Summary
このプロトコルの目的は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、ヒトのリンパ奇形嚢胞様血管および包皮を裏打ちするリンパ管内皮細胞を単離することです。その後の細胞培養およびこれらの細胞の拡大は、遺伝的プロテオミクス、機能および細胞分化の研究のための実験的な洗練の新しいレベルを可能にします。
Abstract
このような一次リンパ浮腫、リンパ管腫やリンパ性腫瘍のようなリンパ系障害は、重大な病的状態を引き起こすが、少しは、その生物学について知られているまれな条件です。罹患および健常組織から高純度のヒトリンパ管内皮細胞（LECの）を単離することは、遺伝的分子·細胞レベルでのリンパ内皮の研究を促進するであろう。それは、これらの調査は、これらの条件の臨床管理を変更することができる新しい治療のターゲットを公開してもよいことが予想されます。のLECとリンパ奇形リンパ管内皮細胞（LMのLEC）ヒト包皮の分離を説明するプロトコルが提示されています。単一細胞懸濁液の組織を得るために刻み、酵素ディスパーゼIIおよびコラゲナーゼIIを用いて処理しました。得られた単一細胞懸濁液は、次いで、分化（CD）マーカーCD34、CD31、血管内皮増殖因子-3（VEGFR-3）およびポドプラニンのクラスタに対する抗体で標識しました。スタイNED生存細胞は、他の内皮細胞及び非内皮細胞からCD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位 LM LEC集団を分離するために、蛍光活性化セルソーター（FACS）で選別しました。ソートLMのLECを培養し、さらに実験的な使用のためのフィブロネクチンコートフラスコに拡大しました。
Introduction
リンパ脈管系の主な機能は、リンパ液、脂質、タンパク質、および細胞成分を含む過剰な間質液を吸収し、血液の静脈系にそれを行うことです。リンパ毛細管のネットワークが、それは外来抗原の存在についてスクリーニングされたリンパ節に外来抗原を中和する白血球の免疫監視および展開における重要なプロセスをリンパ節を導きます。
片方向リンパ系は、初期リンパ毛細管、リンパエントリ1,2を許可する特殊な細胞間結合を有する薄肉のフラット内皮細胞の不連続な単層を持つユニークな構造を持つ組織で起動します。これらの毛細血管は、増大した間質圧3の存在下での血管の崩壊を防止するためにフィラメントをアンカーを介して隣接する結合組織マトリックスに取り付けられています。毛細リンパ管の収集に空の初期リンパ毛細血管それは、より大きなリンパ管や静脈に合体します。リンパ毛細血管初期と比較して、収集リンパ管は、太い血管の壁を有するリンパバルブをペアにし、いくつかの平滑筋細胞を4埋め込 まれた不連続な基底膜によって包まれています。平滑筋細胞のリンパバルブおよび収縮の協調開閉は3リンパの流れを促進します。胸管と右リンパ管：ヒトでは、身体の様々な領域からのリンパ静脈は2リンパ管を形成するためにマージリンパトランクを形成するために結合します。胸管は、胸下の体の左側から、右側からリンパ液を排出しながら、頭、首、及び胸部の右腕と右側から右リンパダクトドレインリンパ。両方のダクトは頸部5に鎖骨下静脈にリンパ節を行っています。
リンパ系の障害は、広く取得Aに分類されていますND先天性（ 表1）。取得した状態の例にはリンパ管炎および二次性リンパ浮腫です。リンパ管炎は細菌感染によるリンパ管の炎症です。影響を受けたリンパ管が拡張し、多形核細胞を含む滲出液で満たします。皮膚では、これらのリンパ管は、多くの場合、関連する排出リンパ節（リンパ節炎）6の拡大に伴う赤、痛みを伴う皮下スジとして表示されます。二次性リンパ浮腫は、リンパ管やリンパ節障害物への損傷や閉塞の結果として生じます。これは、損傷や障害物へのリンパ遠位の蓄積による慢性進行性の腫れにつながります。先進国では、二次リンパ浮腫は、最も一般的転移腫瘍は、照射後の線維症および炎症後throm、リンパ管または所属リンパ節を妨げ、またはリンパ節の外科的除去後の抗癌療法の結果として悪性度と関連していますbosisおよび瘢痕化7。世界の他の地域では、二次性リンパ浮腫は、 バンクロフト糸状虫 6などの寄生虫によって引き起こされるリンパ管閉塞に続発することができます。
| リンパ血管系の障害 | |||
| 獲得しました | 先天性の | ||
| リンパ節炎 二次性リンパ浮腫 | 一次リンパ浮腫10 | 孤発性リンパ管腫13 | 症候群13とリンパ管腫関連 |
| 例えば ミルロイ症候群 Meige症候群 | シンプル ： リンパ管腫 | 例えば クリッペルTranaunay症候群 公園ウェーバー症候群 スタージ - ウェーバー症候群 | |
| 組み合わせ ： 毛細管リンパ管腫 毛細血管、リンパ静脈奇形 毛細血管、リンパ、動静脈奇形 毛細血管、リンパ静脈、動静脈奇形 | |||
リンパ血管系の障害の表1.概要。
リンパ系の先天性障害は、遺伝的変異、リンパ管拡張症とリンパ系の8,9の異常によって引き起こされると考えられ、一次（特発性）リンパ浮腫が含まれます。一次性リンパ浮腫は、おそらく新生突然変異によって引き起こさ、または継承された散発的であることができます。リンパ障害はまた、単離されたまたはより一般症候群10の一部を構成することができます。小児集団は、リンパの97％浮腫は所属リンパドレナージ11を損なうリンパ管構造の異常と散発的です。ミルロイ病は、出生時に明らかまたは直後に12 VEGFR-3遺伝子の変異によって引き起こされる主要なリンパ浮腫の一例です。主に家族の条件が、ミルロイ病もミルロイ病32の家族歴のない幼児で同定することができます。任意のリンパ浮腫の重症度は、リンパの生産とバック静脈循環6にリンパ液を輸送する能力の量に依存します。
臨床症状にその場内皮細胞増殖に基づいて、リンパ系の異常はリンパ性腫瘍やリンパ管腫13に分類されます。 Kaposiformリンパ管腫は、LEC、腫瘍14の一例です。リンパ管腫は、胚発生の間に生じ、子供15,16に比例して成長すると考えられています。彼らはめったに退行ないがremaiできますnは無症候性外傷や感染症が臨床的合併症につながる急速な成長を沈殿するまで。上記の静脈循環への組織からリンパ管網とリンパの伝導の秩序構造はリンパ液で満たされた異常な嚢胞構造の局所的なコレクションで構成されてリンパ管腫に乱されます。これらの嚢胞血管がリンパ循環にまたはそれらが機能的リンパ管のバルブを含んでいることが接続されていることは臨床的または実験的証拠はありませんが、それらのリンパのアイデンティティは、ポドプラニン、CD31、リンパ管内皮受容体1とリンパ細胞マーカーの範囲の発現により確認されています（LYVE-1）、プロスペローのホメオボックスタンパク質1（PROX-1）およびVEGFR-3 15,17,18。これらの嚢胞構造が小さい（microcystic）または（macrocystic）大のいずれかになりますが、ほとんどのリンパ管腫はmicrocysticとmacrocystic部品（ 図1）16の両方を含みます。手術後、充血nは硬化療法および/または無線周波数は、リンパ管腫は、しばしば再発アブレーション。
人間のリンパ管とリンパ管腫の図1形態。正常ヒトリンパ（A）とポドプラニン（茶色のラベル、矢印）に対する抗体で標識されたリンパ管腫の血管（BおよびC）。ヒトのリンパ奇形容器は著しい膨張内腔の大きさのかなりの変動によって特徴付けられます。これらのローカライズされた異常な嚢胞構造が小さい（microcystic、*）（B）または大（macrocystic、＃）（C）のいずれかであることができます。ほとんどのリンパ管腫はmicrocysticとmacrocystic成分の両方が含まれている。 図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 </ P>
一部の研究者は、リンパ管腫は、LECのが異常な成長の可能性を持っていないが、代わりに通常の循環19への接続に失敗している中で、リンパ脈管構造の発達障害を表すことを示唆しています。しかし、私たちは、LMのLECが速く増殖し、LECの15が LMのLECで一次欠陥があることを示唆している包皮よりもアポトーシスに対してより耐性であることを見出しました。 LMのLECは、マウス異種移植モデルに移植されている場合、それらは、リンパ管の奇形15を連想させる構造を形成します。これは、リンパ管腫は、胎児の発育中にLMのLECで生じる一つ以上の体細胞突然変異によって引き起こされることがあるという仮説を支持しています。実際、最近の報告では、ホスホイノシチド-3-キナーゼ（PIK3CA）遺伝子20のp110α触媒サブユニット内の1つのような変異を同定しました。
DNAシーケンシング技術は、関連する変異Cの進歩を考えるとより容易にこれらの条件の今後の研究を案内する、単離されたLMのLECで同定することがウルド。実行可能なLECの分離が減少栄養利用またはプロアポトーシス剤15に応答して、このような移動、増殖、管形成能と生存のようなアッセイにおける異常と正常のLEC間の比較を容易にするであろう。分離されたLECが、さらに新しいLECの亜集団を描写するために、細胞特異的な遺伝子発現およびプロテオミクス研究を行うために私たちを有効にし、リンパ管腫の臨床管理に適した新規薬剤を発見することになります。
我々は以前新生児包皮とリンパ管腫15からLECの磁気ビーズ分離に基づいて、LEC分離法を発表しています。我々は、CD31について陽性選択にCD34 Negの細胞画分を施し、続いてCD34発現の欠如に基づいて、血管内皮細胞からの正常および疾患のLECを分離する戦略を報告しました。しかし、この方法は、残留非内皮細胞の存在によって妨げられました。これは、従来、後続の結合組織消化に表皮を除去するとは無関係でした。これらの汚染物は、一般的に、最終的にLECの分離を繰り返し、後続の試みにもかかわらず、内皮細胞培養物をovergrewより迅速に、従って、増殖しました。実際には、2％〜5％と低い非内皮細胞の初期の汚染がLEC群15を圧倒するのに十分でした。これは、LEC細胞の収率および純度を改善するためのオプションとして、蛍光活性化細胞ソーティング方法を探るために私たちを促しました。さらに、我々はCD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位のLECを識別するために、選択マーカーにVEGFR-3とポドプラニンを追加し、LEC集団の特異性を高めるためにソートマルチパラメータを使用していました。
これらのマーカーを選択するための理論的根拠は、報告される一方のLECと血液血管内皮CEに基づいていましたLLSは、CD31などの一般的な多くの細胞表面マーカーを有する血液の血管内皮細胞に21-23を比較した場合、LECが表現型CD34の発現の変化、ポドプラニンおよびVEGFR-3細胞表面マーカーを示します。 CD31はまた、血小板内皮細胞接着分子1（PECAM-1）としても知られている130 kDaの膜貫通糖タンパク質です。これは、それが血液およびリンパ管21,24,25のすべてのタイプで発現されるので、汎内皮細胞マーカーであると考えられています。 CD34は、ほとんどの造血前駆上の110 kDaの膜貫通糖タンパク質に存在し、細胞、血管内皮細胞およびいくつかのリンパ管26をステム。
VEGFR-3は、血管内皮細胞増殖のための受容体は、CおよびD因子、最初にマウス胚における現像静脈上に存在するが、転写によって調節リンパ仕様に従うことhicken C、SRY関連HMGボックス（SOX）-18因子O valbumin U pstreaM のp romoter t の ranscription Fの俳優 2（COUPTF-II）とPROX-1は、VEGFR-3の静脈の発現が失われ、それは、胚のLEC 25,27に限定となります。ポドプラニンは、38 kDaの膜は、ムコ蛋白、最初のマウス胚発生28のほぼ胚性リンパ管11日目（〜E11.0）に注目し、それを強く微小血管、リンパ管、リンパ管腫でmacrocysticリンパ内皮によってポドプラニンの式で表されている間15以上の変数です。フローサイトメトリー実験は、少なくともいくつかのCD34 高 CD31 順位内皮細胞は、リンパマーカーポドプラニン29を発現することを示唆しています。ヒトのリンパ管の奇形でLYVE-1およびポドプラニン染色の体系的評価の両方がリンパ奇形内皮細胞30を染色するのに有効であることを示したが、正常組織において、LYVE-1は、初期リンパ強く存在することが報告されました毛細血管内皮が、収集リンパ内皮31に減少し、さらには存在しません。私たちの目標として初期、我々は我々のセル選択戦略の一環として、LYVE-1を使用しないことを選択したリンパ管内皮細胞を収集の両方を単離することです。最後に、これらのマーカーを採用する決定はまた、顕微鏡イメージングのためのフローサイトメトリーおよび免疫蛍光研究との間の相関を可能にする機能をリンパ管を標識するために診断的に使用される抗体の利用可能性に基づいていました。
この記事では、組織消化法、細胞染色およびCD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位のLECならびに包皮とリンパ奇形からCD34 高 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位内皮細胞の正常な分離のために必要なFACSの設定を説明します組織。
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Protocol
倫理文：リンパ管奇形と包皮組織の収集のための倫理的承認は王立子供病院、メルボルン、オーストラリアで人間研究倫理委員会から入手しました。署名した同意が手術前に患者の親から受け取りました。組織サンプルは、選択的割礼を受け、それらの臨床管理および患者の一部として、外科的処置を受けているLMSと診断された患者から採取しました。すべての実験は、国立保健医療研究評議会、オーストラリアのガイドラインに従って行いました。
包皮とリンパ管腫組織から細胞懸濁液の調製
- バッファとメディアの準備。
- EGM-2培地を温め、ゆっくりと37℃の水浴中でキット成分を解凍することによって、市販のEGM-2 MVブレットキットを使用して完全な内皮細胞のメディアを準備します。クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、無菌的にEGM-2培地に各コンポーネントを追加します。一旦、全ての成分が培地に添加されている、「完全な内皮細胞培地」としてこのメディアを参照してください。使用前に内容物を混合するために、滅菌50ミリリットルピペットを使用してください。
注 ：細胞培養に関連するすべてのステップは、クラスIIバイオハザードキャビネット内で行われています。全ての溶液は、製造者の指示に従って、4℃で保存し、使用前に室温に温めます。完全な内皮細胞培地、細胞培養緩衝液と酵素溶液は、使用前に20分間37℃で加温します。 - 50 ngの/ mlのVEGF-Cとの完全な内皮細胞培地を補います。使用するまで4℃で50 mlの滅菌チューブとストアに補充した内皮細胞培地を分注し。 4°Cで保存した場合、メディアは、少なくとも4週間安定です。
- 8.752グラムのNaCl、1.416グラムのNa 2 HPOを溶解することによって、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備4·2H 2 Oと水1000ml中に0.395グラムのKH 2 PO 4。 pHを7.4に調整します。フィルタは、4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してPBSを殺菌します。 （1：100で使用される）抗生物質/抗真菌剤溶液を添加使用する前に。
- ヒトフィブロネクチンを調製するために、滅菌水10mlにフィブロネクチン1mgを溶解させます。ストアを-20℃で100μlのアリコートでソリューションを再構成しました。利用当日（10μgの/ mlの最終作業濃度を与えるために）フィブロネクチンアリコートの100μlに10mlの無菌PBSを追加。
- 酵素メディアの場合、滅菌PBSで0.04％ディスパーゼII、0.25％コラゲナーゼIIおよび0.01％DNアーゼIを含む溶液を準備します。まず、滅菌50mlチューブにディスパーゼ及びコラゲナーゼ、場所を計量PBSの必要量を添加し、溶解するために37℃で振とうしながら30分間インキュベートします。溶解後、フィルターはバイオセーフティーフード内（0.22μmフィルター）ディスパーゼ/コラゲナーゼ溶液を滅菌します。無菌的になるまで37℃でのDNase I.ストア酵素液を追加使用しています。
注 ：DNアーゼI滅菌凍結乾燥粉末として市販の細胞培養グレードの試薬 です。
- EGM-2培地を温め、ゆっくりと37℃の水浴中でキット成分を解凍することによって、市販のEGM-2 MVブレットキットを使用して完全な内皮細胞のメディアを準備します。クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、無菌的にEGM-2培地に各コンポーネントを追加します。一旦、全ての成分が培地に添加されている、「完全な内皮細胞培地」としてこのメディアを参照してください。使用前に内容物を混合するために、滅菌50ミリリットルピペットを使用してください。
包皮とリンパ管腫の細胞懸濁液の調製
- DMEM / 2％抗生物質抗真菌溶液10mlを含む50mlチューブを秤量します。このチューブは、組織収集のために使用されます。
- リンパ管腫と包皮組織を外科的に除去した後、無菌的に細胞培養実験室に、氷上でチューブと転送に組織標本を追加します。
- 組織を含むチューブを秤量し、組織重量を計算します。組織を消化するのに必要な酵素溶液の体積を計算するために、この重みを使用します。
- クラスII安全キャビネットでは、100mm組織培養皿に組織やメディアを転送するために滅菌ピンセットを使用しています。細かく〜1mm 3の小片に組織をミンチに無菌のはさみを使用してください。
- メディアIと混合転送細分化した組織滅菌DMEM / 2％抗生物質抗真菌溶液をさらに10 mlを含む50mlチューブNTO。組織を再懸濁するために転倒混和します。 5分間、300×gでサンプルを遠心。
- 上清を取り除きます。組織重量に基づいて、予め温めた（37℃）、コラゲナーゼIIミンチ100mgの組織当たり/ DNアーゼI /ディスパーゼII消化溶液1mlを加えます。一般的には、細分化した組織の約1グラムのための酵素溶液10mlを使用しています。
- 定数は200 rpmで振盪しながら20〜90分間37℃のインキュベーター中で組織をインキュベートします。この期間の終わりに、ほぼすべての組織の微細断片に消化されていることを確認。
注 ：プライマリの組織に影響を与える細胞の生存からの単離時のコラゲナーゼとディスパーゼへの細胞の曝露。我々は、線維性リンパ管奇形サンプルが消化の60〜90分を必要とする場合があり、一方、最も新生児包皮サンプルは最適、消化の20〜30分を必要とすることを実験的に見出しました。 LM LEC収量sは線維症の存在量によって影響され、より多くの繊維組織はおそらく、コラゲナーゼIIおよびディスパーゼIIへの長期暴露の有害な影響のために、少数の細胞を得ました。 - 消化後、生物学的安全キャビネットにチューブを転送し、滅菌50mlチューブ中に入れ70μmのストレーナを介して消化された組織液を通過させます。細胞外マトリックスのわずかな痕跡が観察されるまで、ゴムプランジャーで3 mlシリンジのピストンを使用して、残りの組織を細かくすりつぶします。
- ふるいし、酵素を不活性化するためにこだわった細胞を回収する酵素媒体を解離の体積に対する内皮細胞培地同等の体積を有するセルストレーナーを洗浄します。例えば、細分化した組織を消化する酵素の媒体を解離2mlのために、酵素を不活性化するために、内皮細胞培地2mlを追加します。
- 5分間、300×gで細胞溶液を遠心し、上清を吸引除去します。 R>は10mlのPBSで細胞を電子中断。 300×gで遠心分離した細胞5分間、2回の細胞洗浄を繰り返し、上清を除去します。 >内皮細胞培地20mlに細胞ペレットを再懸濁します。次に> 2フラスコ150センチメートルでシード2×10> 6細胞は、内皮細胞培地20mlの最終容量で、フィブロネクチンで予め被覆されたトリパンブルーを用いて細胞数を計測します。加湿空気インキュベーター中、5％CO> 2で37℃で培養>
注 ：これは、トリパンブルー排除により推定されるように、有核細胞の75％-90％が組織消化に耐えることが期待されます。初期の細胞数は、細胞懸濁液中のすべての有核細胞（ すなわち、角化細胞、白血球、マクロファージ、結合組織細胞と血管細胞）を反映しています。 5-7日目に細胞数は、添付の生存および細胞培養中に増殖した細胞を反映します。フィブロネクチンで組織培養フラスコを被覆することも、その後のLECとLM LECの生存率を改善します。 - 一晩インキュベートした後、Pで3回洗浄し、未結合の中の細胞を洗い流しますBS / 1％抗生物質 - 抗真菌溶液、新鮮な内皮細胞培地を追加します。効果的にフラスコ内に存在する未結合の細胞および赤血球を除去するために3回の洗浄を行っています。一日おきにメディアを変更します。細胞は、5-7日後に〜80％コンフルエントになります。
フローサイトメトリーのためのリンパ管内皮細胞表面マーカーのための細胞の3抗体染色
- 細胞の後、80％のコンフルエンスに達した吸引培地とPBSで細胞をリンスしています。
- このような37℃で5-7分間のAccutase 150センチメートルあたり2フラスコなどの細胞剥離液7mlので細胞をインキュベートすることによって接着細胞を切り離します。
- 収穫剥離した細胞、内皮細胞培地の3ボリュームを追加することにより、細胞剥離液を不活性化し、新しい滅菌チューブに細胞懸濁液を移します。
- 5分間、300×gで細胞を遠心。
- 上清を吸引し、5mlのPBSで細胞を再懸濁します。 5分間300×gで遠心分離細胞は、Sを除去します細胞洗浄を繰り返し、その後upernatant。 5mlのPBSで細胞を再懸濁します。
- 生細胞の数をカウントします。 0.4％トリパンブルーの90μlの細胞懸濁液10μlを混ぜます。計数のために血球計数器への転送この懸濁液10μl。
注 ：最終細胞収量は、処理されたサンプルのサイズに依存します。生存細胞の7×10 5〜1.2×10 6から150cm 2のフラスコ範囲あたり通常の細胞収量。 - 細胞染色用の抗体溶液を準備します。
注 ：以下の希釈液を100μLの染色体積で1×10 6を染色するために滴定しました。- 希釈し、PE結合マウス抗ヒトVEGFR-3（1時50分）; PE-Cy7の結合マウス抗ヒトCD34コンジュゲート（1：200）; APC結合マウス抗ヒトCD31（1：100）およびAlexa 488コンジュゲートラット抗ヒトポドプラニン（1：200）、100μlの組織サンプルあたりの滅菌5％FBS / PBS溶液の総体積です。の調製後抗体溶液は、使用するまで氷上に維持します。同様に、ゲートフローサイトメトリーの設定を容易にするために、希釈したアイソタイプ対照抗体の混合物を調製します。
- 、2分間300×gで遠心分離細胞を、抗体の非特異的結合を低減するために、染色されるべきサンプルあたり100μlの滅菌5％FBS / PBS溶液中で細胞を懸濁後、上清を除去します。 4℃で20分間氷上で細胞をインキュベートします。
- 5分間、300×gで遠心分離細胞は、コンジュゲート抗体カクテルに再懸濁細胞を、上清を除去します。また、100μlのアイソタイプコントロール抗体の混合物中の細胞（1×10 5）の小さいアリコートを染色します。 20分間氷上で細胞をインキュベートします。
- 未結合の抗体を除去し、300×gで細胞を5分間、2％FBS / PBS溶液と遠心分離機の2ミリリットルを追加します。上清を吸引し、洗浄を繰り返します。
- アイソタイプ対照および0.5 mg / mlのプロピジウムIOの300μlのソートする抗体染色されたサンプルの細胞ペレットを再懸濁しdide / 2％FBS / PBS溶液。ソートするまで氷上にチューブを置きます。
4.セルソーティング
- 楽器を設定するには、以下の材料を使用します。そのような市販の蛍光粒子、リン酸緩衝生理食塩水ベースのシース流体などAccudrop蛍光ビーズとして遅延ビーズ、ドロップなどのアライメントビーズ。
- マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別装置で精製されたヒトのLECを分離します。楽器を設定し、製造業者の推奨に従って整列します。また、補正行列を生成するので、PE-CyのチャネルにかかるPEなどの蛍光色素の発光のを通してかなりのブリードを除去するために、各ソートで単一染色補正制御を実行します。
注 ：FACSの割合が高く100μmのノズルが使用され、細胞は内皮細胞培地に分類される場合、細胞が単離に耐えるソート。
5.細胞培養後のFACSソートING
- 5分間300×gで遠心分離細胞は、ソーティング後。上清を吸引し、（細胞を播種するために使用したフラスコに応じて）メディア5〜10mlの中に細胞を懸濁します。 50,000未満のセルがソートされた場合、細胞は、フィブロネクチンコーティングした25cm 2のフラスコ中で培養されます。
- それ以外の場合は、培養を5％CO 2、空気加湿インキュベーター中で37℃で75 cm 2のフィブロネクチンでコーティングされたフラスコ内の細胞。 2日後にメディアを変更します。
注 ：メディアの変更の間の時間を延長することは、非内皮細胞の生存に有利に働くように思われるので、細胞培地は一日おきに変更されます。細胞がさらに拡大15の最初の分割である場合PROX-1、VEGFR-3、ポドプラニン、CD34およびCD31：私たちは、マーカーの免疫組織化学的検出を用いて、リンパ内皮細胞の表現型を検証します。
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Representative Results
初期組織消化に続いて、未分画試料の培養24時間後に、別個の内皮細胞のコロニーは、線維芽細胞様細胞および平滑筋細胞と共に（ 図2A）を観察することができます。選別および細胞培養における24時間後に続いて、CD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位細胞が付着し、典型的な敷石状の形態（ 図2BおよびC）を示します。上記のFACS法を用いて、純度99.8％の細胞を浄化し、CD34 高 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位内皮細胞と区別することができます。磁気ビーズ分離法を使用する際の戦略をゲート制御し、仕分けの代表的な結果を図3に示されている。これは、問題を解決したが経験しました。これまでに、我々は、LMのLECとLEC包皮、この経過後の通路13に、これらの細胞を継代していますSは形態学的変化と減少細胞分裂を伴う、老化し始めます。
図2.包皮のLECとLM-LECは 24時間酵素消化し た後に、ソートされていない細胞は、内皮（矢印）および非内皮細胞（A）の両方を含みます。 CD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位 FACS細胞の単離後、LECを（B）とLM-のLEC（C）包皮非内皮細胞を欠いていると石畳の形態を維持している。 図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
血管とリンパ内皮細胞の細胞選別のためのゲーティング戦略をソート図3.蛍光活性化細胞S。（A）生細胞を最初にそれぞれVEGFR-3とポドプラニンゲーティングにソート血管（B）およびリンパ内皮（C）細胞によって、CD34およびCD31の発現にゲート続いています。ソートされたCD34 高 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位細胞の（D）の再分析は、> 98％の血管内皮細胞の表現型を示しています。 CD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位表現型でソート（E）LECの細胞はまた、> 98％純粋である。 図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
LECが、外来抗原といくつかの栄養素の吸収と輸送に対する免疫応答を体液の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしています。 LEC恒常性は、細菌感染症および腫瘍転移などの疾患プロセスの影響を受けることができますが、LECが、また影響を受けた患者のための機能不全リンパ管の形成とかなりの罹患率につながる体細胞変異を開発することができます。 in vivoでの移植およびex vivo実験を通してリンパ管腫の病因のより多くの理解を得て、新たな治療の選択肢を発見するためには、まずCD34 Negの CD31 順位の選択戦略15を用いた磁気ビーズ選択戦略に基づいて、LEC分離法を開発しました。しかし、得られた培養物は、多くの場合、除去が困難であった内皮細胞以外の細胞を含んでいました。その後、この方法は、CD34 低 CD31 順位 VEGR3 Pを表現するのLECをソートするために、FACSを用いて精製し、OSポドプラニン順位表現型。このアプローチは、ポスト·ソートチェックで<非CD34 低 CD31 順位 VEGR3 順位ポドプラニン順位細胞の0.5％を含有し、比較的均質なLECの文化をもたらしました。実際には、FACSによって細胞を選別する利点は、<0.5％の非存在のLECの減少です。培養したLECとLMのLECは、典型的な敷石状の形態を有しており、通路13周りに老化します。
本研究では、細胞表面マーカーのスイート（CD34 低 CD31 順位 VEGR3 順位ポドプラニンPOS）の発現に基づいて、正常と異常組織からの単離と高度に濃縮LECの文化のためのフローサイトメトリーベースのプロトコルを記述しています。細胞は、in vitroでの増殖の5-7日、隔離時の組織におけるそれらの頻度と比較して、LECの実質的な濃縮をもたらしたステップ、主に次のような組織から選別しました。 sの間、urgery我々はいくつかのマイクログラムから重量のグラム数十に及ぶ組織を得ます。この組織は、現在のリンパ管腫の血管、組織瘢痕化およびリンパ奇形嚢胞血栓の存在の体積に対して、その組成が大きく異なります。これらすべてのコンポーネントは、病変組織から単離することができるどのように多くの細胞に影響を及ぼす。したがって、出発細胞数は、数千の細胞から数百万のセルの範囲とすることができます。同様に、これは、細胞懸濁液の組成に影響を与え、選別された細胞の数は、1つのサンプルから相互に異なることを意味し、細胞数を開始します。
LMのLECは、0.8％から12.43パーセントの範囲で、一方、培養中の5-7日後にソートされていない包皮サンプルにおけるLECの頻度は、0.52パーセントから4.7％の範囲です。 LEC培養は、ポストソート再分析した後に> 99％CD34 低 CD31 順位 VEGR3 順位ポドプラニン順位セルを構成し、典型的なcobblestonを維持しました非内皮要素による異常増殖することなく通路で老化〜13までの文化の中での電子の形態。
これは、初期の組織消化以下と包皮やリンパ管腫細胞のいずれかの収率は、一般的に低いため、ソート細胞のex vivoで拡大することが必要です。このように、リンパ管内皮細胞の膨張前は、I nは、インビトロマウスチャンバーに播種するために必要な〜2×10 6個の細胞を生成することができます。これは、5-7日のin vitroでの膨張段を必要とします。我々は、細胞培養物は、初代細胞における表現型の変化を誘導し得ることを認めているが、我々は、これらの培養細胞は、マウス異種移植モデル15内リンパ奇形様構造を形成する能力を保持していることを示しています。
FACSによって細胞を選別する際の成功の度合いを決定するプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。最も重要なステップは、コラゲナーゼへの細胞の曝露の時間ですステップ2.7で説明したように、一次組織からの単離中ディスパーゼ。これは、だけでなく、組織の存在量や種類によっても使用される酵素のバッチに影響されます。また、細胞集団を特徴付けるために使用蛍光標識された抗体は、滴定、好ましくはモノクローナルする必要があります。私たちは、トリプシン/ EDTA、EDTA、のTrypLEを選択し、細胞剥離液として、いくつかの異なる細胞剥離液を試験しました。我々は、EDTAは、多くの場合、残った細胞および残留細胞塊を分離するために長期間使用されることを持っていたことが分かりました。対照的に、単一細胞懸濁液を、トリプシン/ EDTA、細胞剥離液とのTrypLE選択中でのインキュベーションの3~5分以内に生成しました。我々は、酵素溶液のいずれかで処理した後のCD31、CD34、ポドプラニンおよびVEGFR-3の発現に実質的な差は認められませんでした。単染色した試料はまた、重ならない蛍光色素の発光スペクトルを確実にするために、すべての選別実験で行われるべきであるとしたがって、誤った測定値を与えます。これらの重要なステップは、細胞プロトコルへの変更は、並べ替え、フローサイトメトリー時に必要なトラブルシューティングする場合があります手順を構成しています。
個別の細胞サブセットと不均一試料内の希少集団の高純度および同定と細胞のより迅速な単離：LECの15の私たちの以前に公開された磁気ビーズ単離と比較すると、FACSでのLECを単離することの利点は、次のものが含まれています。 FACSベースのLECとLM LEC分離の主な制限の周り細胞選別の結果、以下の検証のために利用可能な限られた数の細胞を公転します。すべての試みが私たちのアッセイおよび機器のセットアップを標準化させながら加えて、これらの同じパラメータは、必ずしも他の研究室では再現できない場合があります。そのため、結果にいくらかの変動が発生することがあります。また、リンパ生物が直面する問題の一つは、細胞特異的マーカーの欠如でありますそれは、初期毛細管LECマーカーを区別し、毛細管LECマーカーを集めるだろう。この段階では、我々はまだ健全なのLECとLMのLEC区別うLECマーカーは確認されていません。リンパ管腫組織は、正常に見えるリンパ管（ 図1A）を含んでいるので、得られたCD34 低 CD31 順位 VEGR3 順位ポドプラニン順位は、罹患表現型のものだけでなく、通常のLECの割合が含まれます。 LECとLM LEC遺伝子発現およびプロテオミクスを調べる今後の研究は、同じ組織内でのLECからLMのLECを区別することができ、より具体的なLM LECマーカーに向かって私たちを導くことができるかもしれません。
今後は、包皮とリンパ管腫の両方LEC集団のまれなサブセットを同定する試みにFACSおよびこれらの新しいLECのマーカーを利用することを期待しています。これは、私たちはこれらの細胞集団を単離し、lympの開発における彼らの役割を研究することを可能にしますhatic血管系とリンパ管腫。
CD34 低 CD31 順位 VEGR3 順位ポドプラニン順位に基づいて単離するのLECとLM LECが著しく非内皮細胞の混入を減少させました。さらに、FACS技術はCD31、ポドプラニンおよびVEGFR-3の細胞表面マーカーの発現に基づいてサブタイプにのLECを分離するために、細胞系統の開発の文脈でこれを理解するために、私たちを可能にします。患部のLECの場合、これは、LEC疾患インビトロおよび動物異種移植モデルにおける種々の細胞刺激に応答するLEC容量を引き起こす遺伝子にさらに光を当てるします細胞特異的研究を可能にします。
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Acknowledgments
著者らは、ベーカー財団とZerina Lokmicの支援ロイヤル子供財団科学フェローシップで女性を承認したいと思います。アンドリューG. ElefantyとエドゥアールG.スタンレーはNHMRC上級研究員です。彼らの研究室での作業は、NHMRCと幹細胞オーストラリアによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
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