Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.
Abstract
הפרעות במערכת הלימפה כגון בצקת לימפתית העיקרית, מומים הלימפה וגידולי הלימפה הן תנאים נדירים הגורמים לתחלואה משמעותית אך מעט מאוד ידוע על הביולוגיה שלהם. בידוד תאים טהורים ביותר אדם הלימפה אנדותל (LECs) מהרקמה חולה ובריאה היה להקל על מחקרים של האנדותל הלימפה ברמות גנטיות, מולקולריות ותאיות. זה צפוי כי חקירות אלה עשויות לחשוף מטרות לטיפולים חדשים שעשויות לשנות את הניהול הקליני של תנאים אלה. פרוטוקול המתאר את בידודו של אדם עורלת LECs ותאי הלימפה מום הלימפה אנדותל (LM LECs) מוצג. כדי להשיג רקמת השעיה תא בודדת הייתה טחון וטופלה באמצעות אנזימי dispase השני וcollagenase השני. ההשעיה התא בודדת וכתוצאה מכך הייתה אז שכותרתו עם נוגדנים לאשכול של בידול סמנים (CD) CD34, CD31, כלי דם האנדותל Growth Factor-3 (VEGFR-3) וPODOPLANIN. Staiתאי קיימא נד מוינו על סדרן תא מופעל fluorescently (FACS) כדי להפריד את האוכלוסייה ממוצע PODOPLANIN ממוצע LM הבקר CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 מאנדותל האחר ותאי האנדותל אינו. LECs LM מסודרים היו בתרבית והרחיב על צלוחיות מצופים פיברונקטין לשימוש ניסיוני נוסף.
Introduction
תפקידה העיקרי של מערכת הלימפה וכלי הדם הוא לקלוט הלימפה, נוזל ביניים עודף המכיל שומנים, חלבונים ומרכיבים תאיים, ולנהל אותו למערכת ורידי דם. רשת של נימי הלימפה מכוונת לימפה לבלוטות הלימפה שבו הוא הוקרן לנוכחות של אנטיגנים זרים, תהליך חשוב במעקב ופריסה של תאי דם לבנים לנטרל אנטיגנים זרים חיסוניים.
מערכת הלימפה חד כיוונית מתחילה ברקמות עם נימי הלימפה הראשוניות, מבנה ייחודי עם שכבה אחת רציפה של תאי האנדותל שטוח מוקף חומה דקות עם צמתים תא מיוחדים המאפשרים כניסה לימפה 1,2. נימים אלה מחוברות מטריצת רקמת חיבור השכנה באמצעות עיגון חוטים כדי למנוע קריסת ספינה בנוכחות של לחץ מוגבר ביניים 3. נימי הלימפה הראשוניות הריקות לאיסוף נימי הלימפהשלהתגבש לגדולים יותר כלי או ורידי הלימפה. בהשוואה ראשוני כלי נימי הלימפה, איסוף יש כלי הלימפה דפנות כולים עבים, שסתומים הלימפה לזווג ונארזים על ידי קרום מרתף רציף שבו כמה תאי שריר חלק מוטבעים 4. פתיחה מתואמת וסגירת שסתומי הלימפה והתכווצות של תאי שריר חלק מאפשרים זרימת הלימפה 3. בבני אדם, ורידי הלימפה מאזורים שונים בגוף מצטרפים לגזעי הלימפה המתמזגים ליצירת שתי צינוריות הלימפה: צינור החזה וצינור הלימפה תקין. צינור החזה מרוקן הלימפה מהצד השמאלי של הגוף ומהצד הימני מתחת לחזה בזמן הלימפה מתנקזת צינור הלימפה תקין מהזרוע הימנית וצד ימין של הראש, צוואר, בית החזה ו. שני צינורות הלימפה לנהל לתוך ורידי subclavian בצוואר 5.
הפרעות של מערכת הלימפה מקובצים באופן כללי לרכשND מולדת (טבלה 1). דוגמאות לתנאים נרכשים הנן דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד ובצקת לימפתית משנית. דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד היא דלקת של כלי הלימפה עקב זיהום חיידקים. Lymphatics המושפעת להתרחב ולמלא עם תאי polymorphonuclear exudate מכיל. בעור, lymphatics אלה נראית כפסים אדומים, כואבים תת עורי לעתים קרובות מלווים בהגדלה של קשורים צומת הניקוז לימפה (בְּלוּטַת לְשַׁד) 6. בצקת לימפתית משנית נובעת כתוצאה מניזק או שיבוש לחסימת כלי שיט או בלוטה לימפה הלימפה. זה מוביל לנפיחות מתקדמת כרונית עקב הצטברות של דיסטלי לימפה לנזק או שיבוש הליכי. במדינות מפותחות, בצקת לימפתית משנית קשורה לרוב עם ממאירות בי גידולי גרורות להכשיל כלי הלימפה או בלוטות הלימפה אזוריות, או כתוצאה מטיפול אנטי-סרטני לאחר ההסרה כירורגית של בלוטות לימפה, סיסטיק הודעה הקרנה-וthrom פוסט-דלקתיbosis וצלקות 7. בחלקים אחרים של העולם, בצקת לימפתית משנית עשויה להיות משנית לחסימת הלימפה הנגרמת על ידי תולעים טפילים כגון bancrofti Wuchereria 6.
| הפרעות של מערכת כלי דם הלימפה | |||
| רכש | מולדים | ||
| בְּלוּטַת לְשַׁד בצקת לימפתית משנית | עיקרי בצקת לימפתית 10 | הלימפה מומים סדירים 13 | הלימפה מומים הקשורים תסמונות 13 |
| למשל Milroy תסמונת Meige תסמונת | פשוט: מומים הלימפה | למשל Klippel-Tranaunay תסמונת הפארקים וובר תסמונת סטרג'-וובר תסמונת | |
| בשילוב: מומים נימים-הלימפה מום נימים-הלימפה-ורידים מום נימים-הלימפה-arteriovenous מום ורידים-arteriovenous נימים-הלימפה | |||
1. השולחן של ההפרעות של מערכת כלי דם הלימפה.
הפרעות מולדות של מערכת הלימפה כוללות בצקת לימפתית ראשונית (אידיופטית) חשבה שנגרם על ידי מוטציות גנטיות, lymphangiectasia וחריגות של 8,9 מערכת הלימפה. בצקת לימפתית ראשונית יכולה להיות לא סדירה שנגרמה ככל הנראה על ידי מוטציות דה נובו, או בירושה. הפרעות הלימפה יכולות גם להיות מבודדות או מהוות חלק מתסמונת כללית יותר 10. באוכלוסיית הילדים, 97% מהלימפההבצקת היא לא סדירה עם ליקויים במבנה כלי הלימפה הפוגעים בניקוז הלימפה אזורית 11. המחלה Milroy היא דוגמא לבצקת לימפתית העיקרית הנגרמת על ידי מוטציה בגן ניכר בלידה או מייד לאחר 12 VEGFR-3. למרות מצב משפחתי בעיקר, המחלה Milroy יכולה גם להיות מזוהה בתינוקות ללא היסטוריה של מחלות Milroy 32 משפחה. החומרה של כל בצקת לימפתית תלויה בכמות הייצור לימפה והיכולת להעביר לימפה בחזרה למחזור ורידי 6.
בהתבסס על מצגת קלינית ובהתפשטות תאי אנדותל באתר, מומים של מערכת הלימפה מסווגות כגידולי הלימפה או מומים הלימפה 13. Kaposiform lymphangiomatosis היא דוגמא לגידול הבקר 14. מומים הלימפה הם חשבו להתעורר במהלך התפתחות עוברית ולגדול באופן יחסי לילד 15,16. רק לעתים רחוקות הם לסגת אבל יכולים מאהלרn ללא תסמינים עד טראומה או זיהום משקעים צמיחה מהירה שמובילה לסיבוכים קליניים. המבנה המסודר של רשת והולכה של הלימפה הלימפה מרקמות למחזור ורידים שתואר לעיל הוא מוטרד במומי הלימפה אשר מורכב של אוספים מקומיים של מבני פיברוזיס חריגים מלאים בנוזל הלימפה. אמנם אין עדות קלינית או ניסויים שכלי פיברוזיס אלה מחוברים לזרימת הלימפה או שהם מכילים שסתומים הלימפה פונקציונליים, זהות הלימפה שלהם אושר על ידי ביטוי של מגוון רחב של סמני תא הלימפה כגון PODOPLANIN, CD31, כלי הלימפה האנדותל קולט 1 (LYVE-1), חלבון homeobox פרוספרו 1 (PROX-1) וVEGFR-3 15,17,18. מבני פיברוזיס אלה יכולים להיות קטנים (microcystic) או גדול (macrocystic), אבל רוב המומים הלימפה מכילים הן microcystic ורכיבי macrocystic (איור 1) 16. לאחר ניתוח, Injection sclerotherapy ו / או גלי רדיו אבלציה המומים הלימפה לעתים קרובות מתרחשת שוב.
איור 1. מורפולוגיה של כלי הלימפה אנושי ומומי הלימפה. הלימפה אנושית רגילה () וכלי הלימפה מום (B ו- C) שכותרתו עם נוגדן לPODOPLANIN (תווית בצבע חום, חץ). כלי מום הלימפה אנושיים מאופיינים בהתרחבות ניכרת והבדלים ניכרים בגודל לומן. מבני פיברוזיס החריגים המקומיים אלה יכולים להיות קטן (ב) או גדול (macrocystic, #) (ג) (microcystic, *). רוב המומים הלימפה מכילים את שני מרכיבי microcystic וmacrocystic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות. </ P>
חוקרים אחדים הציעו שמומי הלימפה מייצגים הפרעה התפתחותית של כלי דם הלימפה שבאין לי LECs פוטנציאל צמיחה נורמלי אבל במקום לא הצליח להתחבר לזרימה הרגילה 19. עם זאת, מצאנו כי LECs LM להתרבות מהר יותר ועמיד יותר לאפופטוזיס מאשר עורלת 15 LECs מצביע על כך שיש פגם עיקרי בLECs LM. כאשר LECs LM מושתל במודל xenograft עכבר, הם יוצרים מבנים דמויים מומים הלימפה 15. זה תומך בהשערה כי מומים הלימפה עלולים להיגרם על ידי אחד או יותר מוטציות סומטיות שהמקורה בLECs LM במהלך התפתחות עוברית. ואכן, הדיווחים אחרונים זיהו מוטציה אחת כזו במקטע קטליטי p110α של phosphoinositide-3-קינאז גן (PIK3CA) 20.
בהתחשב בהתקדמות טכנולוגית רצפי DNA, מוטציות רלוונטיות גולד להיות מזוהה בקלות רבה יותר בLECs LM המבודד, המנחה את המחקרים עתידיים של תנאים אלה. הבידוד של LECs קיימא יאפשר השוואות בין LECs נורמלי והרגיל במבחנים כגון הגירה, שגשוג, יכולת להרכיב צינור והישרדות בתגובה לזמינות חומרי מזון מופחת או סוכנים פרו-אפופטוטיים 15. LECs המבודד יאפשר לנו לבצע עוד ביטוי גני תא ספציפי ומחקרי proteomic, להתוות אוכלוסיות הבקר חדשות ולגלות סוכנים תרופתיים רומן מתאים לניהול קליני של מומים הלימפה.
יש לנו שפורסם בעבר בשיטת בידוד הבקר המבוססת על הפרדה חרוז מגנטית של LECs מעורלה בילוד ומומי הלימפה 15. דיווחנו אסטרטגיה של הפרדת LECs הבריא וחולה מתאי האנדותל של כלי דם המבוססים על היעדר ביטוי CD34, ואחרי חשיפת חלק תא CD34 נג לסלקציה חיובית לCD31.עם זאת, שיטה זו הקשתה על ידי הנוכחות של תאי האנדותל אינו שייר. זה לא היה תלוי בהסרת עור לפני עיכול רקמת חיבור שלאחר מכן. מזהמים אלה בדרך כלל התרבו במהירות רבה יותר ובכך בסופו overgrew תרביות תאי אנדותל למרות ניסיונות שלאחר מכן לחזור על בידוד הבקר. ואכן, זיהום ראשוני של תאי האנדותל אינו נמוכים כמו 2% עד 5% היה מספיק כדי להכניע את אוכלוסיית הבקר 15. זה גרם לנו לבחון שיטת מיון תא מופעלת fluorescently כאופציה לשיפור תשואת תא הבקר וטהרה. בנוסף, השתמשנו רב פרמטר מיון כדי לשפר את הספציפיות של אוכלוסיות הבקר, הוספת VEGFR-3 וPODOPLANIN לסמני הבחירה לזהות CD34 VEGFR-3 LECs נמוך CD31 ממוצע ממוצע ממוצע PODOPLANIN.
הרציונל לבחירת סמנים אלה היה מבוסס על הדיווחים כי בעוד לסה"נ LECs וכלי דם דם האנדותלLLS יש סמנים פני תא משותף רבים כגון CD31, LECs להראות וריאציה פנוטיפי בביטוים של CD34, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמן תא שטח בהשוואה לתאי האנדותל של כלי דם דם 21-23. CD31 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני 130 kDa הידוע גם במולקולת הידבקות טסיות דם תא האנדותל 1 (PECAM-1). זה נחשב סמן תא פאן-אנדותל שכן הוא בא לידי הביטוי בכל הסוגים של כלי דם והלימפה 21,24,25. CD34 הוא 110-kDa גליקופרוטאין הטרנסממברני נוכחי על אבות היווצרות הדם ביותר ותאי גזע, תאי האנדותל של כלי דם וכלי הלימפה כמה 26.
VEGFR-3, קולט לצמיחה של אנדותל כלי דם גורמי C ו- D, הוא בתחילה קיימים בורידים המתפתחים בעובר העכבר, אך בעקבות מפרט הלימפה מוסדר על ידי שעתוק גורמי HMG-תיבה הקשורים ל- ¥ * $ (SOX) -18, hicken ג o valbumin u pstreaשחקן עמ 'מ' ו ranscription לא romoter 2 (COUPTF-השני) וPROX-1, VEGFR-3 ביטוי ורידים הולך לאיבוד והוא הופך להיות מוגבל לLECs העוברי 25,27. PODOPLANIN, קרום kDa 38 mucoprotein, יצוין ראשון בכלי הלימפה בכ עוברי יום 11 (~ E11.0) של התפתחות העוברית של עכבר 28 ותוך שהוא מתבטא בחריפות על ידי כלי הלימפה כלי דם, PODOPLANIN ביטוי על ידי האנדותל הלימפה macrocystic במומי הלימפה משתנה יותר 15. Cytometry זרימת ניסויים מראים כי לפחות חלק מתאי אנדותל CD34 הגבוה CD31 ממוצע להביע את סמן הלימפה PODOPLANIN 29. למרות הערכה שיטתית של מכתים LYVE-1 וPODOPLANIN במומי הלימפה אדם הראתה כי הן יעילות במכתימים האנדותל מום הלימפה 30, ברקמות נורמליות, LYVE-1 נמסר להיות מאוד נוכח בהלימפה הראשוניתהאנדותל נימים אבל מופחת ואפילו נעדרו בהאנדותל הלימפה איסוף 31. כמו המטרה שלנו היא לבודד את שני תאי האנדותל הלימפה הראשוניים ואיסוף שבחרנו שלא להשתמש LYVE-1 כחלק מהאסטרטגיה שלנו בחירת תא. לבסוף, ההחלטה להעסיק סמנים אלה הייתה מבוססת גם על הזמינות של נוגדנים המשמשות diagnostically לתיוג כלי הלימפה להדמיה מיקרוסקופית, תכונה שתאפשר קשר בין cytometry זרימה ומחקרי immunofluorescent.
מאמר זה יתאר את שיטת עיכול רקמה, מכתים תא והגדרות FACS נדרשת לבידוד מוצלח של CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 LECs ממוצע PODOPLANIN ממוצע, כמו גם תאי האנדותל CD34 גבוהים CD31 ממוצע VEGFR-3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע מעורלה ומום הלימפה רקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: אישור אתי לאיסוף רקמות מום ועורלת הלימפה התקבלה מועדות האתיקה מחקר האדם בבית החולים מלכותי לילדים, מלבורן, אוסטרליה. הסכמה חתומה התקבלה מההורים של החולים לפני הניתוח. דגימות רקמה נאספו מחולים שאובחנו עם LMS עובר ניתוחים כחלק מהניהול הקליני שלהם וחולים שעבר ברית מילה בחירה. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של הבריאות הלאומית ומועצה למחקר רפואי, אוסטרליה.
1. הכנת תרחיף תא מהעורלה והלימפה מומים רקמות
- מאגרים ומדיה הכנה.
- הכן תקשורת תא האנדותל מלאה באמצעות ערכת Bullet זמינה מסחרי EGM-2 MV ידי התחממות EGM-2 תקשורת ועדינות הפשרת רכיבי הערכה 37 ° C אמבט מים. בכיתה השנייה קבינט בטיחות ביולוגית, סביבה נקיה מחיידקיםלהוסיף כל רכיב לEGM-2 התקשורת. לאחר שכל הרכיבים נוספים לתקשורת, מתייחס לזה כאמצעי תקשורת "תקשורת תא האנדותל מלאה '. השתמש פיפטה 50 מיליליטר סטרילי לערבב את התוכן לפני השימוש.
הערה: כל הצעדים הנוגעים לתרבות תא מבוצעים בקבינט Biohazard בכיתה השני. כל הפתרונות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות יצרנים והם חיממו לטמפרטורת חדר לפני השימוש. התקשורת המלאה אנדותל התא, מאגרי תרבית תאים ופתרונות אנזים הם חיממו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני השימוש. - להשלים תקשורת תא אנדותל להשלים עם 50 VEGF-C ng / ml. Aliquot תקשורת תא האנדותל בתוספת לצינורות 50 מיליליטר וחנות סטרילי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. התקשורת היא יציבה לפחות 4 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס.
- הכן סידן ופוספט שנאגרו מלוח חופשי מגנזיום (PBS) על ידי המסת 8.752 גרם NaCl, 1.416 גרם Na 2 HPO 4 .2H 2 O ו.395 גרם KH 2 PO 4 ב1,000 מיליליטר של מים. התאם ל- pH 7.4. סנן לעקר PBS באמצעות 0.22 מיקרומטר לסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש להוסיף פתרון אנטיביוטי / antimycotic (ששמש בשעה 1: 100).
- כדי להכין פיברונקטין אדם, לפזר 1 מ"ג של פיברונקטין ב 10 מיליליטר של מים סטריליים. חנות מחדש פתרון ב100 aliquots μl ב -20 ° C. ביום שימוש להוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילי של aliquot פיברונקטין 100 μl (לתת ריכוז עבודה סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר).
- לתקשורת האנזים, להכין תמיסה המכילה 0.04% Dispase השני, 0.25% Collagenase השני ו0.01% DNase אני בPBS סטרילי. ראשית, לשקול dispase וcollagenase, מקום בצינור 50 מיליליטר סטרילי, להוסיף הנפח הנדרש של PBS ודגירה למשך 30 דקות עם רעד על 37 מעלות צלזיוס לפזר. ברגע שהתפרק, סנן לעקר (0.22 מיקרומטר מסנן) פתרון dispase / collagenase במכסת מנוע בטיחות ביולוגית. סביבה נקיה מחיידקים להוסיף I. חנות DNase הפתרון האנזימטית על 37 מעלות צלזיוס עדלהשתמש.
הערה: אני DNase הוא מגיב כיתה מסחרית תרבית תאים זמינה כאבקת lyophilized סטרילי.
- הכן תקשורת תא האנדותל מלאה באמצעות ערכת Bullet זמינה מסחרי EGM-2 MV ידי התחממות EGM-2 תקשורת ועדינות הפשרת רכיבי הערכה 37 ° C אמבט מים. בכיתה השנייה קבינט בטיחות ביולוגית, סביבה נקיה מחיידקיםלהוסיף כל רכיב לEGM-2 התקשורת. לאחר שכל הרכיבים נוספים לתקשורת, מתייחס לזה כאמצעי תקשורת "תקשורת תא האנדותל מלאה '. השתמש פיפטה 50 מיליליטר סטרילי לערבב את התוכן לפני השימוש.
2. הכנת תרחיף תא ממומי עורלה והלימפה
- שוקל שפופרת 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של / 2% פתרון antimycotic אנטיביוטיקה DMEM. צינור זה ישמש לאיסוף רקמות.
- בעקבות הסרה כירורגית של מום הלימפה ורקמות עורלה, סביבה נקיה מחיידקים להוסיף דגימת רקמה לצינור וההעברה על קרח למעבדה תרבית תאים.
- לשקול את הצינור המכיל את הרקמה ולחשב את משקל רקמה. השתמש במשקל זה כדי לחשב את הנפח של הפתרון האנזימטית הדרוש כדי לעכל את הרקמה.
- בארון בטיחות ביולוגית Class II, להשתמש במלקחיים סטרילי להעביר את הרקמה ותקשורת לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ"מ. השתמש במספרי סטרילי כדי לרכך את הרקמה ל~ 1 מ"מ 3 חתיכות דק.
- רקמה טחונות העברה מעורבבת עם i תקשורתn כדי שפופרת 50 מיליליטר המכילה תוספת של 10 מיליליטר של תמיסה סטרילית DMEM / 2% לאנטיביוטיקה antimycotic. מערבבים על ידי היפוך מחדש להשעות את הרקמה. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant. בהתבסס על משקל רקמה, להוסיף 1 מיליליטר של collagenase המחומם מראש (37 ° C) II / פתרון עיכול DNase I / II Dispase לרקמה טחון 100 מ"ג. בדרך כלל, להשתמש 10 מיליליטר של תמיסת אנזים לכ 1 גרם של רקמה טחונות.
- דגירה הרקמות בחממה 37 ° C דקות 20-90 עם קבועים רועד ב 200 סל"ד. בתום תקופה זו, להבטיח כי כמעט כל הרקמה מתעכלת לרסיסים בסדר.
הערה: חשיפה של התאים לcollagenase וdispase בעת הבידוד מהישרדות תא השפעות רקמות העיקריות. מצאנו באופן אמפירי שרוב דגימות עורלה בילוד בצורה אופטימלית דורשות 20-30 דקות של עיכול, ואילו דגימות מום הלימפה fibrotic עשויות לדרוש 60-90 דקות של עיכול. תשואת הבקר LMשל מושפעים מכמות סיסטיק הנוכחי, רקמה סיבית יותר מניב פחות תאים, אולי בשל השפעות מזיקות של חשיפה ממושכת לcollagenase השני וdispase השנייה. - בעקבות עיכול, להעביר את הצינור לארון הבטיחות הביולוגית ולהעביר את פתרון הרקמה מתעכל דרך מסננת 70 מיקרומטר להציב לתוך שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. שימוש בבוכנת מזרק 3 מיליליטר עם בוכנת גומי, לטחון את הרקמה שנותרה עד שרק עקבות קטנות של מטריקס הם נצפו.
- שטוף את מסננת התא עם נפח שווה ערך בינוני תא האנדותל להיקף מתנער בינוני אנזים להתאושש תאים נדבקו למסננת וכדי להשבית את האנזימים. לדוגמא, עבור 2 מיליליטר של חוצן בינוני אנזים לעכל את הרקמה הטחון, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום תא האנדותל כדי להשבית את האנזימים.
- צנטריפוגה פתרון התא XG ב 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. > R דואר להשעות את התאים ב 10 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 3005 דקות, להסיר את supernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא פעמיים. > Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. ספירת תאים באמצעות כחול אז זרע trypan 2 x 10> 6 תאים ב150 סנטימטר> 2 בקבוק מראש מצופה פיברונקטין בנפח סופי של 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. תרבות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO> 2 בחממת אוויר humidified.>
הערה: צפוי כי 75% -90% מתאי בעלי הגרעין לשרוד עיכול רקמה כפי שהוערכו על ידי הרחקת trypan הכחולה. ספירת התאים הראשונית משקפת תאים כל גרעין בהשעית התא (כלומר קרטינוציטים, לויקוציטים, מקרופאגים, תאי רקמת חיבור ותאי כלי דם). ספירת התאים ב5-7 ימים משקפת תאים שצורפו, שרדו והתרבו במהלך תרבית תאים. ציפוי צלוחיות תרבית רקמה עם פיברונקטין גם משפר את הבקר הבא והישרדות LM הבקר. - לאחר דגירה הלילה, לשטוף תאים משם מאוגד בשלושה שוטף עם P/ 1% פתרון BS אנטיביוטיקה antimycotic ולהוסיף בינוני תא האנדותל טרי. לבצע שלושה שוטף כדי להסיר ביעילות תאים מאוגד ותאי דם אדומים הנמצאים בבקבוק. שינוי תקשורת בכל יום שני. תאים יהיו ~ 80% ומחוברות לאחר 5-7 ימים.
3. נוגדן צביעת תאים למשטח סמני תא האנדותל הלימפה לcytometry הזרימה
- לאחר שהתאים הגיעו מפגש 80%, בינוני לשאוב ותאי שטיפה עם PBS.
- ניתוק תאים חסיד ידי דוגרים תאים עם 7 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא כגון Accutase לבקבוק 150 סנטימטר 2 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- קציר תאים מנותקים, להשבית את פתרון ניתוק תא על ידי הוספת 3 כרכים של מדיום תא האנדותל ולהעביר את ההשעיה תא צינור סטרילי חדש.
- צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 5 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר את יםupernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא. מחדש להשעות את התאים ב 5 מיליליטר של PBS.
- לספור את מספר תאי קיימא. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 90 μl של 0.4% trypan כחולים. ההעברה 10 μl של השעיה זו לhemocytometer לספירה.
הערה: תשואת התא הסופית תהיה תלויה בגודל מדגם מעובד. התשואה הרגילה התא לטווחים של 150 סנטימטר 2 בקבוק מ7 x 10 5-1.2 x 10 6 תאי קיימא. - הכן את פתרונות נוגדן למכתים תא.
הערה: דילולים הבאים טיטרציה למכתימים 1 x 10 6 בצביעת נפח של 100 μl.- עכבר לדלל PE מצומדות VEGFR-3 אדם אנטי (01:50); CD34 PE-Cy7 העכבר מצומדות אנטי האנושי מצומדות (1: 200); CD31 APC-מצומדות עכבר אנטי אנושי (1: 100) וAlexa אדם אנטי עכברוש 488 מצומדות- PODOPLANIN (1: 200) בהיקף כולל של 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה רקמה. בעקבות הכנתפתרון נוגדן, לשמור על קרח עד לשימוש. כמו כן להכין תערובת נוגדני שליטת אלוטיפ מדוללת כדי להקל על הגדרה של זרימת cytometry שערים.
- כדי להפחית ספציפי מחייב של הנוגדנים, תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות, להסיר supernatant אז להשעות את התאים 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה להיות מוכתם. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר supernatant אז מחדש להשעות תאים בקוקטייל הנוגדנים מצומדות. גם להכתים aliquot קטן יותר של תאים (1 x 10 5) בתערובת נוגדני שליטת אלוטיפ 100 μl. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות.
- כדי להסיר את הנוגדן מאוגד, להוסיף 2 מיליליטר של 2% FBS / פתרון PBS ו צנטריפוגות התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וחזור לשטוף.
- Resuspend התא גלולה לשליטה אלוטיפ ומדגם הנוגדן מוכתם להיות מסודר ב300 μl של 0.5 מ"ג / מיליליטר propidium iodide / 2% FBS פתרון / PBS. מניחים צינורות על קרח עד מיון.
4. מיון תא
- השתמש בחומרים הבאים כדי להגדיר את המכשיר; חרוזים יישור כגון חלקיקים זמינים מסחרי ניאון, נוזל נדן מלוח מבוסס פוספט וחרוזים עיכוב ירידה, כגון חרוזי ניאון Accudrop.
- לבודד את LECs האנושי המטוהר במכשיר סלולארי מיון הקרינה המופעל רב פרמטר. להגדיר את המכשיר וליישר לפי המלצות יצרן. בנוסף, להפעיל פקדי פיצוי כתם יחידים עם כל סוג כדי ליצור את מטריצת פיצויים ובכך לחסל את הדימום משמעותי בפליטה של fluorochromes כגון PE לערוץ PE-סי.
הערה: שיעור גבוה יותר של FACS מיון תאים לשרוד הבידוד אם נחיר 100 מיקרומטר משמש ותאים מסודרים לתוך מדיום תא האנדותל.
5. תא מיין תרבות ההודעה FACSING
- בעקבות, תאי צנטריפוגה מיון ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וresuspend התאים 5-10 מיליליטר של תקשורת (תלוי בבקבוק המשמש לזרע התא). אם פחות מ -50,000 תאים מסודרים, התאים בתרבית פיברונקטין מצופה 25 סנטימטר 2 בקבוק.
- אחרת תרבות התאים בבקבוק 2 מצופה פיברונקטין 75 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% humidified אוויר CO 2,. שינוי תקשורת לאחר 2 ימים.
הערה: תקשורת נייד משתנה בכל יום שני כי הארכת הזמן בין שינויי תקשורת מופיעה להעדיף הישרדות של התאים הלא-אנדותל. אנו לאמת את הפנוטיפ תא האנדותל הלימפה באמצעות זיהוי immunohistochemical של סמנים: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 וCD31 כאשר התאים פיצול ראשון להרחבה נוספת 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות עיכול רקמה ראשוני, לאחר 24 שעות בתרבות של דגימות unfractionated, ניתן לצפות מושבות תאי אנדותל שונות (איור 2 א) יחד עם תאים כמו פיברובלסטים ותאי שריר חלק. בעקבות מיון ולאחר 24 שעות בתרבית תאים, CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 התאים ממוצע Podoplanin ממוצע לצרף ולהראות מורפולוגיה טיפוסית מרוצפת (איור 2 ו- C). שימוש בשיטה שתוארה לעיל FACS, אנו מסוגלים לטהר תאים עד טוהר 99.8% ולהבדיל ביניהם לבין CD34 הגבוה CD31 ממוצע VEGFR-3 תאי האנדותל ממוצע Podoplanin ממוצע. תוצאות נציג של gating אסטרטגיה והמיון מוצגים באיור 3. זה פתר את הבעיות חוו בעת השימוש בשיטת בידוד מגנטי חרוז. עד כה, יש לנו passaged תאים אלה עד מעבר 13. לאחר הקטע הזה, LECs LM ועורלת הבקרנתחיל להזדקנות, מלווה בשינויים מורפולוגיים וחלוקת תאים מופחתת.
איור 2. העורלה LECs וLM-הבקר. עשרים וארבע שעות לאחר עיכול אנזימטי, תאים לא ממוינים מכילים הן אנדותל (חץ) ותאים שאינם האנדותל (). בעקבות בידוד תא CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 ממוצע Podoplanin ממוצע FACS, עורלת LECs (ב) ו- LM-LECs (ג) הם נטולי תאי האנדותל אינו ולשמור על מורפולוגיה מרוצפת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות .
3. תא הקרינה המופעל איור מיון אסטרטגיות gating למיון תא של כלי דם ותא האנדותל הלימפהים. (א) בתאים חיים הם מגודרת ראשון על CD34 וביטוי CD31, ואחריו VEGFR-3 וgating PODOPLANIN לסוג כלי דם (B) ותאי האנדותל הלימפה (C) בהתאמה. (ד) מחדש ניתוח של CD34 הגבוה CD31 מסודרים ממוצע VEGFR-3 מופעי תאים ממוצע PODOPLANIN ממוצע> 98% פנוטיפ תא אנדותל כלי דם. תאי הבקר (E) מסודרים על CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 פנוטיפ ממוצע PODOPLANIN ממוצע הם גם> 98% טהורים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LECs לשחק תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס נוזל, תגובה חיסונית לאנטיגנים זרים וקליטה והובלה של כמה חומרים מזינים. הומאוסטזיס הבקר יכול להיות מושפע מתהליכי מחלה כגון זיהומים חיידקיים וגרורות סרטניים, אך LECs יכול גם לפתח מוטציות סומטיות שתגרומנה להיווצרותם של כלי הלימפה לא מתפקדים ותחלואה משמעותית עבור חולים מושפעים. כדי להשיג יותר הבנה של אטיולוגיה מום הלימפה דרך השתלת in vivo וניסויים vivo לשעבר, ולגלות אפשרויות טיפול חדשות, שפותחנו לראשונה שיטת בידוד הבקר מבוסס על אסטרטגית בחירת חרוז מגנטי באמצעות אסטרטגית בחירת CD34 נג CD31 ממוצע 15. עם זאת, וכתוצאה מכך לעתים קרובות התרבויות הכילו תאים אחרים מאשר תאי האנדותל שהיו קשים להסיר. בהמשך לכך, השיטה הייתה מעודנת באמצעות FACS למיין LECs המבטא CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 Pמערכת ההפעלה פנוטיפ PODOPLANIN ממוצע. גישה זו הביאה לתרבויות הבקר הומוגני יחסית המכילות <0.5% של תאים שאינם נמוך CD34 CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע בצק פוסט-מיון. במונחים מעשיים, את היתרון של מיון תאים על ידי FACS הוא כי הפחתת נוכחות LECs אי ל< 0.5%. יש לי LECs התרבותי וLECs LM מורפולוגיה מרוצפת טיפוסית ולהיות מזדקנים סביב מעבר 13.
במחקר זה שתארנו פרוטוקול מבוסס cytometry זרימה לבידוד והתרבות של LECs המועשר מרקמות נורמליות ולא נורמליות מבוססות על הביטוי שלהם חבילה של סמנים פני התא (CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN POS). תאים מוינו מרקמות עיקריות הבא 5-7 ימים של התרחבות במבחנה, צעד שהביא להעשרה משמעותית של הבקר בהשוואה לתדירותם ברקמות בזמן הבידוד. במהלך שלurgery נקבל רקמות שנעו בין כמה מיקרוגרם לעשרות גרם במשקל. רקמה זו יכולה להשתנות במידה רבה בהרכבו ביחס לנפח של כלי הלימפה מום נוכחי, צלקות ונוכחות של ציסטה thrombi מום הלימפה ברקמות. כל המרכיבים הללו ישפיעו כמה תאים יכולים להיות מבודדים מהרקמה החולה. מכאן את המספר הסלולרי מתחיל יכול לנוע בין כמה אלף תאים לכמה מיליוני תאים. כמו כן, זה ישפיע על הרכב של ההשעיה התא ומתחיל מספרים סלולריים כלומר את מספר התאים הממוינים גם שונה ממדגם אחד למשנהו.
תדירות LECs בדגימות עורלה לא ממוינות הבא 5-7 ימים בתרבות נעה בין 0.52% ל -4.7%, ואילו LECs LM נע בין 0.8% ל 12.43%. תרבויות הבקר מורכבות> 99% CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע תאים לאחר cobbleston טיפוסי מחדש ניתוח שלאחר המיון ומתוחזקמורפולוגיה דואר בתרבות עד הזדקנות במעבר ~ 13 ללא יתר על ידי גורמים לא-אנדותל.
יש צורך להרחיב את תאי vivo לשעבר הבאה עיכול רקמה ראשוני ומיון בגלל התשואה של שני תאי מום עורלה או הלימפה היא בדרך כלל נמוכה. כך, ההתרחבות המוקדמת של תאי האנדותל הלימפה אני n מבחנה מאפשרת את הדור של ~ 2x10 6 התאים נחוצים לזרע קאמרי עכבר. זה דורש שלב התרחבות במבחנה של 5-7 ימים. בזמן שאנחנו קיבלנו שתרבית תאים עשויה לגרום לשינויים פנוטיפי בתאים הראשוניים, שהראינו כי תאים בתרבית אלה לשמור על היכולת שלהם כדי ליצור מבנים כמו מום-הלימפה במודל xenograft עכבר 15.
ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול הקובעים את מידת הצלחה של עת מיון תאים על ידי FACS. השלב הקריטי ביותר הוא זמן חשיפה של התאים לCollagenaseוdispase בבידוד מהרקמות העיקריות כמתואר בשלב 2.7. זה לא השפיע רק על ידי הכמות והסוג של רקמת הווה אלא גם על ידי הקבוצה של אנזימים המשמשים. בנוסף, נוגדנים שכותרתו fluorescently משמשים כדי לאפיין את אוכלוסיות תאים צריכים להיות טיטרציה ורצוי חד שבטי. בדקנו כמה פתרונות ניתוק תאים שונים כגון טריפסין / EDTA, EDTA, TrypLE בחרו ופתרון ניתוק תא. מצאנו כי EDTA היה לשמש לתקופה ממושכת של זמן לנתק את התאים וגושי תא שייר לעתים קרובות נשארו. לעומת זאת, השעיות תא בודדות נוצרו בתוך 3-5 דקות של דגירה בטריפסין / EDTA, פתרון ניתוק התא וTrypLE בחר. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בביטוי של CD31, CD34, Podoplanin וVEGFR-3 בעקבות טיפול בכל אחד מפתרונות האנזים. צריכים להיעשות גם דגימות צבעוניות יחידה עם כל ניסוי מיון על מנת להבטיח כי ספקטרום פליטת fluorochrome אינו חופפות ולכן נותן קריאה שגויה. שלבים קריטיים אלה מהווים גם צעדים שבו שינויים בפרוטוקול התא ייתכן שיהיו צורך או איתור תקלות במהלך cytometry זרימת מיון.
בהשוואה לבידוד חרוז המגנטי של 15 LECs שפורסם בעבר שלנו, היתרון של LECs בידוד על ידי FACS כולל את המרכיבים הבאים: בידוד מהיר יותר של תאים עם טוהר גבוה וזיהוי תת תא נפרד ואוכלוסיות נדירות בתוך מדגם הטרוגני. המגבלות העיקריות של הבקר מבוסס FACS ובידוד LM הבקר סובבת סביב מוגבלות מספר התאים זמינים לאימות הבאה תוצאות מיון תא. בנוסף, בזמן שכל נעשה ניסיון לתקן מבחני שלנו והגדרת מכשיר, אותו פרמטרים אלה לא בהכרח לשחזור במעבדות אחרות. לכן, כמה השתנות בתוצאות עלולות להתרחש. בנוסף, אחד הנושאים שביולוגים הלימפה להתמודד הוא היעדר סמנים ספציפיים תאשיבדיל בין סמני הבקר נימים ראשוניים ואיסוף סמני הבקר נימים. בשלב זה, עדיין לא זוהה סמני הבקר שהיה להבחין בין LECs הבריא וLM LECs. מאז רקמת הלימפה מום מכילה גם רגילה למראה כלי הלימפה (איור 1 א), CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע וכתוצאה מכך יכיל כמו גם חלקם של LECs הנורמלי אלה של פנוטיפ החולה. מחקרים עתידיים הבקר בחינה וביטוי גני LM הבקר ופרוטאומיקה ייתכן שיוכלו לכוון אותנו לכיוון סמני הבקר LM ספציפיים יותר שיכול להבחין LM LECs מLECs באותו הרקמה.
בעתיד, אנו מצפים לנצל FACS וסמני הבקר החדשים אלה בניסיון לזהות תת נדיר של אוכלוסיות הבקר הן בערלה ומומי הלימפה. זה יאפשר לנו לבודד אוכלוסיות תאים אלה וללמוד את תפקידם בפיתוח lympמערכת כלי דם ומומי hatic הלימפה.
LECs בידוד וLM LECs מבוסס על CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע צמצמו באופן משמעותי את הזיהום של תאים לא-אנדותל. יתר על כן, טכנולוגית FACS מאפשרת לנו להפריד LECs לתת מבוסס על הביטוי של CD31, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמנים פני תא ולהבין את זה בהקשר של פיתוח שושלת תא. לLECs החולה, זה מאפשר ללימודי תא ספציפי שישפוך אור נוסף על גנים הגורמים למחלות הבקר ויכולת הבקר להגיב לגירויים שונים תא במבחנה ובמודלי xenograft בעלי החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בקרן בייקר ו'הנשים במדע המלגה "קרן הילדים מלכותי תמיכה של Zerina Lokmic. אנדרו ג 'Elefanty ואדוארד ג' סטנלי הם NHMRC עמיתי מחקר בכיר. עבודה במעבדותיהם נתמכה על ידי NHMRC ותאי גזע אוסטרליה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
- Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
- Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
- Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
- Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
- Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
- Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
- Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
- Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
- Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
- Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
- for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
- Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
- Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
- Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
- Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
- Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
- Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).
- Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
- Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
- Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
- Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
- Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
- Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
- Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
- Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
- Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).
