.

هذه المادة سوف يصف طريقة الهضم الأنسجة، وتلطيخ الخلايا وضبط FACS المطلوبة لعزل الناجحة لCD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGFR-3 نقاط البيع PODOPLANIN نقاط البيع موظفين المدنيين المحليين وكذلك الخلايا البطانية CD34 CD31 العليا بوس VEGFR-3 نقاط البيع PODOPLANIN نقاط البيع من القلفة وتشوه اللمفاوي الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لجمع تشوه والقلفة الأنسجة اللمفاوية من البحوث لجان الأخلاقيات الإنسانية في مستشفى الملكي للأطفال في ملبورن، أستراليا: بيان الأخلاق. وكان في استقبال موافقة موقعة من الآباء والأمهات المرضى قبل الجراحة. تم جمع عينات الأنسجة من المرضى الذين شخصت مع LMS تمر العمليات الجراحية كجزء من إدارتها السريرية والمرضى الذين يخضعون للختان الانتخابية. تم تنفيذ جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا.

1. إعداد تعليق خلية من القلفة واللمفاوي تشوه الأنسجة

  1. مخازن وإعداد وسائل الإعلام.
    1. تحضير كامل وسائل الاعلام الخلايا البطانية باستخدام المتاحة تجاريا EGM-2 MV رصاصة كيت عن الاحترار EGM-2 وسائل الاعلام وذوبان مكونات عدة في 37 ° C حمام الماء بلطف. في الصف الثاني الوزراء للسلامة الأحيائية، جو معقم و مطهرإضافة كل عنصر في وسائل الإعلام EGM-2. مرة واحدة تضاف جميع المكونات إلى وسائل الإعلام، الرجاء الرجوع إلى وسائل الإعلام ب "الكامل وسائل الاعلام الخلايا البطانية. استخدام معقم 50 مل ماصة لخلط محتويات قبل استخدامها.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات المتعلقة ثقافة خلية في مجلس الوزراء واقية من الدرجة الثانية. يتم تخزين كل الحلول عند 4 درجات مئوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتحسنت إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. وتحسنت وسائل الإعلام كاملة البطانية الخلية، ومخازن زراعة الخلايا وحلول الانزيم عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام.
    2. تكملة الكامل وسائل الاعلام الخلايا البطانية مع 50 نانوغرام / مل VEGF-C. قسامة وسائل الإعلام الخلايا البطانية تستكمل إلى 50 مل أنابيب معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. وسائل الإعلام غير مستقر لمدة 4 أسابيع على الأقل عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
    3. يعد الكالسيوم والمغنيسيوم حرة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عن طريق إذابة 8.752 غرام كلوريد الصوديوم، 1.416 غرام نا 2 هبو 4 .2H 2 O و0.395 غرام KH 2 PO 4 في 1000 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. فلتر تعقيم PBS باستخدام 0.22 ميكرون تصفية وتخزينها في 4 ° C. قبل استخدام المضادات الحيوية إضافة محلول / مضاد فطري (المستخدمة في 1: 100).
    4. لإعداد فبرونيكتين الإنسان، حل 1 ملغ من فبرونيكتين في 10 مل من الماء المعقم. متجر الحل في 100 مكل أعيد تشكيلها في -20 ° C. في يوم من استخدام إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى 100 ميكرولتر من فبرونيكتين قسامة (لإعطاء تركيز العمل النهائية من 10 ميكروغرام / مل).
    5. لوسائل الإعلام الانزيم، وإعداد محلول يحتوي على 0.04٪ Dispase II، 0.25٪ كولاجيناز الثاني و 0.01٪ الدناز أنا في برنامج تلفزيوني العقيمة. أولا، تزن dispase وكولاجيناز، ومكان في أنبوب معقم 50 مل، إضافة الكمية المطلوبة من برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية إلى حل. مرة واحدة المنحل، تعقيم فلتر (0.22 ميكرون فلتر) حل dispase / كولاجيناز في مجال السلامة الأحيائية غطاء محرك السيارة. جو معقم و مطهر إضافة I. مخزن الدناز الحل الأنزيمية عند 37 درجة مئوية حتىاستخدام.
      ملاحظة: الدناز I هي ثقافة خلية الصف كاشف التجارية المتاحة على شكل مسحوق مجفف بالتجميد العقيمة.

2. إعداد تعليق خلية من القلفة واللمفاوي التشوهات

  1. تزن أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من DMEM / 2٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية. وسيتم استخدام هذا الأنبوب لجمع الأنسجة.
  2. بعد الاستئصال الجراحي للتشوهات اللمفاوي والأنسجة القلفة، جو معقم و مطهر إضافة عينة الأنسجة للأنبوب ونقل على الجليد لمختبر زراعة الخلايا.
  3. وزن الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة وحساب وزن الأنسجة. استخدام هذا الوزن لحساب حجم محلول الأنزيمية اللازمة لهضم الأنسجة.
  4. في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية، واستخدام ملقط معقم لنقل الأنسجة وسائل الاعلام الى 100 ملم صحن زراعة الأنسجة. استخدام مقص العقيمة إلى اللحم المفروم ناعما النسيج إلى ~ 1 مم 3 قطع.
  5. نقل الأنسجة المفروم الممزوج ط الإعلامn لأنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل إضافية العقيمة DMEM / 2٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية. مزيج من قبل انعكاس لاعادة تعليق الأنسجة. الطرد المركزي العينة في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة طاف. على أساس وزن الأنسجة، إضافة 1 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) كولاجيناز II / الدناز I / II Dispase حل الهضم لكل 100 ملغ من الأنسجة المفروم. عموما، استخدم 10 مل من محلول أنزيم لحوالي 1 غرام من الأنسجة المفروم.
  7. احتضان الأنسجة في الحاضنة 37 درجة مئوية ل20-90 دقيقة مع ثابت تهتز في 200 دورة في الدقيقة. في نهاية هذه الفترة، تأكد من أن ما يقرب من جميع الأنسجة وهضمها إلى شظايا غرامة.
    ملاحظة: تعرض الخلايا لكولاجيناز وdispase في وقت بمعزل عن التأثيرات الأنسجة بقاء الخلية الأولي. لقد وجدنا بالتجربة أن معظم العينات القلفة حديثي الولادة تتطلب الأمثل 20-30 دقيقة من عملية الهضم، في حين تليفي عينات تشوه اللمفاوية قد تتطلب 60-90 دقيقة من عملية الهضم. العائد LEC LMوتتأثر الصورة من كمية التليف الحالي، والأنسجة الليفية أكثر تدر أقل من الخلايا، وربما يعود ذلك إلى الآثار الضارة للالتعرض لفترات طويلة لكولاجيناز الثاني وdispase الثاني.
  8. بعد الهضم، ونقل أنبوب إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وتمرير حل الأنسجة هضمها من خلال مصفاة 70 ميكرومتر وضعت في أنبوب معقم 50 مل. باستخدام 3 مل حقنة المكبس مع الغطاس المطاط، وتطحن الأنسجة المتبقية حتى يتم ملاحظة سوى آثار قليلة من المصفوفة خارج الخلية.
  9. غسل مصفاة الخلية مع حجم الخلية البطانية يعادل متوسط ​​لحجم النأي انزيم المتوسطة لاسترداد خلايا تمسك غربال وإبطال نشاط الإنزيمات. على سبيل المثال، لمدة 2 مل من الفصل بين المتوسطة انزيم لهضم الأنسجة المفروم، إضافة 2 مل من البطانية المتوسطة خلية لإبطال نشاط الإنزيمات.
  10. أجهزة الطرد المركزي في حل الخلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق ونضح طاف. تعليق ه-R> الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني. خلايا الطرد المركزي في 300 x جلمدة 5 دقائق، وإزالة طاف ثم كرر غسل الخلايا مرتين. > Resuspend الكرية خلية في 20 مل من البطانية المتوسطة الخلية. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق ثم البذور 2 × 10> 6 خلايا في 150 سم> 2 قارورة قبل المغلفة مع فبرونيكتين في الحجم النهائي من 20 مل من البطانية المتوسطة الخلية. الثقافة عند 37 درجة مئوية في CO 5٪> 2 في حاضنة الهواء مرطب.>
    ملاحظة: من المتوقع أن 75٪ -90٪ من خلايا الأنوية البقاء على قيد الحياة الهضم الأنسجة حسب تقديرات الاستبعاد التريبان الأزرق. عدد خلايا الأولي يعكس كل الخلايا الأنوية في التعليق الخلية (أي الخلايا الكيراتينية، الكريات البيض، الضامة، وخلايا الأنسجة الضامة والخلايا الأوعية الدموية). عدد خلايا في 5-7 أيام يعكس الخلايا التي قد تعلق، على قيد الحياة، وانتشرت خلال زراعة الخلايا. طلاء قوارير زراعة الأنسجة مع فبرونيكتين أيضا يحسن كرا لاحق والبقاء على قيد الحياة LM LEC.
  11. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، ويغسل خلايا غير منضم بعيدا في ثلاثة يغسل مع PBS / 1٪ محلول فطري للمضادات الحيوية وإضافة جديدة المتوسطة الخلايا البطانية. تنفيذ ثلاث يغسل نحو فعال لإزالة الخلايا غير منضم وخلايا الدم الحمراء الموجودة في قارورة. تغيير وسائل الاعلام كل يوم الثاني على التوالي. وستكون خلايا ~ 80٪ متموجة بعد 5-7 أيام.

3. تلوين الأجسام المضادة للخلايا اللمفية لالبطانية علامات سطح الخلية لالتدفق الخلوي

  1. بعد الخلايا قد وصل إلى 80٪ التقاء، نضح المتوسطة وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
  2. فصل الخلايا الملتصقة التي يحتضنها الخلايا مع 7 مل من الخلايا المفرزة حل مثل Accutase في 150 سم 2 قارورة لمدة 5-7 دقيقة عند 37 ° C.
  3. حصاد الخلايا المنفصلة، ​​على تعطيل الحل انفصال الخلايا عن طريق إضافة 3 مجلدات من البطانية المتوسطة الخلية ونقل تعليق خلية إلى أنبوب معقم الجديد.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. طاف نضح واعادة تعليق الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة الصورةupernatant ثم كرر غسل الخلية. إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. حساب عدد خلايا قابلة للحياة. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق خلية مع 90 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق. نقل 10 ميكرولتر من هذا التعليق لعدادة الكريات لفرزها.
    ملاحظة: سوف العائد خلية النهائي يعتمد على حجم العينة المجهزة. العائد خلية المعتاد في 150 نطاقات سم 2 قارورة من 7 × 10 5-1،2 × 10 6 خلايا قابلة للحياة.
  7. إعداد حلول الأجسام المضادة لتلطيخ الخلايا.
    ملاحظة: تم معاير التخفيفات التالية لتلطيخ 1 × 10 6 في حجم تلطيخ من 100 ميكرولتر.
    1. تمييع PE الماوس مترافق المضادة البشرية VEGFR 3 (01:50)؛ PE-Cy7 الماوس مترافق المضادة البشرية CD34 مترافق (1: 200)؛ APC-مترافق الماوس CD31 مكافحة الإنسان (1: 100) واليكسا الفئران 488 مترافق المضادة البشرية PODOPLANIN (1: 200) في إجمالي حجم 100 ميكرولتر العقيمة 5٪ FBS / PBS حل لكل عينة الأنسجة. بعد إعدادحل الأجسام المضادة، والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. وبالمثل تحضير المخفف isotype السيطرة مزيج الأجسام المضادة لتسهيل تحديد التدفق الخلوي البوابات.
  8. للحد من انوعي ملزمة من الأجسام المضادة وخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة طاف ثم توقف الخلايا في 100 ميكرولتر العقيمة 5٪ FBS / PBS حل لكل عينة لتكون ملطخة. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  9. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف ثم إعادة تعليق الخلايا في كوكتيل الضد مترافق. وصمة عار أيضا قسامة صغيرة من الخلايا (1 × 10 5) في 100 ميكرولتر isotype السيطرة مزيج الأجسام المضادة. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  10. لإزالة الأجسام المضادة غير منضم، إضافة 2 مل من 2٪ FBS / PBS حل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف وتكرار الغسيل.
  11. resuspend الكرية خلية لisotype السيطرة وعينة الأضداد الملون ليتم فرزها في 300 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل propidium الإعلام والتوعيةDIDE / 2٪ FBS / PBS الحل. وضع أنابيب على الجليد حتى الفرز.

4. خلية الفرز

  1. استخدام المواد التالية لإعداد الصك؛ حبات محاذاة مثل جزيئات المتاحة تجاريا الفلورسنت، والفوسفات مخزنة المالحة أساس السائل غمد والخرز انخفاض تأخير، مثل الخرز الفلورسنت Accudrop.
  2. عزل موظفين المدنيين المحليين الإنسان النقاء على خلية فرز أداة مضان تنشيط متعددة المعلمة. إعداد الصك ومحاذاة حسب توصيات الشركة الصانعة. بالإضافة إلى ذلك، تشغيل واحدة ضوابط التعويض وصمة عار مع كل نوع لتوليد مصفوفة التعويض وبالتالي للقضاء على تنزف كبير من خلال انبعاث fluorochromes مثل PE في قناة PE-قبرصي.
    ملاحظة: هناك نسبة أعلى من الخلايا FACS فرز البقاء على قيد الحياة العزلة إذا تم استخدام فوهة 100 ميكرون ويتم فرز الخلايا في بطانة المتوسطة الخلية.

5. خلية ثقافة المشاركة FACS ترتيبجي

  1. بعد الفرز، والخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 5-10 مل من وسائل الإعلام (اعتمادا على القارورة تستخدم البذور الخلية). إذا يتم فرز أقل من 50000 الخلايا، والخلايا المستزرعة في فبرونيكتين المغلفة 25 سم 2 قارورة.
  2. خلاف ذلك ثقافة الخلايا في 75 سم 2 المغلفة فبرونيكتين قارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، والهواء حاضنة مرطب. تغيير وسائل الإعلام بعد 2 أيام.
    يتم تغيير سائل الإعلام خلية كل يوم الثاني بسبب إطالة الوقت بين التغيرات وسائل الإعلام يبدو لصالح بقاء الخلايا غير البطانية: ملاحظة. نحن تحقق من صحة اللمفاوي النمط الظاهري الخلايا البطانية باستخدام كشف المناعى من علامات: PROX-1، VEGFR-3، Podoplanin، CD34 CD31 وعندما كانت الخلايا الانقسام الأول لمزيد من التوسع 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد الهضم الأنسجة الأولي، بعد 24 ساعة في الثقافة العينات غير المجزأ، متميزة مستعمرات الخلايا البطانية ويمكن ملاحظة (الشكل 2A) جنبا إلى جنب مع خلايا تشبه الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء. وبعد الفرز وبعد 24 ساعة في الثقافة الخلية، CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGFR-3 خلايا بوس بوس Podoplanin نعلق وتظهر مورفولوجيا الحصوه نموذجية (الشكل 2B و C). باستخدام طريقة FACS المذكورة أعلاه، ونحن قادرون على تنقية الخلايا يصل إلى 99.8٪ النقاء وتمييزها عن CD34 CD31 العليا بوس VEGFR-3 نقاط البيع Podoplanin نقاط البيع الخلايا البطانية. نتائج ممثلة من النابضة استراتيجية وترد في الشكل 3 الفرز. وقد شهدت حل هذه القضايا عند استخدام المغناطيسية، حبة طريقة العزل. حتى الآن، لدينا passaged هذه الخلايا حتى مرور 13. بعد هذا المقطع، وLM موظفين المدنيين المحليين والقلفة LECنبدأ في الشيخوخة، يرافقه تغيرات شكلية وخفض انقسام الخلايا.

الرقم 2
الشكل 2. القلفة موظفين المدنيين المحليين وLM-LEC. أربع وعشرون ساعة بعد الهضم الأنزيمي، والخلايا التي لم يتم فرزها تحتوي على كل البطانية (السهم) والخلايا غير البطانية (A). بعد CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGFR-3 نقاط البيع Podoplanin نقاط البيع FACS العزلة الخلية، القلفة موظفين المدنيين المحليين (B) وLM-موظفين المدنيين المحليين (C) تخلو من الخلايا غير البطانية والحفاظ على الحصوه التشكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الرقم .

الشكل (3)
الشكل 3. خلية تنشيط الإسفار الفرز استراتيجيات النابضة لفرز الخلايا من الأوعية الدموية والخلايا البطانية اللمفاويةالصورة. (A) هي بوابات الخلايا الحية لأول مرة على CD34 CD31 والتعبير، تليها البطانية اللمفاوية (C) خلايا VEGFR-3 وPODOPLANIN النابضة لنوع الأوعية الدموية (B) و على التوالي. (D) إعادة تحليل فرز CD34 CD31 العليا بوس VEGFR-3 نقاط البيع PODOPLANIN نقاط البيع خلايا العروض> 98٪ الأوعية الدموية النمط الظاهري الخلايا البطانية. (E) خلايا LEC فرز على CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGFR-3 نقاط البيع PODOPLANIN نقاط البيع النمط الظاهري أيضا> 98٪ نقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

موظفين المدنيين المحليين تلعب دورا هاما في الحفاظ على توازن السوائل، والاستجابة المناعية لمستضدات الخارجية وامتصاص ونقل بعض المواد الغذائية. يمكن أن يتأثر توازن LEC من خلال عمليات المرض مثل الالتهابات البكتيرية والورم ورم خبيث، ولكن يمكن أن موظفين المدنيين المحليين أيضا تطوير الطفرات الجسدية التي تؤدي إلى تشكيل الأوعية اللمفاوية اختلال واعتلال كبير للمرضى المتضررين. للحصول على مزيد من فهم اللمفاوي تشوه المسببات من خلال زرع في الجسم الحي والتجريب خارج الحي، واكتشاف خيارات العلاج الجديدة، ونحن أول من طور طريقة عزل LEC على أساس استراتيجية اختيار حبة المغناطيسي باستخدام استراتيجية اختيار CD34 CD31 NEG نقاط البيع 15. ومع ذلك، فإن الثقافات مما أدى في كثير من الأحيان يرد خلايا أخرى من الخلايا البطانية التي كان من الصعب إزالتها. وفي وقت لاحق، وقد تم تطوير طريقة باستخدام FACS لفرز موظفين المدنيين المحليين التي تعبر عن CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGR3 Pالسراج PODOPLANIN نقاط البيع النمط الظاهري. أدى هذا النهج في الثقافات LEC متجانسة نسبيا التي تحتوي على <0.5٪ من الخلايا غير CD34 CD31 منخفضة بوس بوس VEGR3 PODOPLANIN بوس على بعد فرز الاختيار. من الناحية العملية، والاستفادة من فرز الخلايا FACS هو أن الحد من عدم وجود موظفين المدنيين المحليين إلى <0.5٪. موظفين المدنيين المحليين مثقف وLM موظفين المدنيين المحليين لديها مورفولوجيا الحصوه نموذجية وتصبح هرمة حول مرور 13.

في هذه الدراسة التي وصفناها تدفق بروتوكول يستند الخلوي للعزلة وثقافة موظفين المدنيين المحليين التخصيب من الأنسجة العادية وغير العادية على أساس التعبير عنها من مجموعة من علامات سطح الخلية (CD34 CD31 منخفضة بوس بوس VEGR3 PODOPLANIN نقاط البيع). تم فرز الخلايا من الأنسجة الأساسية التالية 5-7 أيام من التوسع في المختبر، وهي الخطوة التي أدت إلى إثراء كبيرا من LEC مقارنة تيرتها في الأنسجة في ذلك الوقت من العزلة. خلال الصورةurgery نحصل على الأنسجة تتراوح بين عدة ميكروغرام لعشرات غراما من وزنه. هذا النسيج يمكن أن تختلف إلى حد كبير في تكوينها فيما يتعلق حجم الأوعية اللمفاوية تشوه الحالية، تندب الأنسجة وجود اللمفاوية تشوه الكيس الجلطة الدموية. وجميع هذه العناصر تؤثر كم عدد الخلايا يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة المريضة. وبالتالي عدد الخلايا بدءا يمكن أن تتراوح من بضعة آلاف من الخلايا لعدة ملايين من الخلايا. وبالمثل، وهذا سيكون له تأثير على تكوين لتعليق الخلية وتبدأ أعداد الخلايا وهذا يعني أن عدد الخلايا التي تم فرزها سوف تختلف أيضا من نموذج واحد إلى آخر.

تردد موظفين المدنيين المحليين في عينات القلفة التي لم يتم فرزها بعد 5-7 أيام في الثقافة يتراوح من 0.52٪ إلى 4.7٪، في حين تتراوح LM موظفين المدنيين المحليين من 0.8٪ إلى 12.43٪. ثقافات LEC تتألف> 99٪ CD34 CD31 منخفضة بوس بوس VEGR3 PODOPLANIN نقاط البيع الخلايا بعد إعادة التحليل والفرز بعد وحافظ على cobbleston نموذجيةالبريد التشكل في الثقافة حتى الشيخوخة في مرور ~ 13 دون فرط من قبل عناصر غير البطانية.

فمن الضروري توسيع الخلايا خارج الجسم الحي بعد الهضم الأنسجة الأولي والفرز لأن العائد من أي خلايا تشوه القلفة أو اللمفاوية منخفض بشكل عام. وهكذا، فإن التوسع مسبق من الخلايا البطانية اللمفاوية ط ن يسمح المختبر جيل ~ الخلايا 2x10 6 البذور اللازمة لغرفة الماوس. وهذا يتطلب مرحلة التوسع في المختبر من 5-7 أيام. بينما نحن نقبل أن زراعة الخلايا قد تحدث تغييرات المظهري في الخلايا الأولية، لقد أظهرنا أن هذه الخلايا المستزرعة تحتفظ قدرتها على تشكيل هياكل شبيهة تشوه اللمفاوية في الماوس طعم أجنبي نموذج 15.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي يحدد درجة من النجاح عندما يكون الترتيب الخلايا FACS. الخطوة الأكثر أهمية هو الوقت المناسب للتعرض الخلايا إلى كولاجينازوdispase خلال العزلة من الأنسجة الأولية كما هو موضح في الخطوة 2.7. لا يتأثر هذا فقط من كمية ونوع الأنسجة موجودة ولكن أيضا من قبل مجموعة من الإنزيمات المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، والأجسام المضادة fluorescently المسمى تستخدم لتوصيف السكان الخلية تحتاج إلى معاير ويفضل أن يكون وحيدة النسيلة. اختبرنا العديد من الحلول المختلفة مفرزة الخلية مثل التربسين / EDTA، EDTA، TrypLE حدد وحل مفرزة الخلية. وجدنا أن EDTA كان لا بد من استخدامها لفترة طويلة من الزمن لفصل الخلايا وكتل الخلايا المتبقية في كثير من الأحيان ما زالت قائمة. في المقابل، تم إنشاء تعليق خلية واحدة خلال 3-5 دقائق من الحضانة في التربسين / EDTA، حل انفصال الخلايا وTrypLE تحديد. لم نعثر على أي اختلاف جوهري في التعبير عن CD31، CD34، Podoplanin وVEGFR-3 بعد العلاج مع أي من الحلول الانزيم. وينبغي أيضا أن يتم عينات الملون واحدة مع كل تجربة الفرز للتأكد من أن أطياف الانبعاث تألقي لا تتداخل ووبالتالي تعطي قراءات غير صحيحة. تشكل هذه الخطوات الحاسمة أيضا الخطوات التي قد يلزم فيها إدخال تعديلات على بروتوكول خلية او حل خلال التدفق الخلوي الفرز.

بالمقارنة مع دينا المنشورة سابقا العزلة حبة المغناطيسي للموظفين المدنيين المحليين 15، والاستفادة من عزل موظفين المدنيين المحليين بواسطة FACS تتضمن ما يلي: العزلة أسرع من الخلايا مع نقاء عالية وتحديد مجموعات فرعية خلية منفصلة والسكان نادرة داخل عينة غير متجانسة. القيود الرئيسية للLEC أساس FACS وLM LEC العزلة تدور حول عدد من الخلايا المتاحة للتحقق من صحة النتائج التالية الخلية الفرز محدودة. بالإضافة إلى ذلك، في حين يتم بذل كل محاولة لتوحيد دينا المقايسات وثيقة انشاء، قد لا تكون هذه المعايير نفسها بالضرورة استنساخه في المختبرات الأخرى. لذلك، قد تحدث بعض التباين في النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، واحدة من القضايا التي تواجه علماء الأحياء اللمفاوية هو عدم وجود علامات خلية معينةالتي من شأنها أن تفرق بين علامات LEC الشعرية الأولي وجمع علامات LEC الشعرية. في هذه المرحلة، ونحن لم تحدد بعد علامات LEC التي من شأنها أن تميز بين موظفين المدنيين المحليين صحية وLM موظفين المدنيين المحليين. منذ الأنسجة اللمفاوية تشوه يحتوي أيضا طبيعي المظهر الأوعية اللمفاوية (الشكل 1A)، سوف تحتوي على الناتج CD34 CD31 منخفضة نقاط البيع VEGR3 بوس بوس PODOPLANIN نسبة من موظفين المدنيين المحليين العادية وكذلك من النمط الظاهري المريضة. الدراسات المستقبلية دراسة LEC وLM LEC التعبير الجيني والبروتينات قد يكون قادرا على توجيهنا نحو علامات LEC LM أكثر تحديدا يمكن أن نميز LM موظفين المدنيين المحليين من موظفين المدنيين المحليين في النسيج نفسه.

في المستقبل، فإننا نتوقع أن استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية وهذه علامات LEC جديدة في محاولة لتحديد مجموعات فرعية نادرة من السكان LEC سواء في القلفة والتشوهات اللمفاوية. هذا من شأنه أن يسمح لنا عزل هؤلاء السكان الخلية ودراسة دورها في تطوير lympنظام الأوعية الدموية hatic والتشوهات اللمفاوية.

عزل موظفين المدنيين المحليين وLM موظفين المدنيين المحليين على أساس CD34 CD31 منخفضة بوس بوس VEGR3 PODOPLANIN نقاط البيع إلى خفض كبير تلوث الخلية غير البطانية. وعلاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا FACS يسمح لنا لفصل موظفين المدنيين المحليين إلى أنواع فرعية على أساس التعبير عن CD31، PODOPLANIN وVEGFR-3 علامات سطح الخلية وفهم هذا في سياق التنمية نسب الخلية. للموظفين المدنيين المحليين المريضة، وهذا يسمح للدراسات خلية محددة من شأنها أن تسلط مزيدا من الضوء على الجينات التي تسبب الأمراض LEC والقدرة كرا للاستجابة لمختلف المحفزات خلية في المختبر ونماذج طعم أجنبي الحيوان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف مؤسسة بيكر و "النساء في زمالة العلوم" مؤسسة الملكي للأطفال بدعم من Zerina Lokmic. أندرو G. Elefanty وإدوارد G. ستانلي هي NHMRC كبار زملاء الأبحاث. وأيد العمل في المختبرات من قبل NHMRC والخلايا الجذعية أستراليا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
  3. Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
  4. Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
  5. Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
  6. Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
  7. Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
  8. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
  9. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
  10. Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
  11. Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
  12. Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
  13. for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
  14. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
  15. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
  16. Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
  17. Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
  18. Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
  19. Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
  20. Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).
  21. Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
  22. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
  23. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
  24. Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
  25. Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
  26. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
  27. Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
  28. Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
  29. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
  30. Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
  31. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
  32. Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).

Tags

الطب، العدد 99،
عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M.,… More

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter