Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) تلعب دورا رئيسيا في مجال الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. يمكن أن تهاجر، تفرق في مختلف أنواع الخلايا 1 وتدبر، مما يجعلها مثالية للمرشحين لعلاجات ذاتي 2،3. في الآونة الأخيرة، والتجارب السريرية باستخدام اللجان الدائمة لإصلاح العظام والغضاريف، أطلقت الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف أو أمراض القلب 4. هذه اللجان الدائمة يمكن أن تحصد من أنسجة الحبل السري أو الدهنية ولكن تم الحصول على النتائج الواعدة من نخاع العظام الخلايا الجذعية المستمدة 5.
قمة الحرقفي تسمح لجمع كمية كبيرة من نخاع العظام وبالتالي بمثابة الموقع الرئيسي للطموح 6. ومع ذلك، فإن نوعية نضح تتناقص مع زيادة حجم النخاع العظمي سحبها. في حين أن 5 مل الأولى من نخاع العظام نضح تحتوي على اللجان الدائمة ذات جودة عالية، وسحب كميات أكبر يؤدي إلى التخفيف من نضح مع الطرفية و الدمROM العظام أوعية دموية غاية 7. بسبب السوية العرطلة والصفائح الدموية الحالية، شفاطات نخاع العظام عرضة للتخثر، ما لم يتم استخدام مضادات التخثر. ولكن حتى مع مضادات التخثر، قد تحدث الجلطات.
في نخاع العظام، واللجان الدائمة تمثل سوى نسبة صغيرة من تجمع الخلايا مجموع 8 ولها أن تتوسع في الثقافة بالنسبة لمعظم هندسة الأنسجة أو التطبيقات العلاجية 4. نوعية مثل هذه الثقافة يعتمد إلى حد كبير على بركة الخلية الأولي، أي.، والتنوع والانطلاق ارتفاع عدد 9. انخفاض أعداد اللجان الدائمة من السحب يمكن تفسيرها جزئيا تقلب المانحة. من ناحية أخرى، اللجان الدائمة من عينات جودة منخفضة تتطلب وقتا أطول في الثقافة والركض تمتد لتصل إلى العدد المطلوب من الخلايا. في كلتا الحالتين، الركض بمد هو مصدر الشيخوخة الخلية ويمكن أن يؤدي إلى فقدان التمايز المحتملين 10. لذلك، بروتوكولات والتى تزيد من خلية ذ الأمثلدرع ومنع من الآثار الضارة يجب أن تكون وضعت 11،12.
عندما بدأنا العمل مع اللجان الدائمة الكلاب، كنا مندهش لرؤية أن نحو ثلاثة من كل أربعة الكلاب عينات نخاع العظم الواردة الجلطات، في حين كانت العينات البشرية متخدر لحسن الحظ (واحد من كل عشرة) أقل تواترا. من ناحية أخرى كان ليس من المستغرب، أن لاحظنا انخفاض العوائد الكثير من اللجان الدائمة من عينات متخدر. لحل القضية المتكررة من عينات متخدر، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام يوروكيناز المخدرات التخثر بدلا من اختزال.
يمكن علاج التخثر تصدي تهدد الحياة حالات مثل انسداد الأوعية الدموية مما يسبب النوبات القلبية والسكتة الدماغية أو الانسدادات بسبب تخثر غير المرغوب فيه. وهي تعمل عن طريق تدهور الجلطات من خلال الانقسام الأنزيمية من الفيبرين من قبل بلازمين والأنزيمية منشط تفعيل. وعلى الرغم من استخدام واسع لعلاج المرضى، لا توجد إلا عدد قليل جدا من المطبوعات التي تستخدم الأنشطة التخثرلالتطبيقات المختبرية لانقاذ عينات متخدر، مع التركيز في الغالب على الخلايا الليمفاوية. في عام 1987، Niku وآخرون. وصف استخدام ستربتوكيناز لتذويب الجلطات الدموية مما أدى إلى الخلايا الليمفاوية وظيفية بعد 13 وأربع سنوات، دي فيس وآخرون. مدد استخدام ستربتوكيناز لعزل خلايا سرطان الدم من الدم ونخاع العظام لتطبيقات تدفق cytometric 14. ويشير المنشور أكثر حداثة استخدام Alteplase لتشخيص السرطان 15. أثناء استخدام نهج الأنزيمية نفسه، يركز بروتوكول لدينا في عزلة متعددة القدرات اللجان الدائمة نخاع العظم شكل توفير أداة للباحثين في مجال الخلايا الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: شفاطات نخاع العظام البشرية من العرف الحرقفي جمعت من توافق الجهات المانحة مع موافقة لجنة أخلاقيات كانتون لوسيرن. تم جمع الكلاب شفاطات نخاع العظم من العرف الحرقفي مع consent.Human مالك الكلب (حوالي 20 مل) والكلاب (حوالي 10 مل) شفاطات نخاع العظام كانت مكافحة متخثر بإضافة 15 مل من 3.8٪ سيترات الصوديوم مباشرة بعد الانسحاب في غرفة العمليات. تم نقل العينات إلى مختبر البيئة لمعالجة نفس يوم سحبها.
1. إعداد يوروكيناز (قبل 1 الحادي والاستخدام)
- إعادة يوروكيناز باستخدام الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة: إضافة 10 مل PBS إلى قارورة-الحاجز مدخل باستخدام حقنة 10 مل. حل المادة الجافة التي يحوم الحصول على 50،000 وحدة حقن (U) لكل مل.
- إعداد 500 مكل (25،000 U لكل منهما) في الصورةأنابيب terile. متجر مأخوذة -20 ° C واستخدامه عند الحاجة لمدة 6 أشهر على الأقل.
2. محضرة خطوات (وقبل كل علاج العظام نخاع)
- ذوبان الجليد قسامة واحدة من يوروكيناز (25،000 U) في متخدر نضح نخاع العظم (وحدات التخزين نضح تصل إلى 25 مل وقد تمت معالجة بنجاح باستخدام قسامة واحدة من 25،000 U).
- سخن حمام مائي أو تهز حاضنة إلى 37 درجة مئوية.
3. الأنزيمية دايجست من الجلطة
- أداء جميع الأعمال في الصفحي الوزراء للسلامة الأحيائية تدفق لتجنب التلوث الميكروبي للعينات نخاع العظم أثناء معالجة. عند العمل مع المواد البشرية التي قد تكون معدية، وينصح باستخدام القفازات الواقية وكذلك معالجة متأنية.
- وضع مصفاة 100 ميكرون خلية على رأس أنبوب معقم 50 مل. صب بعناية نضح نخاع العظام من خلال مصفاة الخلية، إمالة مصفاة أو تتحرك حول مادة تجلط. استخدام غيض الماصة العقيمة لتدفق أفضل من خلال شبكة التصفية.
ملاحظة: تجنب أي تخفيف للتجلط، على سبيل المثال، عن طريق غسل الجلطة مع برنامج تلفزيوني. يوروكيناز تتصرف بشكل غير مباشر وتتطلب مكونات المصل (أي.، منشط) من خزعة لفعالية هضم. في الوقت الذي تواصل الإجراء مع المواد جلطة، يمكن أن تبقى الراشح في RT حتى استخدامها مرة أخرى في الخطوة 3.6. - نقل المواد تجلط نخاع العظام إلى صحن الثقافة خلية فارغة باستخدام ملقط معقم. قطع الحطام إلى قطع صغيرة من حوالي 2 مم 3 باستخدام مشرط معقم.
- نقل قطع صغيرة من جلطة في أنبوب رد فعل 50 مل باستخدام ملقط معقم. تأكد من أن الجلطة مفروم لها مظهر الرطب. إذا كان يبدو إلى أن تكون جافة، واستخدام بعض من الراشح من الخطوة 3.1 لترطيب.
- يسحن الجلطة قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات باستخدام الماصة 5 مل عيار مكروي. إضافة 1 قسامة من يوروكيناز للعينة. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C إما في حمام مائي أو فيوالهز (بلطف) الحاضنة.
- يسحن من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات باستخدام الماصة 5 مل. تنفيذ هذه الخطوة في خزانة السلامة البيولوجية. احتضان لمدة 30 دقيقة أخرى في 37 ° C. بعد الحضانة، ويسحن مرة أخرى 5 مرات باستخدام الماصة 5 مل. تمر في مصفاة جديدة خلية 100 ميكرون لتجميع مع الراشح من الخطوة 3.2.
- الطرد المركزي تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 500 ز س. تجاهل طاف. اعادة تعليق بيليه خلية في وسائل الإعلام كما هو موضح أدناه أو وفقا لالإجراء العادي من المختبر الخاص بك للثقافة التوسع MSC.
4. البذر للثقافة التوسع خلية وCFU لوحات
- resuspend الخلايا (التي تتكون من كريات الدم الحمراء وخلايا وحيدات النوى) في 50 مل من المتوسط القاعدية: ألفا MEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل، 100 ملغ / مل الستربتومايسين و 2.5 ملغ / مل الأمفوتريسين B . عدد الخلايا 01:10 مخففة في حل التريبان الأزرق باستخدام chambe نويباورص.
- لوحة الخلايا في قوارير زراعة الخلايا في كثافة 5 × 10 7 خلية / سم 2 واحتضان في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية. إذا كان متوفرا، استخدم ميتة (5٪ أكسجين) الظروف. لمراقبة فحص CFU، لوحة 10 9 خلايا في طبق ثقافة الخلية من 10 سم القطر.
- بعد 3 أيام من الثقافة، وترد الخلايا الجذعية الوسيطة إلى الطبق ثقافة الخلية بينما تبقى الخلايا الأخرى في تعليق. تغيير وسائل الإعلام مع المتوسطة القاعدية تستكمل مع 5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF). لمراقبة فحص CFU، علاج الطبق الثقافة خلية بالمثل.
- مواصلة زراعة الخلايا ليصبح المجموع 2 أسابيع، وتبادل وسائل الإعلام ثلاث مرات في الأسبوع. إذا خلايا تتجاوز 80٪ confluency، وتقسيم من قبل trypsinization. لمراقبة فحص CFU، تبادل وسائل الإعلام أيضا، ولكن لا انقسام الخلايا للدورة من أسبوعين.
5. بالغيمزا صمة عار لفحص كفو
- إعداد 10 مل من بالغيمزا-حل لكل طبق: ديليوت الحل الأسهم (7.6 غرام / لتر بالغيمزا في الجلسرين: الميثانول) 01:10 في الماء المعقم (دائما بتحضير التخفيف عمل جديدة).
- إزالة وسائل الإعلام من الطبق الثقافة الخلية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. كن قائى جدا عند تطبيق السائل إلى طبق بتري وتجنب غسل قبالة الخلايا.
- إصلاح الخلايا في الميثانول النقي لمدة 5 دقائق على RT. تجاهل الميثانول. إضافة بالغيمزا-حل واحتضان لمدة 60 دقيقة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. الهواء الجاف رئيس لوحة لأول مرة على منشفة ورقية. عدد المستعمرات يدويا. وأفضل طريقة لتحقيق ذلك باستخدام القلم علامة على الجزء الخلفي من لوحة.
6. MSC التمايز
- اللجان الدائمة الكلاب التمايز
ملاحظة: تم التفريق بين اللجان الدائمة الكلاب إلى مكون للغضروف، المكونة للعظم والأنساب مكون الشحم من التحفيز مع وسائل الإعلام المناسبة لمدة أربعة أسابيع. - إلى التمايز مكون الشحم، اللجان الدائمة الثقافة في أحادي الطبقة في 4 × 10 5 مLLS / سم 2 بالتناوب شرطين ثقافة مختلفة على النحو التالي؛
- الثقافة في وسائل الإعلام الصيانة تكون الشحم التي تحتوي على DMEM + GlutaMAX، 3٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B و 170 ملي الأنسولين.
- الثقافة في إحداث تكون الشحم وسائل الإعلام مع المتوسطة صيانة تستكمل مع 3٪ FBS، 5٪ مصل الأرنب، 1 ميكرومتر ديكساميثازون، 500 ميكرومتر 3-الايزوبروبيل ا-1-الميثيل، 33 ميكرومتر البيوتين، 5 ميكرومتر روزيجليتازون و 17 ميكرومتر بانتوثينات 16.
- استمتع قطرات الدهون التي تلطيخ مع النفط الأحمر-O. لفترة وجيزة، وتحديد الخلايا مع 10٪ الفورمالديهايد، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وصمة عار مع يا أحمر 0.35٪ النفط في الأيزوبروبانول.
- للثقافة التمايز المكونة للعظم اللجان الدائمة في أحادي الطبقة في 7 × 10 3 خلية / سم 2 وتحفيز في ما يلي:
- المتقدم DMEM (GIBCO) + GlutaMAX، 5٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، 501؛ M حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات، 10 ملي ß-سكرولي و 100 نانومتر ديكساميثازون.
- التعرف على الودائع تمعدن التي كتبها فون كوسا وصمة عار (5٪ AGNO 3). لفترة وجيزة، وتحديد الخلايا مع 10٪ الفورمالديهايد، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وصمة عار مع 5٪ AGNO 3 في الماء المقطر.
- التمايز مكون للغضروف
- مكعبات قطع (3 ملم لكل جانب) من الجهاز الطبي اسفنجة على شكل، شكل من مجفف بالتجميد نوع الكولاجين الأول، ويستخدم كمادة سقالة لدعم الخلايا 17.
- اللجان الدائمة البذور على الجزء العلوي من مكعبات في تركيز 4 × 10 6 خلية / مل (~ 70،000 خلية / مكعب).
- قبل إضافة وسائل الإعلام، والسماح للخلايا على الانضمام إلى مكعبات لمدة 30 دقيقة.
- الحفاظ على ثوابت-MSC الكولاجين في وسائل الإعلام مكون للغضروف تتألف من DMEM / F12 + GlutaMAX، 2.5٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، 40 نانوغرام / مل ديكساميثازون، 50 ميكروغرام / مل الاسكوربيك حمض 2-الفوسفات،50 ميكروغرام / مل L-البرولين، 1X الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم-X، و 10 نانوغرام / مل عامل النمو المحول-β1.
- استخدام تلطيخ الأزرق الألسيان لتصور تراكم البروتيوغليكان في أقسام يبني. لفترة وجيزة، وصمة عار على أقسام O / N مع الأزرق الألسيان 0.4٪ المذاب في 0.01٪ H 2 SO 4 و0.5M غوانيدين هيدروكلوريد. وبعد ذلك، تم غسلها غسل أقسام لمدة 30 دقيقة في 40٪ DMSO و0.05M MgCl 2. تم counterstained الخلايا مع الأحمر سريع النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحقائق أن 74٪ من الكلاب عينات نخاع العظم (ن = 54) الواردة جلطات عندما وصلوا في مختبرنا (الشكل 1A) جنبا إلى جنب مع انخفاض عائدات MSC من هذه العينات، جعلنا نعتقد أن كان محاصرا عدد كبير من اللجان الدائمة داخل الجلطات . في الواقع، بسيطة دابي وصمة عار المواد تجلط مقطوع تؤكد وجود خلايا الأنوية في عالية الكثافة (الشكل 1B). هذا يؤدي في النهاية إلى انخفاض أعداد اللجان الدائمة المتاحة للثقافة التوسع، والتي تسببت لنا لتطوير بروتوكول باستخدام يوروكيناز. يتخثر عادة تختفي تماما تقريبا عند تطبيق بروتوكول لدينا. ومع ذلك، خلال تطوير طريقة تناولنا مسألة تجلط هضم منهجية من قبل وزنها قبل وبعد هضم. وكشفت هذه التجارب أن بقايا عسر الهضم كانت 15٪ (الكلب) أو 9٪ (الإنسان) من الوزن تجلط الأولي (الشكل 2A).
وهناك سمة نموذجية من نخاع العظام المستمدة اللجان الدائمة هي لبيليتي على التمسك أطباق ثقافة الخلية. الباحثين الاستفادة من هذه الخاصية لتحديد اللجان الدائمة لل. ونتيجة لذلك، وهي مستعمرة تشكيل مقايسة تسمح لتقييم جودة تجمع الخلايا بطريقة بسيطة، الكمية وموثوق بها. في المختبر لدينا، الفحص تشكيل مستعمرة الموصوفة هنا تم تطبيق بشكل روتيني لجميع العينات نخاع العظم المصنعة (أيضا غير متخدر منها). وهذا ما سمح لنا باستخدام الفحص كما المعيار الرئيسي لتحديد مدى فعالية من يوروكيناز هضم. السماح المقارنة المباشرة، وخلايا من الرواشح عينة متخدر (أي كما لو عينات متخدر تم تصفيتها فقط ولكن لم يعالج إنزيمي) وهضمها والمصنف جلطات على منفصلة 10 سم أطباق تليها الحضانة لمدة أسبوعين. عندما تصور مستعمرة (كفو) مع بالغيمزا صمة عار (كما هو موضح في الشكل 2B)، لاحظنا 3.8 مرات أكثر كفو من ردود الفعل يوروكيناز عينات من الكلاب من المقابلة الرواشح الأولية (الشكل 2C). Although أقل وضوحا، وجاءت العينات البشرية اتجاها مماثلا مع 1.6 أضعاف أكثر كفو من عينات المعالجة، مؤكدا مدى ملاءمة البروتوكول. في الواقع، لوحات من جلطة هضمها موضح في الصف الأيمن في الشكل 2B تتوافق مع النتيجة المألوفة لعينة المجمعة. ومع ذلك، والتباين المانحة قد يؤدي بسهولة إلى أرقام CFU من نصف لمضاعفة ما يصور.
أخذ بحجم مستعمرة كمؤشر للجودة تجمع الخلايا، والمزيد من المتوسطة (2-5 ملم) وكبيرة (> 5 ملم) ظهرت مستعمرات على لوحات المصنفة من الجلطات مقارنة CFU من الرواشح (الشكل 2C). وهذا يدل عموما أن اللجان الدائمة تنمو بشكل طبيعي بعد العلاج يوروكيناز. أيضا في مجموع المباراتين، مقارنة عينات الكلاب هضمها (ن = 21) لعينات من دون تجلط (ن = 7) أسفرت عن أعداد مماثلة من إجمالي اللجان الدائمة للعينات المعالجة، على الرغم من أن لوحظ وجود تباين بين عينة كبيرة بسبب السكان المانحة غير متجانسة (الشكل2D).
كاختبار عملي الأخير من صلاحيتها، ونحن بفعل التمايز من اللجان الدائمة المستمدة من هضمها عينات نخاع العظام. وتعتمد هذه التطبيقات في ذاتي علاجات الخلايا الجذعية على MSC التمايز في الغضروف والعظم أو الأنسجة الدهنية أو MSC نظير الصماوي يشير 18. يمكن الاسترشاد الخلايا نحو المسار المطلوب للتمايز عن طريق اختيار الظروف الملائمة لزراعة التمايز مكون الشحم 19، والتمايز عظمي المنشأ 20 أو النسب مكون للغضروف 17. وبالتالي، فإننا مقارنة اللجان الدائمة من نخاع العظام لجلطة اللجان الدائمة المستمدة من unclotted عينة نخاع العظام. بعد أربعة أسابيع في الثقافة، وكان من الممكن أن نفرق اللجان الدائمة في جميع الأنساب الثلاث المذكورة أعلاه. تم اختبار هذا تشريحيا مع فون كوسا (لنسب عظمي المنشأ)، النفط الأحمر O (مكون الشحم) والألسيان الأزرق (مكون للغضروف) stainings، والتي تبين عدم وجود فروق في درجة التمايز بين المجموعات ( 
الشكل 1. العظام نخاع جلطات. النسبة المئوية للعينات الكلاب ونخاع العظم البشري في الدولة متخدر جزئيا لدى وصوله (A). وعلاوة على ذلك، وجدنا أن عائدات MSC من عينات متخدر خفضت بشدة نظرا لارتفاع عدد خلايا محاصرين داخل جلطات. موجودة داخل جلطات كما يتبين من دابي تلطيخ لcryosection من نخاع العظام تجلط الكلاب (B) وهناك عدد كبير من خلايا الأنوية. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. 
الشكل 2. عزل اللجان الدائمة من جلطات نخاع العظم يتفاعل مع يوروكيناز. (A) عادة، جلطات نخاع العظام تختفي تماما تقريبا على يوروكيناز هضم.على التنمية الطريقة، قمنا بتقييم أوزان تجلط للكلاب (ن = 5، يعني ± SD، ** ع ≤0.01) والعينات البشرية (ن = 3، يعني ± SD، نانوثانية = لا ص كبير = 0.10) والتي خفضت بشدة على يوروكيناز هضم. (B) مقايسة CFU بسيط يمكن أن تكون بمثابة أداة إعلامية لتقييم نوعية لإعداد MSC. لتقييم فعالية هضم، تم إجراء فحص CFU لالرواشح وجلطات هضم من شفاطات نخاع العظم بشكل منفصل. بعد أسبوعين في الثقافة، وكانت ملطخة 10 لوحات تحكم سم مع بالغيمزا واحصي CFU. وأكد الفحص أن ارتفاع عدد CFU يمكن الإفراج عن الجلطة التي كتبها يوروكيناز الهضم وتظل وظيفية. ويؤكد هذا أيضا من وتيرة عالية من مستعمرات كبيرة (الدرجة الدرجة:> 5 مم في الأسود، 2-5 ملم في الرمادي الداكن و<2 مم في الرمادي الفاتح أشرطة الخطأ تمثل SD من إجمالي كفو (ن = 5 لكلب ، ن = 3 للإنسان، ** ع ≤0.01، نانوثانية = ليس كبيرا، ص = 0.17). (C) صورةالصورة من لوحات بالغيمزا الملطخة تأكيد النتائج معروضة. لوحات تعرض لجلطة هضم تتوافق مع نتيجة نموذجية لعينة نخاع العظم هضمها - ومع ذلك، يمكن أرقام تختلف إلى حد كبير بسبب تقلب المانحة. (D) في مجموع، وتطبيق يوروكيناز هضم بروتوكول (ن = 21) النتائج في مقارنة إجمالي عائدات MSC بعد ثقافة التوسع على تجلط طبيعي عينات مجانية (ن = 7، يعني ± SD). تم إجراء التحليل الإحصائي لكامل الشكل 2 باستخدام الطالب ر -test. 
تم التفريق بين الشكل 3. مقارنة بين إمكانات تمايز هضمها مقابل عينات unclotted أصلا. اللجان الدائمة الكلاب معزولة عن نخاع العظام متخدر تعامل مع يوروكيناز (الصف العلوي) ونخاع العظام unclotted (الصف السفلي) في النمط الظاهري عظمي المنشأ وملطخة التي كتبها فون كوسا (شريط =200 ميكرون)، كانت ملطخة النمط الظاهري مكون الشحم من قبل النفط الأحمر O (بار = 100 ميكرون، في إدراجات التكبير أكبر من فجوات الدهون)، في حين تم الكشف عن تكون الغضروف عن طريق تلطيخ الأزرق الألسيان (شريط = 100 ميكرون، counterstaining الأحمر سريع النووي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عادة نحن عينة نخاع العظام في حين أن المريض يخضع لعملية جراحية (في حالتنا جراحة العمود الفقري في المقام الأول)، مع ميزة أن ليس لديها سوى عمل إضافي قليلا إلى أن تتم من قبل أفراد في غرفة العمليات. على الرغم من أن عينات مختلطة مع سترات الصوديوم مباشرة بعد الانسحاب، كان العديد من عينات متخدر جزئيا عندما وصلوا في المختبر للمعالجة. في هذه المرحلة، فإن اختزال لاستبدال العينات متخدر يكون تدخل إضافي منفصل استلزم مرة أخرى التخدير الموضعي أو العام 6. وهذا يتطلب استعداد كل من الكادر الطبي والجهة المانحة للمساهمة وتستهلك الكثير من الموارد 21.
هنا نقدم البروتوكول الذي يستخدم يوروكيناز البشري المؤتلف على متخدر عينات نخاع العظم لعزل اللجان الدائمة متعدد القدرات. نحن يمكن أن تثبت أن العلاج يوروكيناز لا تضر الخلايا ويتم الاحتفاظ إمكانية التمايز. بروتوكولهو باختصار لأنه يطيل تجهيز العينات فقط ما يقرب من 1 ساعة ونصف بالمقارنة مع عينات unclotted بينما العائد حمامات خلية قابلة للمقارنة. حتى الآن، وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على جلطات نخاع العظم من الأفراد والكلاب مختلفة باستخدام يوروكيناز من الكثير عدة وأظهر نجاح قوية وقابلة للتكرار. وبصرف النظر عن هذا، يوروكيناز يتصرف بشكل غير مباشر عن طريق تفعيل عينة الجوهرية منشط. وهذا يعني أن رد فعل يوروكيناز يتطلب البلازما للبيئة. ولذا فمن غير المستصوب لتقديم خطوات الشطف جلطة أو على حد سواء مع مثل برنامج تلفزيوني. هذا من شأنه أن يخفف من البيئة المصل وتؤدي إلى تباطؤ كبير من رد فعل الأنزيمية.
قرار استخدام يوروكيناز لدينا وسيلة وليس دواء آخر التخثر تافهة: قمنا بتطوير بروتوكول بناء على المخدرات التخثر متوفرة لدينا في صيدلية المستشفى. للمجموعات بحثية أخرى، ولذلك قد يكون من الأسهل استخدام الأنسجة الطباعالبريد منشط منشط (أي.، وهو منتج المخدرات المختلفة مثل alteplase، reteplase أو tenecteplase) إذا يوروكيناز غير متوفر. ومع ذلك، فإن الاختلافات المهمة المحتملة بين الأدوية موجودة: على عكس الأنسجة من نوع المنشطات منشط، ويمكن يوروكيناز يؤدي تنشيط الخلايا وانتشار عندما منضمة إلى يوروكيناز من نوع منشط منشط مستقبلات (uPAR) 22. على ملزمة، يتم تنشيط شلالات الإشارات بين الخلايا التي تؤدي إلى الهجرة الخلية والانتشار. في هذه الحالة الفسيولوجية هذا مما يدعم إفراز مصفوفة metalloproteinases من قبل خلايا تفعيلها. ومع ذلك، في نظامنا، وتضعف يوروكيناز وإزالتها تدريجيا على الثقافة التوسع دون أن تظهر آثار ضارة. ومع ذلك، فيما يتعلق الاستخدام المقصود من اللجان الدائمة معزولة، ومدى ملاءمة من أي من الأدوية الحالة للخثرة تحتاج إلى أن تحدد بشكل فردي.
عموما، ينصح جرعات عالية للتجلط سريعة وكاملة هضم إلى minimize اختيار غير المرغوب فيها أثناء معالجة الجلطة. استخدمت الجدير بالذكر أن العديد من الدراسات السابقة ستربتوكيناز البكتيرية لهضم الدم ونخاع العظام جلطات 13،14. ومع ذلك، هذا الدواء قد تثير تفعيل غير المرغوب فيها واستجابة النظام المناعي، والذي قد يكون العيب الرئيسي خصوصا عندما يكون القصد تطبيق خلايا للمرضى.
ولذلك نعتقد أن لدينا بروتوكول لا يساعد الباحثين والمهنيين الطبيين فقط لتوفير الوقت وتقليل التكاليف. باستخدام يوروكيناز - عقار الأنزيمية وافق دون استضداد المعروفة - قد حتى توفير أداة قيمة للعديد من مختبرات الأبحاث متعدية تهدف إلى الاستخدام العلاجي للالاستعدادات MSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
