Introduction
冷冻时植物生长活跃时发生的温度可以是致命的，特别是如果植物具有很少或没有冰冻耐受性。这样的事件霜冻往往会对农业生产造成破坏性影响，也可以在植物自然种群形成群落结构发挥了重要作用，特别是在高山，亚寒带和寒带生态系统1-6。严重的春季霜冻事件在最近几年7-9对水果生产在美国和南美洲的重大影响，并加剧了发病初期温暖的天气其次是较典型的平均气温低。早期的温暖的天气诱使芽突破，激活新枝，叶和花所有这些都很少无霜容忍1,3,10-12增长。这种变化无常的天气模式已经被报道正在发生的气候变化的直接反映，并预计将在FORES一个共同的天气模式eeable未来的13。努力提供经济，有效和环境友好的管理技术或农用化学品，可以提供增加的冰冻耐受性取得了有限的成功为宿主的原因，但是这可以部分地归因于耐冻性和冰冻避免机制在植物的复杂性。 14
霜存活于植物相关联的自适应机制已经传统上被分为两类，耐冻性和冰冻回避。前一类与由一组特定的基因是允许植物容忍与存在和冰在其组织的脱水作用有关的应力的调节生化机制相关联。而在后一类通常是，但不是唯一，与植物中的植物14结构方面确定是否，何时，何地冰形成有关。尽管冻结回避的患病率作为广告aptive机制，一些研究一直致力于在近期了解的底层机制和冻结规避监管。读者可以参考最近15检讨关于这个主题的更详细。
而形成的冰在低温下可能看起来像一个简单的过程中，许多因素有助于确定在哪些冰成核在植物组织和它如何在植物内扩散的温度。如外在和内在冰的存在下成核，异质与均相成核事件，热滞后（防冻剂）的蛋白质，具体糖和其它渗透剂的存在下，和一台主机的植物的结构方面参数都可以发挥显著在植物冷冻过程中的作用。总的来说，这些参数影响在哪个工厂结冰，冰的地方开始以及如何成长的温度。它们也可以影响所得冰晶体的形态。各种方法已被用于研究在植物冷冻过程在实验室条件，包括核磁共振谱（NMR）16，磁共振成像（MRI）17，冷冻显微镜18-19，和低温扫描电子显微镜下（LTSEM ）。20冻结在实验室和现场设置整株植物，然而，主要被监测热电偶。使用热电偶来研究冷冻的是基于热解放（熔化焓）当水经历从液体到固体的相变。冷冻，然后被记录作为一个放热事件。21-23即使热电偶是选择在研究中的植物冷冻的典型方法，它们的使用有很大的局限性，限制了冷冻事件期间所获得的信息的量。例如，用热电偶就很难几乎不可能确定在何处开始在植物中的冰，它是如何传播，如果它在传播的速度，甚至，如果某些组织保持无冰。
高分辨率红外热（HRIT）24-27进展，然而，有显著增加，以获取有关整个植物冷冻处理信息的能力，在差分成像模式下使用时尤其如此。28-33在本报告中，我们描述了使用该技术的研究冷冻过程的各个方面，该影响在哪里和以什么样的温度冰在植物中被启动的各种参数。的协议将被呈现，将展示冰核活性（INA）细菌作为一个非本征成核启动在高温，零下温度在一种草本植物冷冻能力， 丁香假单胞菌 （CIT-7）。
高分辨率红外摄像机
该协议和实例本报告中采用红外线高分辨率视频辐射计。所述辐射计（ 图1）提供的红外和可见光谱图像和温度数据的组合。照相机的光谱响应是在7.5至13.5微米的范围内，并提供640×480像素的分辨率。所产生的可见光谱图像的内置相机可以与红外图像进行实时，这有利于复杂，热图像的解释是稠合的。透镜用于摄像机A范围可以被用来制造特写和显微镜观察。该相机可以在一个独立的模式下使用，或接口和控制使用的专有软件的笔记本电脑。该软件可以被用来获得各种嵌入在录制的视频热数据。要注意的是各种各样的红外线辐射计是市售的是重要的。因此，至关重要的是，研究者讨论一个知识渊博的产品工程师其预期应用和研究人员测试任何specifi的能力ç辐射计，以提供所需的信息。在所描述的协议中使用的成象辐射计被放置在丙烯酸类盒（ 图2）绝缘的聚苯乙烯泡沫塑料I N为了在升温和冷却的协议，以防止暴露于冷凝。无需对所有摄像机或应用这种保护。
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Protocol
1.选煤厂材料
- 使用主体植物材料的任叶或整株植物（ 玉簪属或菜豆 ）。
2.准备水处理解决方案含冰核活性（INA）细菌
- 培养INA的细菌， 丁香假单胞菌 （菌株CIT-7）在培养皿中，在25℃对铜绿琼脂˚F制备按照生产商的方向100％的甘油的10克/升。
- 后培养已经长大充分，发生在4℃直至需要的，但保持在4℃下进行，以确保冰核活性的高水平之前两天。
- 刮由单一的板的细菌从琼脂表面用塑料，一次性或可重复使用的金属刮刀在使用和地点的时间在10〜15毫升去离子水在25毫升一次性杯。的浓度应为1×10 7至1×10 9的范围· -1。该解决方案将出现混浊。没有必要确认使用血球或分光光度计的浓度，如浓度仅需要近似的。
- 涡试管最少10秒的分发细菌。
注意：得到的INA混合物的具体浓度是不重要的，描述的协议将提供超过冰核活性的适当水平。 INA细菌和水的混合物将在核试验以后使用。
3.设置冷冻实验
- 放置高分辨率红外摄像机（SC-660）的保护性丙烯酸盒内以便通过开口在盒前面的透镜的项目，并通过盒的后部开口将相机连接到笔记本电脑或记录装置出口处的线。固定框的盖板，将箱中的位置的环境室或冷冻室里面的那个将所有流待观察对象的植物材料。
- 由衬的腔室的壁与黑色施工纸，以防止反射的红外能量干扰提供围绕植物材料在暗背景。
- 适合室LED照明时可见光波长记录图像，需要从光源尽量减少发热。只有最小的照明，如电池供电的壁橱光或其他小的LED装置中，是所必需的植物是由相机可见。
- 一旦受试者植物材料的可见图像被拍摄时，关闭LED照明。通过端口或其他室内分布开放所有外部有线连接（FireWire连接到电脑，电源线等）连接到摄像机。
- 填入口或开口的任何额外的空间用绝缘泡沫材料，以避免或减少在腔室中的温度梯度。在1°C的设置室的初始温度。
- 对齐植物或植物部分，以使植物材料是在磁场 - 视摄像机和植物材料是可见的远程观看屏幕上或所选择的软件内。
- 允许植物平衡在1℃下进行30分钟至1小时，这取决于植物材料的大小之前，发起受控冷冻试验。这保证了装置的温度不会被许多度落后气温一旦冷冻实验被启动。当所述植物材料的温度在0.5℃的空气温度的平衡得以实现。
- 放置一层泡沫塑料绝缘对盆栽土壤的顶部，如果盆栽被使用。一旦植物已经平衡，开始该腔室的冷却。
注意：绝缘锅的土壤表面上的层减小了从锅到植物周围的空气继续热损耗量，并且防止了树根从FREezing，因为这将不通常在自然界中结霜事件的发生是由于存在于土壤余热大规模贮存。
- 放置一层泡沫塑料绝缘对盆栽土壤的顶部，如果盆栽被使用。一旦植物已经平衡，开始该腔室的冷却。
- 设置所需的照相机参数（调色板，温度范围，感兴趣的特定区域等 ），如在3.4.1-3.4.4讨论。
- 选择调色板彩虹同时观看实时图像显示温度的变化。
- 通过调整位于正好在软件的图像下方的温度栏设定温度跨度至5℃。
- 选择线性标尺（算法），用于将所述红外数据到假彩色图像由所选择的调色板（彩虹）定义的与设定温度的范围内以5℃，并以基于在图像上自动跟踪。另外，手动调整设定的范围，同时进行了实验。
- 使用特定的点或温度的平均温度的利益由软件提供的规定区域内的是。检索所记录的视频序列或从嵌入在图像文件中的信息的所有像素的温度数据。 图3示出了一个典型的屏幕截图从ResearchIR软件内。
- 将光标置于上的植物组织，代表感兴趣的特定点的位置。定义兴趣点（大小1-3像素），框，线条，椭圆，或圆的面积。点或形状的多种组合可以位于在图像上。
- 记录视频序列
- 将相机设定为60赫兹和录音手动停止录制。
- 指示计算机或外部驱动器，其中所记录的视频文件将被放置的位置。
- 开始录制。
注：录制到外部硬盘驱动器，强烈推荐，因为大的视频文件将被生成。录制的视频文件可以在以后修改为仅包含含NE的部分cessary信息。这将大大降低文件大小。 - 0.5 -1.0℃的降低增量腔室的温度。等到植物温度达到平衡与空气的温度，然后通过0.5-1.0℃下再次降低温度。取决于植物组织被观察和它的形态的质量，平衡可能需要10至15分钟。因此，给予约4℃/小时的冷却速度。
- 继续以这种方式，直到工厂冻结和提出的意见完成。结束记录时在冷冻过程已经完成。
注意：植物组织已经平衡的空气温度时，植物材料和背景是相同的颜色，因为它们是在相同的温度。由于背景温度和植物组织的温度是相同的，也可能是很难看到的植物材料，直到再次降低温度并且在植物组织和一之间的温度差IR温度。
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Representative Results
冰+细菌的冰核活动， 丁香假单胞菌 （株CIT-7）
水的10μl降和10微升水含有P.丁香 （CIT-7）被放置于一玉簪叶的背面（ 玉簪属）（ 图4）。如图所示，对含有冰核细菌水滴冻结第一和负责诱导叶冻结而水在叶子表面上的压降保持解冻。
冻结和冰繁殖的木本植物
图5示出冰都开始和冰繁殖橡木（ 栎栎 ）一杆。冰的形成开始于茎的维管形成层韧皮部区域和围绕所述阀杆沿圆周传播。冰传播在木本植物的速率茎比在横向和circumfe大得多在纵向方向rential方向。31
冰繁殖率和障碍传播冰
冰开始在豆科植物（ 夏枯草 ）的网站，INA细菌已被放置（ 图6A，箭头）的茎。以下的初始冷冻时，冰传播上下杆（ 图6B-C）。使用视频序列，其中有一个时间标记，并测量在杆的距离，使一个计算冰传播的速率在给定的距离。 图6中的曲线呈现冰传播的从初始凝固点的豆科植物的茎的速率和示出冰传播的减少率作为冰穿过植物的节区。使用红外热成像还允许人们确定的，以防止冰成特定的组织中的传播的任何物理屏障的存在。 图7 </ STRONG>说明在高山物种，Loiseleuria陌上 ，那里的营养部分（茎，叶）的工厂已经冻结，但终端花蕾保持解冻冻结。结冰冻结茎和叶发生所得的放热反应消退后，并没有出现，直到126-164分钟。由于高山木本物种的生殖芽冻结敏感的3,33，避免结冰是繁殖成功至关重要。
疏水性壁垒阻止外在冰核诱导冻结的能力
西红柿植物（ 茄lycopersicum），以便确定该疏水屏障可阻止外在冰核诱导冷冻涂覆有疏水高岭土基材料（ 图8A）。的液体与叶片表面的液滴的接触程度是在未包衣的叶片大得多（
图1.高分辨率红外辐射计。说明该模型是一个FLIR SC-660红外摄像机。
图2。 保护外壳的红外摄像机。的丙烯酸框是用来容纳相机和防止冷凝红外摄像机上形成冻融实验过程中，（A）箱顶级删除。（B）相机在压克力盒插入和盖子关闭。
图3.查看和从ResearchIR软件分析红外图像和远程摄像机控制，屏幕截图。该软件用于查看实况图像，更改相机的设置，记录单的图像，使录像，并分析温度数据中的图像。在插入右侧显示更改相机设置选项，而在左下插图显示实时图像的直方图温度。
图4.外源性诱导核叶玉簪冻结（ 玉簪属）。水解冻水滴和冰核细菌， 丁香假单胞菌 （株CIT-7），存在于叶（A）的背面。 INA液滴冻结第一（B）和启动叶（C）的冻结。冰散布在整个叶（D）和，尽管叶的冻结，水滴仍然解冻（E）。水对叶的表面液滴冻结后，整个叶片已冻结，并开始冷却在其边缘（F）。
图5.冰引发和增长在木质植物的茎（夏栎 ）左面板：橡木木质茎的横截面。在韧皮部和维管形成层（A）和围绕阀杆（ - H B）冰的形成的进展的区域冻结事件（AH）发起。 Kuprian和Neuner，未公布。
图6.率冰传播在豆科植物（ 菜豆）采用高分辨率红外热计算。（A）在冰杆（箭头）发起的。 （B - C）冰传播上下杆。在图的顶部图形显示冰的传播表现为距离冰速度行驶一段时间，因为它移动了源于冻结的原址。在我的延迟发生CE传播冰通过植物茎的节点部分移动。这个数字是从的Wisniewski 等人修改。24
图7.屏障冰形成的高山木本植物，Loiseleuria陌上 （高山杜鹃）。 （一）高山杜鹃的显示核心茎，叶附着和顶芽茎的可见光图像。 （B - C）冷冻开始在茎和冰从传播到树叶。顶芽保持解冻。 （D - E）顶芽冻结茎和叶的初始冻结后独立126-164分钟。在此期间，由茎和叶的冻结所产生的焓的热已经散失。 Kuprian和Neuner，Unpublished。
图8.疏水屏障阻止番茄（ 茄番茄 ）外在成核诱导冻结。（A）中施加到番茄植物疏水高岭土基材料。 （B - C）。叶表面含有对涂层（B）INA细菌液滴之间的接触水平下降与无涂层（C）的叶子。（四）未涂敷厂（右）经过与工厂相关的冻结发生放热反应，而涂层的植物遗存过冷，解冻约-6℃。这个数字已经被修改的Wisniewski 等人 34
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Discussion
水具有过冷到温度低于0℃，并在该水会冻结可以相当可变温度的能力。36的温度限制为纯水过冷是约-40℃，并且被定义为均相成核点。当水结冰的温度比回暖-40°C它带来的异质存在成核剂，使小冰的胚胎形成，然后作为催化剂，冰的形成和生长。37有众多的自然分子的充当非常有效的冰成核剂，因此大多数的性质的冷冻水发生在温度刚好低于0℃。调节或影响异质成核剂的活性的能力有显著的潜力作为一种新的方法来提供防冻保护植物。理解冰如何形式和传播在冷冻敏感和冷冻耐受性植物是必不可少的交流hieving这一目标。
正如在介绍，各种方法已被用于研究在植物冷冻过程在实验室条件下，然而，在自然界的植物冷冻主要被监测的使用热电偶。高分辨率红外热（HRIT）24-28,34，提供了几个明显的优势，作为研究在冷冻过程中的植物的方法。 HRIT允许人们观察冰的形成的初始部位，冻结整个工厂所需冷冻的事件的数量，实际观察到如何冰被传播在植物中，如果冰传播任何障碍存在，并确定是否的任何部工厂保持无冰。最重要的是，它允许一个观察在整个植物冷冻过程而不是植物已经从亲本植物除去小的，孤立的部分。
本报告概述HRIT到FREEZ研究中的应用荷兰国际集团在完整植物或植物部分，并提供如何这种技术可用于研究几个参数，它们可以在植物影响如何以及何时冰块形式的几个例子，以及如何冰被传播。在进行这些研究的关键方面涉及的红外线摄像机的灵敏度和准确度，在摄像机和视频序列的记录的设置中使用的参数，冷却速度，被检体的结构/形态复杂被观看，和了解红外科学。这些项目将被单独寻址。
灵敏度和红外摄像机的精度（辐射计）
正在显现的植物组织的冷冻过程中的放热事件是非常小的，范围从<0.1至约0.5℃。因此，红外摄像机必须灵敏足以轻松区分温度的微小变化。温度精度也是一个重要的方面，并要求相机校准定期（至少每年一次）。虽然这可以由用户来完成，它需要使用几个黑机构覆盖一个宽的温度范围内的。因此，最好是有相机工厂校准。如果温度精度较高水平是绝对必要的，它强烈建议一个热电偶被用于一起选择与红外照相机。这可以安装在靠近对象正在研究，得到空气的温度的精确估计。
摄像机参数
主机的参数可以在先进的，高端的红外摄像机进行调整。在使用相机来查看和/或记录冻结的事件，重要的是图像平均在为了降低噪声的图像中使用，从而使其更容易形象化植物部分和冻结事件。当在照相机设置中选择一个高质量的图象发生图像平均。由于轻微结冰放热S被预期的，观察时的冷冻过程来设置摄像机的温辐射跨度覆盖一个小的温度范围内也是很重要的（2-5℃）。这是必要的，因为该软件将分发所选择的颜色调色板，在整个跨度相机设置。因此，如果有10种颜色的调色板和一个具有跨度设定为100℃，其只会是颜色的变化，如果有在温度10℃的变化。高捕获率（每秒10帧）应采用让小发热事件，从而迅速消散，不会错过。不同的彩色调色板和灰度级可以从下拉菜单中选择。选择最合适的调色板的，应根据它是否提供了用于可视化所关注的热事件的最佳选择。先进的相机还提供几个选项，用于记录视频序列和/或捕获单个图像。在一组持续时间的帧的特定数目可被选择。这是最好的短时间（几分钟），而不是小时的录音序列。可替代地，每秒的帧的数目可以表明，相机设置为停止手动或帧的特定数量的后记录。先进的相机还提供了录音开始或结束基于预先定义的触发器（温度或时间）的选项。
冷却速度
可以认为植物材料正被观看的温度不会显着地从空气温度的冷却过程中的不同是很重要的。如果温度下降太快，植物就会过冷，并冻结在较低的空气温度比他们在自然冷却速率。大多数研究建议1-2摄氏度小时-1的冷却速度，特别是在温度高于-5℃，这提供了充足的时间用于植物来与空气温度平衡。在实际中，该植物材料可以接触到平衡快得多。此可以通过植物材料的温度与周围的植物背景的温度相比较来确定。如果植物是处于平衡状态，这将是困难的，从它的红外图像的背景辨别的植物，因为它会在相同的温度为背景和图像将显示为几乎均一的颜色。
对象的结构形态复杂正在观看
自从被观看的图像代表温度图像，重叠的对象会出现连续的对象，而不是离散对象。这可以使辨别，其中冷冻事件存在的非常困难的，也确定如何冰正在繁殖的植物增加难度。对付这个问题的最好方法是，用简单的对象（个体叶，茎， 等 ），然后建立到更复杂的对象的第一工作。在特定的MA工作经验terial在处理这个问题很有价值。另外，以贴红外图像上的数字，可见光图像的顶部的能力也大大有助于分析和理解的红外线数据。
知识红外科学
虽然这将是有利的是能够以简单地在一个对象指向照相机，知道接收到的温度数据是100％的准确，理解能源与环境如何红外相互作用可以大大增加如何最好使用研究级那些理解红外线照相机和解释数据。应该变得有些熟悉术语辐射率，反射率，吸光率。在大多数情况下，可以不必担心这些参数可以使用的相机，但是，它们可以有助于解释的图像正被显示的性质和它的总体质量和准确性。简单地说，当红外线能量碰到物体也可以是为Reflected或吸收，然后发射。所研究的对象的性质，因此，可能会影响正在接收的数据的准确性。如果一个对象具有高反射率，一会接收图像更代表所发出的红外能量比对象本身的周围物体。红外能量吸收不发射的红外能量也可导致获得从物体假温度数据正在研究中。相机传感器检测发射的红外能量，因此，最准确的温度从具有辐射率较高级别的对象获得。幸运的是，植物并具有辐射可进行精确的温度测量的较高水平。发射率的较低水平可通过在照相机的设置，这将然后使用一种算法来使在温度读出适当的调整调整此参数来补偿对。
准确地确定如何以及何时植物冻结的能力必须了解的冷冻避免机制的演变和种植结构，在冷冻过程中的作用。冻结，尽管其明显的简单，是一个复杂的过程，植物进化出一系列结构调整，以避免冻结，划分冰的形成，防止冰的繁殖。高分辨率红外热成像是一种新颖的和强大的工具，可用于研究在冷冻过程的复杂性，在植物和导致的防冻保护的有效的新方法的发展。更好地了解冷冻回避也可以帮助我们了解这些自适应机制的演变，和角色，他们在不同的植物物种的生物学和生存游戏。
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Disclosures
作者有没有竞争经济利益或利益冲突。
Acknowledgments
该研究是由奥地利科学基金会（FWF）：P23681-B16。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared Camera | FLIR | SC-660 | Many models available depending on application |
| Infrared Analytical Software | FLIR | ResearchIR 4.10.2.5 | $3,500 |
| Pseudomonas syringae (strain Cit-7) | Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California Berkeley icelab@berkeley.edu | ||
| Pseudomonas Agar F | Fisher Scientific | DF0448-17-1 |
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