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高解像度EEGレコーディングを使用して焦点てんかんの前臨床ラットモデルにおける脳ソースイメージング

doi: 10.3791/52700 Published: June 6, 2015

Protocol

倫理文:全ての実験は、フロリダ国際大学(IACUC 13から004)で施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって確立されたポリシーに従って実施されています。

1.脳波レコーディング

  1. EEGミニキャップの調製
    1. 脳波ミニキャップ0.2%塩化蒸留水で少なくとも12時間の電極チップを浸し。蒸留水に静かにEEGミニキャップをすすぎます。キャップと空気中の電極を乾燥させます。
    2. 2の体積比率で0.9%NaCl溶液と混合脳波電極ペースト:1.は、電極の内側と皮膚に電極ペーストを視覚化するのに役立ちますメチレンブルーの低下を、追加します。シリンジ内の混合ペーストしてください。シリンジ内に気泡がないことを確認してください。気泡を導入することなく、それらを充填、電極32のそれぞれにゲルを注入します。これは、下部ではなく上部から注入することをお勧めします。これは、より良いACCEを提供します各電極へのSSと波及ゲルの可能性を低減します。
    3. EEGおよび生理学的記録システムの電源を入れ、使用中のコンピュータに対応する記録ソフトウェアを開きます。
  2. 動物の準備と麻酔
    注:慢性てんかんは、ウィスターラットにFCD 8のプロトコルを使用して作成されました。脳波記録は( - 400グラム8週齢、300)は、成体ウィスターラットで行いました。
    1. 実験シートにラットの体重を記録します。鎮静剤の投与量(dexdomitor 0.25ミリグラム/キログラム)を計算するためにこの情報を使用してください。 5%イソフルランと酸素100%(14.7 psiで1 L /分)でラットに麻酔を誘導します。
    2. 後の2%にイソフルランを減少させ、脳波ミニキャップの全体の設定の間にそれを維持するため、ラットの頭をトリミング。ラットの反射が(つま先ピンチ)は存在しないか確認してください。耳のバーを使用して、外耳道を固定することで定位固定装置に加熱パッドの上にラットを置きます。麻酔ノーズコーンが安全であることを確認します。
    3. APそれぞれの目に潤滑油眼軟膏をプライ。
    4. カミソリを使用して、ラットの頭と耳に余分な毛を剃ります。シェービング中に出血を避けます。
      注:皮膚に残った毛は、EEG記録のノイズを生成します。血管を刺激し、皮膚を脱脂するために90%のイソプロピルアルコールでラットの皮膚をこします。
    5. 頭皮に生理食塩水の綿棒を置き、EEGミニキャップが配置される準備ができるまでは、良好な皮膚コンダクタンスを維持するためにそれを完全にカバーしています。
    6. 温度、呼吸、および3本のリード心電図プローブを接続します。温度を直腸プローブによって測定されることに注意してください。連続記録手順の間に、ラットの生理機能を監視します。毎分60回の呼吸、および心拍数は約350である - - 通常の温度は37℃であることを確認し、呼吸範囲は30で、毎分450拍。
  3. 記録手順
    1. ラットの頭皮に生理食塩水の綿棒を取り出して、準備された脳波ミニCを配置その皮膚上にp。ゴムバンド付きミニキャップを修正しました。通常、目の前で、頭皮の前面に1ゴムバンドを配置し、耳と首の間、頭皮の奥に別のバンド。正常な呼吸を容易にするために、首の下にプラスチック製のプロテクターを使用してください。
    2. グランドおよび基準電極の両方に高いコンダクタンス電極ペーストの層を置きます。それぞれの耳の上に置きます。
      注:基準電極は、おそらく他の位置に配置することができます。
    3. アンプに脳波ミニキャップを接続し、電極インピーダンスのためのワークベンチのプレビューを確認します。全ての電極の性能を確認してください。 30kΩの - 高品質の記録のために、インピーダンス値が5の範囲であることを確認してください。ノイズの多い電極がある場合は、電極の上からより多くのゲルを注入優しく頭皮に向けて足場の内側にそれらを動かすか、いずれかの方法で頭皮との良好な接触を提供します。
    4. dexdomitorの管理(0.25ミリグラム/ kg)をintraperitoneally、すぐに0%にイソフルラン率を低下させます。呼吸速度は30内にない場合 - 分範囲あたり60呼吸、穏やかイソフルラン速度を増加させる開始。 1%のイソフルランの値を超えないようにしてください。イソフルランとdexdomitorの混合物は、危険な状態に動物を促す可能性があるため、慎重にこの手順を監視します。
      注:dexdomitorにはないのに対し、焦点てんかんの前臨床モデルでは、イソフルランは、IED事件に影響を与えます。イソフルラン下の被験者は、すなわち、比較的少ないのIEDは、他の条件7,14に比べて検出することができ、より弱いてんかん性を有しています。 dexdomitor用量は、約2時間のために有効です。したがって、その効果のために時間を節約するために、調製物は、イソフルラン下で行いました。
    5. EEG記録を行っています。 EEGミニキャップが削除される前に記録した後、それらの内側にカラーペンを挿入することにより、皮膚の上にEEGミニキャップの3突き出円の位置をマークします。 MRI共同のための目印にしてください-registration。ランドマークでラットの頭部を撮影。バックケージの中にラットを置き、dexdomitorの影響から完全に回復するまで、それを監視します。
      注記:この実験では、赤色(緑色の反対色)が電極位置(緑)と区別するために使用しました。しかし、小出血斑が皮膚に認められた場合、他の色(紫/緑)を使用することをお勧めします。

図1
図1.特定のラット上に配置された脳波ミニキャップの絵。

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2.脳ソースイメージング

  1. IED分類
    注:IEDの検出と分類は、に基づいて、MATLABでの自己開発のコードを使用して実行されます以前の研究15。このソフトウェアは、リクエストにより利用できるようになります。
    1. 視覚脳波トレーサーを検査することにより、ノイズの多いチャンネルを破棄します。テンプレートとの相関分析に基づいて周期的波形の減算のための自動的な方法を用いてEKGの成果物を削除します。
      注:通常、脳波を記録した実験者は、インピーダンス値に基づいて、観察された不良チャンネル情報について書かれた実験シートを共有します。 EKGアーチファクトを除去するためのソフトウェアが要求によっても利用できるようになります。
      図2
      図2のIEDの種類を示す脳波のトレースの例。赤いボックスはのIEDの1種類を示します。
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    2. 150Hzのノッチ - 3のカットオフ周波数を有するバンドパスフィルタを適用しますライン周波数(一般的には60ヘルツと一部の国では50 Hz)でコンポーネントをオフラインを削除するには、フィルタ処理します。
    3. のIED(スパイク、鋭い波)の2種類を検出します。 70ミリ秒と70 - - それぞれ持続時間が200ミリ秒のスパイクとシャープな波は20の大電気的事象を構成しています。したがって、それぞれのバンドパスフィルタ(15のカットオフ周波数-スパイク50 Hzから5 -シャープ波15 Hz)を適用した後、のIEDは、振幅が15をしきい値に基づいて検出されます。
      注:マルチユニット活動15の以前の研究で示唆されているようにしきい値を自動的に4σに設定されています。 {|フィルタリングされた信号| / 0.6745}ここで、σは、σ=中央値 、バンドパス·フィルタ処理された信号の推定標準偏差です
    4. 異なるクラスタにスパイクと、鋭い波をサブ分類します。別のスパイクと、鋭い波の顕著な特徴は、15ウェーブレット変換用いて抽出されます。これらは、サブ分類されるk平均を使用して複数のクラスターに、最適なクラスタ数kは、シルエットを使用して決定されます。
    5. 同じクラスタ内のサブ分類の信号を平均化します。各IEDサブタイプに対する平均EEG信号は、脳源解析のために使用されます。
  2. 容積導体モデル
    注:以下のセクションでは、オープンソースソフトウェア、ブレーンストーミング12は 、Wistarラット9用のMRIアトラスと一緒に使用されます。しかし、個々のラットのMRIはまた、可能な場合は容積導体モデルを生成するために使用することができます。 MRIアトラス9がでダウンロードすることができhttp://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ 。このウェブサイトは、「ウィスターラットのMRIアトラス」セクションの下NIFTI形式としてアトラスを提供し、それは登録後アクセスすることができます。前処理のために必要なソフトウェアはまた、このウェブサイトで見つけることができます。
    1. ソフトウェア12への入力MRIと脳表面。
      ビジュアル1 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
    2. デフォルトの設定でヘッド面を生成します。
      ビジュアル2
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    3. リードフィールド計算12用のMRIに基づいて、頭皮と外側/内側の頭蓋骨の表面を生成します。
      注:頂点の解像度は、推定ソースの精度に影響を与えるが、頂点の数が多い高い計算の複雑性をもたらします。各層の頂点の推奨数は、公正、計算の複雑さと許容精度のための642です。頭蓋骨の厚さは、MRIで確認することができ、MRIアトラスの場合には約1mでありますM。ソフトウェア内の値の上に挿入した後、面と頂点が各面のために噛み合う対応する三角形が作成されます。
      ビジュアル3
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    4. 視覚化オプションを使用して、MRIに対する各面の向きと位置を確認してください。従って変更し、任意の面が12コ登録されていない場合。
      ビジュアル4
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    5. 1.3.5で取得されたラットの頭部画像を使用。 MRI 3ランドマーク(R1、R2、およびR3)の位置を同時登録します。 Gへの参照としてランドマークのグリッド点を使用して電極は、足場( 図3B)に固定されているように、電極位置をenerate。
      図3
      図3(A)ラット先頭ピクチャ座標系と電極位置と、(b)EEGミニキャップ図を得るために用いられます。 (A)中の赤い点は、1.3.5で述べたランドマークを示しています。これは、(B)の赤番号に対応しています。また、(A)の緑色のマークは、32電極位置を示している、と彼らは(B)中の青の番号に対応しています。
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    6. 3ランドマークに基づいて、N×3電極位置行列を生成します。ここで、Nは(N = 32)のチャネルの数であり、カラムは、対応するx、y及びz座標値を表します。
      注:EEGミニキャップが剛性の足場です。 3基準格子(R1、R2、及びR3)が得られるとしたがって、電極の位置が自動的に設定されています。ユーザは、ミニキャップが適切に頭皮上に投影されていることを途中でZ値を再定義する必要があります。 図3(b)青の数字で示されているようにN点のグリッドは、順番に番号が付けすることができます。 EEGミニキャップのための標準的な足場は、( 材料の表 )は、市販されています。同時登録のためのソフトウェアは、コミュニティに利用可能です。
    7. 入力生成されたチャンネルのファイル。
      ビジュアル5
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    8. 全ての電極の位置を表示して確認します。いずれかの見当違いの電極12を変更します。電気のための最終的な座標系デポジションは、上記の表面のために使用される座標系と一致する必要があります。
      注: "。MRI登録 MRI /表面登録を確認し、「作成した表面は、視覚的に可視化オプションを使用してMRIで検査することができ、そして、選択された表面は、MRI上に黄色の線で表示されます。また、3のランドマークと32の電極の位置は、ツールボックスのオプションを選択することによって、MRIに表示させることができる「センサー MRIビューアを表示します。」の場所は、視覚的にラットの眼と耳の位置に基づいて分布を比較することによって検査することができます( 図4)。
      図4
      図4.同時登録脳の表面に(A)のMRIアトラス(黄色の線)、(B)位置合わせ32の電極と3のランドマーク(赤い点)、および同時登録と(C)のMRIアトラスで作成されたボリュームの導体モデル参照レンス·グリッドR1。
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  3. 脳ソースイメージング
    1. リードフィールド行列13を計算します。入力1のように、皮膚、頭蓋骨、および脳の比率を満たす導電率値:1/80:1.容積導体モデルと2.2で作成した電極位置に基づいて、リードフィールド行列を取得します。
      注:ツールボックス12は、BEM 10を計算するために他のソフトウェアとのインターフェースを提供しています。したがって、唯一の導電率の値は、入力として必要とされます。
      ビジュアル6
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    2. 入力2.1.4に格納されている各IEDのサブタイプの平均EEG信号。
      「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg" />
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    3. 計算されたリードフィールド行列と入力EEG信号に基づいてsLORETA液13を得ます。光源推定方法のオプションを選択することにより、逆溶液が12を得ることができます。
      ビジュアル8
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    4. 推定ソースをプロットします。

Representative Results

一度すべての手順が正常に完了し、推定ソースが前臨床モデルの脳表面に可視化することができる。 図5は、IED事件からスパイク(上)とシャープな波(下)のいずれかの特定のサブタイプから推定ソースを示します。また、 図6のディスプレイ発作確立中に、順次時間枠でどのようにソース配布の変更。これらの結果は、焦点てんかんのラットに高解像​​度の脳波を記録すると、記録された脳波を使用してソース·分析を行うことが提案された方法論の機能をサポートしています。

ビジュアル6

図5は、(A)時系列、(B)脳波トポグラフィ。スパイクで異なるクラスタ(上)とシャープな波(下)に関してのIEDの脳源の位置を推定、(C)皮質電流サワーCES。評価は(A)における赤色の垂直線でマークされた特定の時間に実行されます。
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ビジュアル6
発作時の図6の推定脳源は。の時刻は赤の縦線としてマークされます。
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Discussion

焦点てんかんの特定の前臨床モデルにおいて、非侵襲的にレコードマルチチャンネル脳波への新しい方法が記載されています。記録および分析手順について詳細は、具体的な実験ヒントを、提供されています。成功した結果を達成する考慮すべき重要な要素がありました。まず、EEG記録のために、高品質の信号を得ることが不可欠です。 EEGペーストの適正粘度は、ミニキャップの準備中に、各電極に印加されるべきであり、ラットの頭と耳の毛が完全に剃り中に除去されるべきです。インピーダンスチェックは、EEG記録の品質を確認するための最も重要なステップです。第二に、脳のソース画像のための、適切な容積導体モデルを生成することは重要です。各表面は同時登録する必要があります。また、生成された電極位置は、ラットの頭皮上の実際の電極位置からの最小距離誤差を持っている必要があります。

この原稿は、ソースを紹介していてもブレーンストーミング12を用いた分析手順は、それらが他のオープンソフトウェア16,17市販品18,19を用いて行うことができます。また、sLORETA 13の他に、例えば、複数の双極子モデルとビームフォーマのような他の逆解は4に適用することできます。

このアプローチの1つの制限は、EEG記録を鎮静下で実施されるので、行動分析を行うことができないということです。しかし、ラット5,6におけるEEG記録のための他の方法に比べて、このアプローチは、非侵襲的です。

我々の予備的な結果は、焦点てんかんラットに刺激性のゾーンを決定するために、ならびに発作開始の11のための基礎となるメカニズムとの関係を評価するために、EEG記録からIEDマーカーの正確な分類のための重要性をサポートしています。さらに、そのような特定のIEDのためのEEG音源定位がRESPとの良好な一致を示したことが示されていますective BOLD活性化および非活性化領域20。

我々の研究は、生物医学のエンジニアによって開発されたベッドベンチベッド戦略を評価するための前臨床モデルの使用を促進します。例えば、IED抽出が最近かなりの人間の労力を必要とする、手動で、病院で行われます。本研究で提案した方法論は、これを自動的に実行します。私たちは、FCDの患者に適用された場合、この方法を使用すると、同様の結果が得られると仮定しました。私たちは、人間のデータセット内の方法論のこのおよび他の態様の評価のためにIRBプロトコルを準備しています。

また、前臨床モデルの使用は、私たちはてんかん21に脳波音源定位の能力と限界を理解するのに役立ちます。てんかんを下っ端脳源の正確な推定は、治療戦略と手術計画のために重要です。また、ラットにおけるEEG記録のための標準的なプラットフォームを有するために有用であろう前臨床試験のいくつかの抗てんかん薬の有効性の評価。これは、てんかん脳波バイオマーカーの評価のための新たな扉を開きますてんかんラットを鎮静下で非侵襲的に記録された最初の研究です。しかし、この研究で提示全体の方法論は、他の実験条件と脳障害に拡張可能です。 EEGミニキャップはまた、他の齧歯類の種で使用することができます。

過去には、Wistarラットにおける前足刺激パラダイムはEEGミニキャップ2に記録されたデータの品質と再現性を評価するために使用されてきました。また、脳のソース再建のための検証を同時にウィスカ刺激パラダイム22下のウィスターラットから層状ローカルフィールド電位を記録した高解像度の頭蓋骨のEEGから行われてきました。この方法は、このため、特定のラットのためのMRIアトラスの存在のウィスターラットのために開発されています列車。しかし、スプラーグドーリーラット24、及びPaxinosとWatsonのラットは25、マウス23などのアトラスの、標準フォーマットを有する他のげっ歯類型に適用することができます。また、提案手法の基本的な手順は、EEGが重要モダリティである任意のげっ歯類前臨床モデルで使用することができます。しかし、この方法論の多くの側面は、EEGの前処理(IED検出および分類)に関する特に、特にてんかんのためのものです。また、研究者が異なる場合には、鎮静のために使用される適切な薬剤を認識する必要があります。私たちの研究ではイソフルランとdexdomitorの使用は慎重に原因のIEDの減少への影響と考えられてきました。 EEG記録に関しては、マウスの場合には、比較的小さい頭皮の表面積が大幅にチャンネルの数を減少させるであろう。

Disclosures

利害の衝突は宣言されていません。

Acknowledgments

作者は彼らの貴重なアドバイスと実りの議論のためにペドロA.バルデスヘルナンデス、フランソワTadel、とロイド·スミスに感謝したいと思います。また、校正のためのラファエル·トーレスに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Data Acquisition Computer Hewlett-Packard Z210 Workstation
Dexdomitor Orion Pharma 6295000 Dexmedetomidine hydrochloride
EEG Analysis Software The Mathworks Inc. MATLAB R2011b
Brainstorm Sylvain et al. 2001
OpenMEEG Gramfort et al. 2010
EEG Data Streamer Tucker-Davis Technologies RS4 Data Streamer
EEG Electrode Paste Biotach YGB 103
EEG Preamplifier BioSemi Active Two
Brain Products BrainAmp
Tucker-Davis Technologies PZ3 Low Impedance Amplifier
EEG Recording Software BioSemi ActiView
EEG Recording Software Tucker-Davis Technologies OpenEx - OpenDeveloper
EEG SCSI Connector BioSemi Active Two SCSI Connector
Brain Products D-sub Connector
EEG Processor Tucker-Davis Technologies RZ2 BioAmp Processor
Tucker-Davis Technologies Zif-Clif Digital Headstage
High Resolution EEG Mini-cap Cortech Solutions DA-AR-ELRCS32 US patent Application No. 13/641,834
Isoflurane, USP VedcoPiramal Healthcare NDC 66794-013-25
Isopropyl Alcohol Aqua Solutions 3112213 90% v/v solution
Lubricant Ophthalmic Ointment Rugby NDC 0536-6550-91 Sterile
NaCl Abbott 2B8203 Vaterinary 0.9% Sodium Chroride Injection USP
Physiology Recording Software ADInstruments LabChart 7.0
Physiology Recording System ADInstruments PowerLab 8/35
Syringe Monoject 200555 12cc

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Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. J. Vis. Exp. (100), e52700, doi:10.3791/52700 (2015).More

Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. J. Vis. Exp. (100), e52700, doi:10.3791/52700 (2015).

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