Introduction
Mesenkymala stamceller (MSCs) spelar en viktig roll i regenerativ medicin och vävnadsteknik. De kan migrera, differentiera till olika celltyper 1 och ympas, vilket gör dem idealiska kandidater för autologa terapier 2,3. På senare kliniska prövningar med MSCs för ben- och broskreparation, var transplantat kontra värd-sjukdom eller hjärtsjukdom lanseras 4. Dessa MSCs kan skördas från navelsträngen eller fettvävnad, men mest lovande resultat erhölls från benmärg härledda stamceller fem.
Höftbenskammen medger att samla in en avsevärd mängd av benmärg och tjänar därför som huvudsida för aspiration 6. Emellertid kvaliteten på aspirera minskar med ökande volym av benmärg kallas. Medan de första 5 ml benmärgsaspirat innehåller MSCs av hög kvalitet, indragning av större volymer leder till utspädning av aspirera med perifert blod from den mycket vaskulariserad benet 7. På grund av de föreliggande megakaryocyter och blodplättar, benmärgsaspirat är benägna att koagulering, såvida antikoagulanter användes. Men även med antikoagulantia, kan blodproppar uppstå.
I benmärg, MSC bara utgör en liten del av den totala cellpoolen 8 och måste byggas ut i kultur för de flesta vävnadsteknik eller terapeutiska tillämpningar 4. Kvaliteten på en sådan kultur i stor utsträckning beror på den initiala cellpoolen, dvs., Mångfald och ett högt start nummer 9. Lågt antal MSCs från uttag kan delvis förklaras av givar variabilitet. Å andra sidan, MSC från kvalitetsprover låga kräver längre tid i kultur och utvidgas passage för att nå det önskade antalet celler. I båda fallen är förlängt aging en källa till cellåldrande och kan leda till förlust av differentiering potential 10. Därför optimerade protokoll som kan maximera cell yield och hindra från skadliga effekter måste utvecklas 11,12.
När vi började arbeta med hund MSCs, var vi förvånade över att se att ungefär tre av fyra hund benmärgsprov innehöll proppar, medan lyckligtvis clotted humana prover (en av tio) var mindre frekvent. Å andra sidan var det ingen överraskning att vi observerade mycket lägre utbyten av MSCs från koagulerade prov. För att lösa det återkommande problemet med koagulerade prov, utvecklade vi protokollet använder trombolytisk läkemedels urokinas istället för omsampling.
Trombolytiska terapier kan motverka livshotande situationer som ocklusion av blodkärl som orsakar hjärtinfarkt, stroke eller proppar på grund av oönskad koagulering. De fungerar genom nedbrytning av blodproppar genom enzymatisk klyvning av fibrin genom plasmin och enzymatisk plasminogenaktivatorer. Trots den utbredda användningen för behandling av patienter, finns endast ett fåtal publikationer som utnyttjad trombolytiska aktiviteterför laboratorieapplikationer att rädda koagulerade prov, mestadels fokuserar på lymfocyter. År 1987 Niku et al. beskrev användningen av streptokinas för upplösning av blodproppar som leder till funktionella lymfocyter 13 och fyra år senare, De Vis et al. utvidgat användningen av streptokinas för att isolera leukemiceller från blod och benmärg för flödescytometriska applikationer 14. Det finns en nyare publikation föreslår användning av Alteplas för cancerdiagnostik 15. När du använder samma enzymatiska tillvägagångssätt fokuserar våra protokoll på isoleringen av multipotenta MSC formulär benmärg för att ge ett verktyg för forskare inom stamcellsområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Mänskliga benmärgsaspirat från höftbenskammen samlades från samtyckande donatorer med godkännande av den etiska kommittén i kantonen Luzern. Canine benmärgsaspirat från höftbenskammen samlades in med hund ägarens consent.Human (ung. 20 ml) och hund (ung. 10 ml) benmärgsaspirat var anti-koaguleras genom tillsats av 15 ml av 3,8% natriumcitrat, omedelbart efter tillbakadragande i operationssalen. Proverna överfördes till laboratoriemiljö för att bearbeta samma dag som återkallat.
1. Beredning av urokinas (Före 1 st Användning)
- Bered urokinas med användning av steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i enlighet med tillverkarens instruktioner: Tillsätt 10 ml PBS till septum-inlopp kolv med användning av en 10 ml spruta. Lös torrsubstans genom att snurra för att erhålla 50.000 injektions enheter (U) per ml.
- Förbered 500 l alikvoter (25.000 U vardera) i sterile rör. Förvara portioner -20 ° C och använda den vid behov i minst 6 månader.
2. Preparativa Steps (Före varje benmärgs Treatment)
- Tina en alikvot av urokinas (25.000 U) per clotted benmärgsaspirat (aspirera volymer upp till 25 ml har framgångsrikt behandlats med en enda portion av 25.000 U).
- Värm ett vattenbad eller skakinkubator till 37 ° C.
3. Enzymatisk Digest av Clot
- Utför allt arbete i ett laminärt flöde biosäkerhet skåp för att undvika mikrobiell kontaminering av benmärgsprov under bearbetning. När du arbetar med potentiellt smitt mänskligt material, är användningen av skyddshandskar samt försiktig hantering rekommenderas.
- Placera en 100 | im cellfilter ovanpå ett sterilt 50 ml rör. Häll försiktigt av benmärgsaspirat genom cellen sil, luta sil eller röra runt om koagel materialet. Använd en steril pipettspets förbättre flöde genom filternätet.
OBS: Undvik någon utspädning av koagel, t.ex. genom att tvätta proppen med PBS. Urokinas agerar indirekt och kräver komponenter i serum (dvs., Plasminogen) från biopsi för effektiv digest. Medan fortsätta förfarandet med koaglet materialet, kan filtratet hållas vid RT tills vidare användning i steg 3.6. - Överför benmärgen koagulera material i en tom cell odlingsskål med sterila pincett. Skär skräp i små bitar på ca 2 mm 3 med användning av en steril skalpell.
- Överför de små bitar av koaglet i en 50 ml reaktionsröret med användning av de steril pincett. Se till att malet koagel har en våt utseende. Om det verkar vara torrt, använda en del av filtratet från steg 3.1 att fukta.
- Mal sönder koagel genom att pipettera upp och ned för 5 gånger med en 5 ml mikro pipett. Tillsätt 1 portion av urokinas till provet. Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C antingen i ett vattenbad eller ien skakande (försiktigt) inkubator.
- Finfördela genom att pipettera upp och ned för 5 gånger med en 5 ml pipett. Utför detta steg i en biosäkerhet skåp. Inkubera i ytterligare 30 min vid 37 ° C. Efter inkubation, finfördela igen 5 gånger med hjälp av en 5 ml pipett. Passera över en fräsch 100 ìm cell sil till pool med filtratet från steg 3.2.
- Centrifugera cellsuspensionen vid omgivande temperatur under 10 min vid 500 x g. Kassera supernatanten. Återuppslamma cellpelleten i media enligt nedan eller enligt standardförfarandet för ditt laboratorium för MSC expansionskultur.
4. Seedning för Expansion Cell Culture och CFU Plattor
- Resuspendera cellerna (bestående av erytrocyter och mononukleära celler) i 50 ml basmedium: Alpha-MEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin och 2,5 mg / ml amfotericin B . Räkna celler späds 1:10 i trypanblått lösningen med en Neubauer chamber.
- Plate cellerna i cellodlingsflaskor vid en densitet av 5 x 10 7 celler / cm 2 och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 ° C. Om tillgängligt, använd hypoxiska (5% syre) förhållanden. För CFU analyskontroll, tallrik 10 9 celler i en cellkultur maträtt av 10 cm diameter.
- Efter tre dagars odling, är mesenkymala stamceller fäst till cellodlingsskål medan andra celler kvar i suspension. Ändra media med basalmedium kompletterat med 5 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF). För CFU analyskontroll, behandla cellodlingsskål likaså.
- Fortsätt cellodling för totalt 2 veckor, utbyta media tre gånger i veckan. Om cellerna överstiger 80% konfluens, dela med trypsinization. För CFU analyskontroll, utbyta media likaså, men inte dela cellerna för under de två veckorna.
5. Giemsa Stain för CFU analys
- Förbered 10 ml Giemsa-lösning per maträtt: dilute stamlösningen (7,6 g / l Giemsa i glycerol: metanol) 1:10 i sterilt vatten (alltid förbereda en ny arbetsutspädning).
- Ta bort materialet från cellkulturen skålen och tvätta cellerna med PBS. Var mycket precautious vid tillämpningen vätska till petriskål och undvika att tvätta bort cellerna.
- Fix celler i ren metanol under 5 min vid RT. Kassera metanolen. Till Giemsa-lösning och inkubera under 60 min i en fuktad inkubator vid 37 ° C.
- Tvätta två gånger med PBS. Lufttorka plattan huvudet först på en pappershandduk. Räkna kolonierna manuellt. Detta uppnås bäst med användning av en märkpenna på baksidan av plattan.
6. MSC-differentiering
- Canine MSCs differentiering
OBS: Canine MSCs differentierades i kondrogen, osteogen och adipogena härstamningar genom stimulering med rätt material i fyra veckor. - För Adipogena differentiering, kultur MSCs i monolager vid 4 x 10 5 cells / cm2 omväxlande två olika odlingsbetingelser enligt följande;
- Kulturen i adipogenes underhållsmedium innehållande DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 pg / ml amfotericin B och 170 mM insulin.
- Kulturen i adipogenes inducerande media med underhållsmedium kompletterat med 3% FBS, 5% kaninserum, 1 | iM dexametason, 500 pM 3-isobutyl-1-metylxantin, 33 | iM biotin, 5 pM rosiglitazon och 17 pM pantotenat 16.
- Revel lipiddropparna genom färgning med Oil Red-O. Kortfattat, fixa celler med 10% formaldehyd, tvätta med PBS och färgas med 0,35% Olja röd O i isopropanol.
- För Osteogen differentiering kultur MSCs i monolager vid 7 x 10 3 celler / cm2 och stimulerar i följande:
- Avancerad DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 pg / ml amfotericin B, 501; M L-askorbinsyra 2-fosfat, 10 mM p-glycerofosfat och 100 nM dexametason.
- Identifiera mineraliserings insättningar av Von Kossa fläcken (5% AgNOs 3). Kortfattat, fixera cellerna med 10% formaldehyd, tvätta med PBS och fläcken med 5% AgNOs 3 i destillerat vatten.
- Kondrogen differentiering
- Cut kuber (3 mm per sida) från en svamp formad medicinsk anordning, som utgörs av lyofiliserat kollagen typ I, och används som byggnadsställningsmaterial för att stödja celler 17.
- Seed MSCs på ovansidan av kuberna vid koncentrationen 4 x 10 6 celler / ml (~ 70.000 celler / kub).
- Före tillsatsen av medierna, tillåta cellerna att vidhäfta till kuberna i 30 min.
- Bibehåll MSC-kollagenkonstruktioner i kondrogen medier bestående av DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 pg / ml amfotericin B, 40 ng / ml dexametason, 50 ug / ml askorbinsyra syra 2-fosfat,50 | ig / ml L-prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selenium X, och 10 ng / ml transformerande tillväxtfaktor-β1.
- Använd alcianblått färgning att visualisera ackumulering av proteoglykaner i konstruerar sektioner. Kortfattat, färga sektionerna O / N med 0,4% alcianblått löst i 0,01% H 2 SO 4 och 0,5 M guanidinhydroklorid. Därefter fick tvätta sektionerna tvättas i 30 min i 40% DMSO och 0,05 M MgCl2. Celler motfärgades med kärn snabbt rött.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fakta som 74% av hundbenmärgsprov (n = 54) innehöll proppar när de kom i vårt laboratorium (Figur 1A) tillsammans med minskad MSC avkastningen från dessa prover, gjorde oss att tro att ett betydande antal MSC fångades inom proppar . Faktum en enkel DAPI-fläck av sektion koagel material bekräftar närvaron av kärnförsedda celler i hög densitet (Figur 1B). Detta leder slutligen till låga antalet MSCs tillgängliga för expansion kultur, vilket utlöste oss att utveckla protokollet använder urokinas. Typiskt koagulerar vinner nästan helt när de tillämpar våra protokoll. Under metodutveckling vi upp frågan om koagulera smälta systematiskt genom vägning före och efter sammandraget. Dessa experiment visade att de osmälta resterna var 15% (hund) eller 9% (människa) av den ursprungliga koagel vikten (Figur 2A).
Typiskt för benmärg härrör MSC är enlighet att vidhäfta till cellodlingsskålar. Forskare använder sig av denna egenskap för att selektera för MSC. Som en konsekvens, en kolonibildande analysen möjliggör att utvärdera kvaliteten av cell poolen i en enkel, kvantitativ och tillförlitligt sätt. I vårt laboratorium har kolonibildande analys som beskrivs häri tillämpats rutinmässigt på alla benmärgsprov bearbetade (även icke-koagulerade sådana). Detta tillät oss att använda analysen som huvudkriterium för att fastställa effektiviteten av urokinas digest. För att möjliggöra direkt jämförelse, celler från koagulerat prov filtrat (dvs som om koagulerade prov var bara filtrerades men inte enzymatiskt behandlade) och digererades proppar såddes på separata 10 cm skålar följt av inkubation under två veckor. När visualisera kolonibildande enheter (CFU) med Giemsa-färg (såsom visas i fig 2B), observerade vi 3,8 gånger mer CFU från urokinas reaktioner av canine prover än från motsvarande initiala filtraten (figur 2C). ALTHgrundlig mindre framträdande, mänskliga prover följde en liknande trend med 1,6 gånger mer CFU från behandlade prover som bekräftar lämplighet protokollet. Faktum plattorna i rötas koagel illustreras i rätt rad i figur 2B motsvarar den typiska resultatet ses för ett samlingsprov. Dock får donatorvariation lätt resultera i CFU siffror från halva fördubblas om vad som avbildas.
Med kolonin-storlek som indikator på cellpoolkvalitet, mer medium (2-5 mm) och stora (> 5 mm) kolonier uppträdde på plattorna seedade från proppar jämfört med CFU från filtrat (figur 2C). Detta indikerar generellt att MSC växer normalt efter urokinas behandling. Också i den sammanlagda, jämförelse av rötas hund prover (n = 21) till prover utan koagulera (n = 7) gav jämförbara antal totala MSCs för behandlade prover, även om en stor inter prov variation observerades på grund av den heterogena givarpopulationen (Figur2D).
Som en sista funktionstest av lämplighet, inducerade vi differentiering av MSCs härrör från rötas benmärgsprov. Tillämpningar inom autologa stamcellsterapi är baserade på MSC differentiering till brosk, ben eller fettvävnad eller MSC parakrint signalering 18. Celler kan styras mot den önskade vägen för differentiering genom att välja lämpliga odlingsbetingelser för adipogena differentiering 19, osteogent differentiering 20 eller kondrogen härstamning 17. Därför jämförde vi MSC från benmärg koagel till MSC härrör från tillsats av antikoagulans benmärgsprov. Efter fyra veckor i odling, var det möjligt att differentiera MSCs i alla tre ovan nämnda linjerna. Detta var histologiskt testats med Von Kossa (för osteogena linjen), Olja Red O (adipogena) och Alcian Blue (kondrogena) färgningar, visar inga skillnader i graden av differentiering mellan grupperna ( 
Figur 1. Benmärgsproppar. Andel hund- och humanbenmärgsprov i delvis clotted tillstånd vid ankomst (A). Vidare fann vi att MSC avkastningen från koagulerade prov var starkt reducerad på grund av ett stort antal celler fångade inom proppar. Ett stort antal kärnförsedda celler är närvarande inom proppar vilket framgår av DAPI-färgning av en kryosektion från en hund benmärg koagel (B). Skala stapel representerar 200 nm. 
Figur 2. Isolering av MSCs från benmärgsproppar rötas med urokinas. (A) Normalt benmärgsproppar vinner nästan helt när urokinas digest.Vid metodutveckling, bedömde vi koagulera vikter för hund (n = 5, medelvärde ± SD, ** p ≤0.01) och mänskliga prover (n = 3, medelvärde ± SD, ns = ej signifikant p = 0,10) som var starkt reducerad på urokinas digerering. (B) En enkel CFU-analys kan fungera som en informativ verktyg för att bedöma kvaliteten på en MSC preparat. För att bedöma effekten av digest ades CFU-analysen utförs för filtrat och digerproppar från benmärgsaspirat separat. Efter två veckor i odling, var 10 cm kontrollplattor färgades med Giemsa och CFU räknades. Analysen bekräftade att högt antal CFU kan frigöras från koagler genom urokinas smälta och vara funktionella. Detta bekräftas också av den höga frekvensen av stora kolonier (klass-division:.> 5 mm i svart, 2-5 mm i mörkgrått och <2 mm i ljusgrå Felstaplar representerar SD total CFU (n = 5 för hund , n = 3 för människa, ** p ≤0.01, ns = ej signifikant, p = 0,17). (C) Bilds från Giemsa-färgade plattor bekräftar de resultat som visas. Plattorna som visas för smält koagel motsvarar ett typiskt resultat för en rötas benmärgsprov - kan dock siffrorna varierar i hög grad beroende på givar variabilitet. (D) I summan, tillämpa urokinaset smälta protokollet (n = 21) resulterar i jämförbara total MSC avkastning efter expansion kultur att naturligt koagulera gratisprover (n = 7, medelvärde ± SD). Statistisk analys för hela Figur 2 utfördes med användning av Students t-test. 
Figur 3. Jämförelse av differentiering potential rötas kontra native tillsats av antikoagulans prover. Canine MSC isolerade från clotted benmärg behandlad med Urokinas (övre raden) och tillsats av antikoagulans benmärg (nedersta raden) differentierades i osteogen fenotyp och färgas av Von Kossa (bar =200 nm), var adipogena fenotyp färgas av Olja Red O (bar = 100 nm, i inläggningar större förstoring av fett vakuoler), medan kondrogenes avslöjades av Alcian blue-färgning (bar = 100 nm; motfärgning kärn snabbt röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rutinmässigt vi prov benmärg medan patienten genomgår operation (i vårt fall främst ryggkirurgi), med fördelen att endast lite extra arbete måste utföras av personalen i operationssalen. Även om proverna blandas med natriumcitrat omedelbart efter tillbakadragande, många prover var delvis clotted när de kom i laboratoriet för bearbetning. I detta skede skulle omsampling att ersätta koagulerade prover vara en separat tilläggs ingripande nödvändiggör igen lokala eller narkos 6. Detta kräver vilja både den kliniska personalen och givaren att bidra och förbrukar mycket resurser 21.
Här ger vi ett protokoll som använder rekombinant humant urokinas på clotted benmärgsprov för att isolera multi MSC. Vi kunde visa att urokinas behandlingen inte skadar cellerna och differentiering potentialen bibehålls. Protokolletär kort eftersom det förlänger prov behandling endast med ca 1 ½ timme jämfört med tillsats av antikoagulans prover samtidigt ger jämförbara cellpooler. Hittills har detta protokoll med framgång tillämpats på benmärgsproppar från olika individer och hundar som använder urokinas från flera partier och har visat robust och reproducerbar framgång. Bortsett från detta, verkar urokinas indirekt via aktivering av prov-inneboende plasminogen. Detta innebär att urokinas reaktionen kräver plasma-miljö. Det är därför inte tillrådligt att införa åtgärder för blodpropp sköljning eller lika med t.ex. PBS. Detta skulle späda serumet miljön och leda till en betydande nedgång i den enzymatiska reaktionen.
Beslutet att använda urokinas för vår metod och inte en annan trombolytisk drogen var trivial: vi utvecklat protokollet bygger på trombolytisk drogen lätt tillgängliga i vår sjukhusapotek. För andra forskargrupper kan det därför vara lättare att använda en vävnads type plasminogenaktivator (dvs., ett annat läkemedel produkt som alteplas, reteplas eller tenecteplas) om urokinas är inte tillgänglig. Emellertid potentiellt viktiga skillnader mellan drogerna existerar: till skillnad vävnadstyp plasminogenaktivatorer kan urokinas utlösa cellaktivering och proliferation när bundet till urokinas-typ-plasminogenaktivator receptor (uPAR) 22. Vid bindning, är intracellulära signaleringskaskader aktiveras som leder till cellmigration och spridning. I en fysiologisk situation detta stöds ytterligare av utsöndringen av matrixmetalloproteinaser av aktiverade celler. Men i vårt system, är urokinas utspätt och gradvis avlägsnas vid expansion kultur utan att visa negativa effekter. Fortfarande, med avseende på den avsedda användningen av isolerade MSC behöver lämpligheten av någon av de trombolytiska läkemedel som skall bestämmas individuellt.
Generellt är höga doser för snabb och fullständig koagel digest rekommenderas att minimize oönskad urval under koagel bearbetning. Uppmärksammade, många tidigare studier använt bakterie streptokinas för att smälta blod och benmärgsproppar 13,14. Emellertid kan detta läkemedel framkalla oönskad aktivering och reaktion av immunsystemet, vilket kan vara en stor nackdel i synnerhet när tillämpningen av celler till patienter är avsedd.
Vi tror därför att våra protokoll inte bara hjälpa forskare och sjukvårdspersonal för att spara tid och minska kostnaderna. Använda urokinas - ett godkänt enzymatisk läkemedel utan känd antigenicitet - kan även ge ett värdefullt verktyg för många translationforskningslaboratorier som syftar till terapeutisk användning av MSC preparat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basal Medium Components | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| Adipogenic Medium Components | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantothenate | Sigma | P5155 | |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 | |
| Osteogenic Medium Components | |||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Chondrogenic Medium Components | |||
| Biopad - sponge shaped medical device | Euroresearch | ||
| L-proline | Sigma | P5607 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 | |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Generic | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 | |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 | |
| Consumables | |||
| 50 ml reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml syringe | Braun | 4606108V | |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| cell culture flask - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Equipment | |||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 | |
| water bath | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
