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Cerebro Imaging Source en modelos preclínicos de la rata de la epilepsia focal usando de alta resolución EEG Grabaciones

doi: 10.3791/52700 Published: June 6, 2015

Protocol

Declaración de Ética: Todos los experimentos se llevan a cabo siguiendo las políticas establecidas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Internacional de la Florida (IACUC 13-004).

1. EEG Grabaciones

  1. Preparación de la mini-cap EEG
    1. Sumergir las puntas de los electrodos de EEG mini-cap al menos 12 horas en agua destilada con cloruro de 0,2%. Enjuague el mini-cap EEG suavemente en agua destilada. Secar la tapa y los electrodos en el aire.
    2. Mix EEG pasta de electrodo con solución de NaCl al 0,9% en la proporción de volumen de 2: 1. Añadir una gota de azul de metileno, que le ayudará a visualizar la pasta de electrodo interior de los electrodos y en la piel. Tome la pasta mezclada en una jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa. Inyectar el gel en cada uno de los electrodos 32, llenándolos sin introducir burbujas de aire. Se recomienda para inyectar desde la parte inferior en lugar de la parte superior. Esto proporciona una mejor access a cada electrodo y reduce la posibilidad de que el gel se extienda.
    3. Encienda el EEG y sistema de grabación fisiológica, y abrir el software de grabación correspondiente en el equipo en uso.
  2. Animal preparación y la anestesia
    NOTA: la epilepsia crónica se ha creado usando un protocolo para la FCD 8 en ratas Wistar. El registro de EEG se llevaron a cabo en ratas Wistar adultas (8 semanas de edad, 300-400 g).
    1. Registre el peso de la rata en una hoja de experimento. Utilice esta información para calcular la dosis sedante (DEXDOMITOR 0,25 mg / kg). Inducir la anestesia en la rata con 5% de isoflurano y oxígeno al 100% (1 L / min a 14,7 psi).
    2. Después de recortar la cabeza de la rata, reducir isoflurano al 2% y mantenerla durante todo el ajuste de la mini-cap EEG. Comprobar reflejos ratas están ausentes (toe-pinch). Coloque la rata en una almohadilla térmica en el aparato estereotáxico mediante la fijación de los canales del oído medio de barras de los oídos. Asegúrese de que el cono de la nariz anestesia es seguro.
    3. Apejercer ungüento oftálmico lubricante a cada ojo.
    4. Afeitarse el cabello extra en la cabeza y las orejas de rata utilizando una navaja. Evite cualquier sangrado durante el afeitado.
      NOTA: Cualquier pelo a la izquierda en la piel producirá ruido en los registros de EEG. Frotar la piel de la rata con 90% de alcohol isopropílico para estimular los vasos sanguíneos y desengrasar la piel.
    5. Coloque un hisopo solución salina en el cuero cabelludo y se cubre completamente para mantener buena conductancia de la piel hasta que el mini-tapa de EEG está listo para ser colocado.
    6. Conectar la temperatura, la respiración, y tres sondas de plomo electrocardiograma. Tenga en cuenta que la temperatura se mide mediante una sonda rectal. Monitorear continuamente la fisiología de la rata durante los procedimientos de registro. Asegúrese de que la temperatura normal es de 37 ° C, rango de la respiración es 30 a 60 respiraciones por minuto, y la frecuencia cardíaca es de alrededor de 350 a 450 latidos por minuto.
  3. Procedimientos de grabación
    1. Retire el hisopo solución salina en el cuero cabelludo de la rata y colocar el preparado EEG mini-cap sobre su piel. Fije el mini-tapón con bandas de goma. Coloque una banda de goma en el lado frontal del cuero cabelludo, por lo general en frente de los ojos, y otra banda en la parte posterior del cuero cabelludo entre las orejas y cuello. Utilice un protector de plástico debajo del cuello para facilitar la respiración normal.
    2. Ponga una capa de pasta de electrodo de alta conductancia en ambos los electrodos de tierra y de referencia. Colóquelos en la respectiva oreja.
      NOTA: El electrodo de referencia se puede colocar posiblemente en otros lugares.
    3. Conecte el mini-tapa de EEG a los amplificadores y observar una vista previa de la mesa de trabajo para la impedancia de los electrodos. Compruebe el rendimiento de todos los electrodos. Para una grabación de alta calidad, asegúrese de que el valor de la impedancia está en el rango de 5 a 30 kW. Si hay algún electrodos ruidosos, proporcionar un mejor contacto con el cuero cabelludo por cualquiera de ellos se mueve dentro de la andamio hacia el cuero cabelludo o la inyección de más suavemente gel desde la parte superior del electrodo.
    4. Administrar DEXDOMITOR (0,25 mg / kg) intraperitoneally e inmediatamente reducir la tasa de isoflurano a 0%. Si la tasa de respiración no está dentro de 30 a 60 respiraciones por minuto gama, empezar a aumentar la tasa de isoflurano suavemente. No exceda el valor de 1% de isoflurano. Supervise este paso con cuidado porque la mezcla de isoflurano y DEXDOMITOR podría llevar a los animales a un estado crítico.
      NOTA: En el modelo preclínico de la epilepsia focal, isoflurano afecta IED, mientras que DEXDOMITOR no lo hace. Los sujetos menores de isoflurano tienen más débil propiedad epileptógena, es decir, relativamente menos IED pueden detectarse en comparación con otras condiciones 7,14. La dosis DEXDOMITOR es eficaz durante aproximadamente 2 hrs. Por lo tanto, para ahorrar el tiempo por su efecto, la preparación se lleva a cabo bajo el isoflurano.
    5. Llevar a cabo registros de EEG. Después de la grabación, marque las posiciones de los tres círculos que sobresalían de la mini-tapa de EEG en la parte superior de la piel mediante la inserción de un lápiz de color en su interior antes de la mini-tapa de EEG se retira. Utilizarlos como puntos de referencia para la RM co-Registro. Tome una fotografía de la cabeza de la rata, con los hitos. Coloque la rata hacia adentro de la jaula y su seguimiento hasta la recuperación completa del efecto de DEXDOMITOR.
      NOTA: En este experimento, se utilizó el rojo (color oponente a verde) de distinguir de las posiciones de los electrodos (verde). Sin embargo, se recomienda el uso de otros colores (púrpura / verde) si se observan pequeñas manchas hemorrágicas en la piel.

Figura 1
Figura 1. Un cuadro de la mini-cap EEG colocada en una rata en particular.

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2. Cerebro Imaging Source

  1. Clasificación de IED
    NOTA: La detección y clasificación IED se realiza utilizando los códigos de desarrollo propio en MATLAB basado en laestudio previo 15. Este software estará disponible a petición.
    1. Deseche canales ruidosos mediante la inspección visual de los trazadores de EEG. Eliminar artefactos EKG utilizando un método automático para la resta forma de onda periódica, que se basa en una plantilla y un análisis de correlación.
      NOTA: Por lo general, el experimentador que registró el EEG comparte la hoja experimental escrito para la información del canal malo observado basado en los valores de impedancia. Software para eliminar artefactos EKG estará también disponible a petición.
      Figura 2
      Figura 2. Un ejemplo de la traza EEG que muestra diferentes tipos de artefactos explosivos improvisados. El cuadro rojo indica un tipo de artefactos explosivos improvisados.
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    2. Aplicar un filtro de paso de banda con frecuencias de corte 3 - 150 Hz y una muescafiltro para eliminar la frecuencia de línea (60 Hz en general, y 50 Hz en algunos países) desconectado componente.
    3. Detectar dos tipos de IED (picos afilados y ondas). Espigas y afilados ondas constituyen grandes eventos eléctricos de 20 a 70 ms y 70 a 200 ms de duración respectivamente. Por lo tanto, después de aplicar un filtro de paso de banda respectivo (frecuencias de corte de 15 - 50 Hz para los picos e 5 - 15 Hz para Sharp-ondas), los IED se detectan sobre la base de umbrales de amplitud 15.
      NOTA: Los umbrales se ajustan automáticamente a 4σ como se sugiere en el estudio previo para la actividad multiunit 15. Aquí, σ es una desviación estándar estimada de la señal de paso de banda filtrada, σ = {mediana | señal filtrada | / 0,6745}.
    4. Sub-clasificar los picos afilados y ondas en diferentes grupos. Las características distintivas de los diferentes picos afilados y las ondas se extraen mediante transformada wavelet 15. Ellos son sub-clasifican en varios clústeres utilizando k-medias,y el número de conglomerados de K óptima se determina utilizando silueta.
    5. La media de los señales de sub-productos de la misma agrupación. Las señales del EEG promedio para cada sub-tipo IED serán utilizados para el análisis de fuente cerebro.
  2. Modelo de conductor de volumen
    NOTA: Para las siguientes secciones, el software de código abierto, Brainstorm 12, se utilizará con el atlas de resonancia magnética para ratas Wistar 9. Sin embargo, la resonancia magnética de rata individuo también se puede utilizar para generar el modelo de conductor de volumen si está disponible. La resonancia magnética atlas 9 se puede descargar en http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ . Este sitio web proporciona el atlas como formato NIfTI en la sección "Rata Wistar MRI Atlas", y puede ser accesible después de Registrarse. El software necesario para el pre-procesamiento se puede también encontrar en este sitio web.
    1. RM de entrada y la superficie del cerebro para el software 12.
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    2. Generar superficie de la cabeza con la configuración predeterminada.
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    3. Generar cuero cabelludo y el cráneo superficies interiores / exteriores sobre la base de la RM para el cálculo de campo plomo 12.
      NOTA: La resolución de los vértices influye en la exactitud de la fuente estimado, pero gran número de vértices resultados en alta complejidad computacional. Número recomendado de vértices de cada capa es 642 para una precisión aceptable con la complejidad computacional justo. El espesor del cráneo se puede comprobar a partir de la MRI, y en el caso de los atlas de resonancia magnética, que es de aproximadamente 1 mm. Después de insertar valores anteriores en el software, triángulo cara vértice correspondiente mallas para se creará cada superficie.
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    4. Compruebe la orientación y la ubicación de cada superficie con respecto a la MRI usando la opción de visualización. Modificar en consecuencia, si las superficies no son co-registrado 12.
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    5. El uso de la imagen de la cabeza de la rata adquirida en 1.3.5. co-registrar las posiciones de los 3 puntos de referencia (R1, R2 y R3) en la resonancia magnética. Utilice los puntos de la rejilla de los puntos de referencia como referencias a generate las posiciones de los electrodos como los electrodos se fijan en el cadalso (Figura 3B).
      Figura 3
      Figura foto de cabeza 3. (A) de la rata utiliza para obtener posiciones de los electrodos y (b) el diagrama EEG mini-cap con el sistema de coordenadas. Los puntos rojos en (A) indican los puntos de referencia mencionados en 1.3.5. que corresponden a los números rojos en (B). Además, las marcas verdes en (a) representan las posiciones de los electrodos 32, y que corresponden a los números azules en (B).
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    6. Generar N × 3 electrodo matriz de posición en base a los 3 puntos de referencia. Aquí, N es el número de canales (N = 32) y la columna representa el correspondiente x, y, y z valores de coordenadas.
      NOTA: El mini-cap EEG es un andamio rígido. Por lo tanto, una vez que se obtienen los 3 cuadrículas de referencia (R1, R2, y R3), la posición de los electrodos se ajustan automáticamente. El usuario sólo tendrá que redefinir los valores Z en una forma que el mini-cap se proyecta apropiadamente en el cuero cabelludo. Las rejillas de punto N se pueden numerar secuencialmente como se representa en números azules Figura 3B. El andamio estándar para el mini-cap EEG está disponible comercialmente (Tabla de Materiales). El software para la co-registro también está disponible para la comunidad.
    7. Introduzca el archivo de canal generada.
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    8. Visualizar y confirmar la ubicación de todos los electrodos. Modifique los electrodos fuera de lugar 12. El sistema de coordenadas final para el electrode posiciones deben coincidir con el sistema de coordenadas utilizado para las superficies antes mencionadas.
      NOTA: Las superficies creadas pueden ser inspeccionados visualmente en una resonancia magnética con la opción de visualización, Y luego, una superficie seleccionada se mostrarán como línea amarilla en la resonancia magnética "MRI registro Compruebe MRI registro / superficie.". Además, los 3 puntos de referencia y las 32 posiciones de los electrodos se pueden visualizar en la resonancia magnética mediante la selección de la opción de la caja de herramientas "de pantalla Sensores MRI Visor." Los lugares pueden ser inspeccionados visualmente mediante la comparación de las distribuciones basadas en ubicaciones de los ojos y los oídos de la rata ( la Figura 4).
      Figura 4
      Figura 4. atlas (A) RM con superficie co-registrado cerebro (línea amarilla), (B) el modelo conductor de volumen creado con las alineadas 32 ​​electrodos y 3 puntos de referencia (puntos rojos), y el atlas (C) de resonancia magnética con co-registrado árbitro rejilla rencia R1.
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  3. Brain Imaging Source
    1. Calcule la matriz campo plomo 13. Introducir los valores de conductividad que satisfacen la relación de la piel, el cráneo y cerebro como 1: 1/80: 1. obtener la matriz de campo plomo basado en el modelo de conductor de volumen y las posiciones de los electrodos creados en 2.2.
      NOTA: La caja de herramientas 12 ofrece la interfaz con el otro software para calcular BEM 10. Por lo tanto, sólo se requieren los valores de conductividad como entrada.
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    2. Entrada de las señales EEG promedio para cada subtipo IED almacenada en 2.1.4.
      "Src =" / files / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg "/>
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    3. Obtener solución sLORETA 13 basado en la matriz de plomo campo calculado y las señales de EEG de entrada. Al seleccionar la opción método de estimación de fuente, la solución inversa se ​​puede obtener 12.
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    4. Trazar las fuentes estimadas.

Representative Results

Una vez que todos los procedimientos se desarrollan adecuadamente, fuentes estimadas pueden ser visualizados en la superficie del cerebro del modelo pre-clínico. La figura 5 muestra las fuentes estimadas de un subtipo particular de picos (arriba) y afilados ondas (abajo) de IED. Además, la figura 6 muestra cómo cambia la distribución de la fuente en los marcos de tiempo secuenciales durante un establecimiento de convulsión. Estos resultados apoyan la capacidad de las metodologías propuestas para grabar de alta resolución EEG en ratas con epilepsia focal y para llevar a cabo análisis de la fuente usando el EEG registrado.

Visual 6

Figura 5. Estimación ubicaciones de origen cerebral de IED con respecto a diferentes grupos en espigas (arriba) y afilados ondas (abajo). (A) de series de tiempo, (B) topografía EEG, y (C) Corriente corticales agriaces. La evaluación se lleva a cabo en un momento específico marcado con una línea vertical roja en (A).
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Visual 6
Figura 6. fuentes cerebrales estimados durante las convulsiones. Los instantes de tiempo se marcan como líneas verticales rojas.
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Discussion

Una nueva metodología para registro multicanal no invasiva EEG en un modelo preclínico particular de epilepsia focal se describe. Los datos para los procedimientos de registro y análisis, con consejos experimentales específicos, se proporcionan. Hubo factores clave a tener en cuenta el logro de resultados exitosos. En primer lugar, para los registros de EEG, la obtención de señales de alta calidad es esencial. Viscosidad apropiada de la pasta de EEG se debe aplicar a cada electrodo durante la preparación mini-tapa, y la cabeza y el oído pelo de la rata debe ser eliminado completamente durante el afeitado. Cheque Impedancia es el paso más importante para confirmar la calidad de los registros de EEG. En segundo lugar, para la imagen de origen cerebral, generando el modelo conductor de volumen adecuado es crucial. Cada superficie se debe a registrar co. Además, las posiciones de los electrodos generados deben tener error de distancia mínima desde las ubicaciones de los electrodos reales sobre el cuero cabelludo de la rata.

A pesar de que este manuscrito introduce fuenteprocedimientos de análisis utilizando Brainstorm 12, pueden llevarse a cabo utilizando otros softwares abiertos 16,17 y productos comerciales 18,19. También, además de sLORETA 13, otras soluciones inversas como varios modelos de dipolo y Beamformer se pueden aplicar 4.

Una limitación de este enfoque es que el análisis del comportamiento no puede llevarse a cabo desde el registro del EEG se lleva a cabo bajo sedación. Sin embargo, en comparación con los otros métodos para la grabación de EEG en ratas 5,6, este enfoque no es invasiva.

Nuestros resultados preliminares apoyan la importancia para una clasificación precisa de los marcadores de IED de los registros de EEG para determinar las zonas irritativos en una rata con epilepsia focal, así como para evaluar su relación con los mecanismos subyacentes para la iniciación convulsión 11. Además, se ha demostrado que la localización de la fuente EEG para tales IEDs específicos mostró una buena correspondencia con el respactivación y desactivación regiones BOLD caces 20.

Nuestro estudio estimulará el uso de modelos preclínicos para evaluar las estrategias cama-banco-cama desarrollados por ingenieros biomédicos. Por ejemplo, la extracción de IED se realiza en la actualidad en los hospitales de forma manual, lo que requería un gran esfuerzo humano. La metodología propuesta en este estudio lo hace automáticamente. Se postula que el uso de esta metodología producirá resultados similares cuando se aplica a pacientes con FCD. Estamos preparando protocolos IRB para la evaluación de este y otros aspectos de la metodología en el conjunto de datos humano.

Por otra parte, el uso de modelos preclínicos nos ayudará a entender las capacidades y limitaciones de la localización de la fuente de EEG en la epilepsia 21. Estimación precisa de las fuentes cerebrales que subyacen a epileptogénesis es crucial para las estrategias terapéuticas y la planificación quirúrgica. Además, tener una plataforma estándar para la grabación de EEG en ratas será útil parala evaluación de la eficacia de varios fármacos anti-epilépticos en ensayos preclínicos. Este es el primer estudio en el que ratas epilépticas se registran de forma no invasiva bajo sedación, que abrirá nuevas puertas para la evaluación de los biomarcadores de EEG para epilepsia. Sin embargo, toda la metodología presentada en este estudio es extensible a otras condiciones experimentales y los trastornos cerebrales. El mini-cap EEG puede también ser utilizado en los tipos de otros roedores.

En el pasado, un paradigma de estimulación pata en ratas Wistar se ha utilizado para evaluar la calidad y reproducibilidad de los datos grabados con la mini-tapa EEG 2. Por otra parte, las validaciones para la reconstrucción de origen cerebral se han realizado a partir de alta resolución EEG cráneo simultáneamente grabado con potenciales de campo locales laminares de ratas Wistar bajo un paradigma de estimulación de la barba 22. Esta metodología ha sido desarrollada para ratas Wistar, debido a la existencia de un atlas de resonancia magnética para esta rata s particular,tren. Sin embargo, se puede aplicar a otros tipos de roedores con su formato estándar de atlas incluyendo ratón 23, ratas Sprague-Dawley, 24 y Paxinos y Watson ratas 25. Además, los procedimientos fundamentales de nuestra metodología propuesta podría ser utilizado en cualquiera de los modelos preclínicos de roedores para el que el EEG es una modalidad importante. Sin embargo, muchos aspectos de esta metodología son particularmente para la epilepsia, especialmente los relacionados con EEG preprocesamiento (detección y clasificación IED). Además, los investigadores deben estar al tanto de los medicamentos adecuados utilizados para la sedación en los distintos casos. El uso de isoflurano y DEXDOMITOR en nuestro estudio se ha considerado cuidadosamente debido al impacto reducido sobre IED. En cuanto a los registros de EEG, en el caso de ratón, el área relativamente pequeña superficie del cuero cabelludo reduciría el número de canales considerablemente.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Pedro A. Valdés Hernández, Francois Tadel, y Lloyd Smith por su valioso asesoramiento y debate fructífero. También queremos agradecer a Rafael Torres para la corrección de pruebas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Data Acquisition Computer Hewlett-Packard Z210 Workstation
Dexdomitor Orion Pharma 6295000 Dexmedetomidine hydrochloride
EEG Analysis Software The Mathworks Inc. MATLAB R2011b
Brainstorm Sylvain et al. 2001
OpenMEEG Gramfort et al. 2010
EEG Data Streamer Tucker-Davis Technologies RS4 Data Streamer
EEG Electrode Paste Biotach YGB 103
EEG Preamplifier BioSemi Active Two
Brain Products BrainAmp
Tucker-Davis Technologies PZ3 Low Impedance Amplifier
EEG Recording Software BioSemi ActiView
EEG Recording Software Tucker-Davis Technologies OpenEx - OpenDeveloper
EEG SCSI Connector BioSemi Active Two SCSI Connector
Brain Products D-sub Connector
EEG Processor Tucker-Davis Technologies RZ2 BioAmp Processor
Tucker-Davis Technologies Zif-Clif Digital Headstage
High Resolution EEG Mini-cap Cortech Solutions DA-AR-ELRCS32 US patent Application No. 13/641,834
Isoflurane, USP VedcoPiramal Healthcare NDC 66794-013-25
Isopropyl Alcohol Aqua Solutions 3112213 90% v/v solution
Lubricant Ophthalmic Ointment Rugby NDC 0536-6550-91 Sterile
NaCl Abbott 2B8203 Vaterinary 0.9% Sodium Chroride Injection USP
Physiology Recording Software ADInstruments LabChart 7.0
Physiology Recording System ADInstruments PowerLab 8/35
Syringe Monoject 200555 12cc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. J. Vis. Exp. (100), e52700, doi:10.3791/52700 (2015).More

Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. J. Vis. Exp. (100), e52700, doi:10.3791/52700 (2015).

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