Introduction
Vriestemperaturen die optreden wanneer planten actief groeien kan dodelijk zijn, vooral als de plant weinig of geen vriestolerantie. Dergelijke vorst gebeurtenissen hebben vaak verwoestende gevolgen voor de landbouwproductie en kan ook een belangrijke rol spelen in het vormgeven van de gemeenschap structuur in natuurlijke populaties van planten, vooral in de Alpen, sub-arctische en arctische ecosystemen 1-6. Episodes van ernstige vorst in het voorjaar hebben grote gevolgen voor de productie van fruit in de Verenigde Staten en Zuid-Amerika in de afgelopen jaren 7-9 gehad en zijn verergerd door de vroege begin van warm weer gevolgd door meer typische gemiddelde lage temperaturen. De vroege warme weer induceert knoppen te breken, het activeren van de groei van nieuwe scheuten, bladeren en bloemen die allemaal zeer weinig tot geen vorsttolerantie 1,3,10-12. Dergelijke grillige weerpatronen zijn gemeld aan een directe weerspiegeling van de gang zijnde klimaatverandering en zullen naar verwachting een gemeenschappelijk weerpatroon voor de fores zijneeable toekomst 13. De inspanningen om economisch, effectief en milieuvriendelijk beheer technieken of landbouwchemicaliën die verhoogde vorsttolerantie kunnen verschaffen hebben beperkt succes voor tal van redenen had, maar dit kan deels worden toegeschreven aan de complexe aard van de bevriezing tolerantie en bevriezing vermijden mechanismen in planten. 14
Het adaptieve mechanismen van vorst overleving in planten worden traditioneel onderverdeeld in twee categorieën, vorsttolerantie en invriezen te voorkomen. De eerste categorie wordt geassocieerd met biochemische mechanismen geregeld door een specifieke set van genen die het mogelijk planten om de spanningen in verband met de aanwezigheid en de dehydratieve effect van ijs in haar weefsels tolereren. Terwijl de laatste categorie is typisch, maar niet alleen, in verband met structurele aspecten van een plant dat als bepalen wanneer en waar ijsvormen in een plant 14. Ondanks de prevalentie van bevriezing voorkomen als adaptive mechanisme, is weinig onderzoek besteed in de afgelopen tijd tot het begrijpen van de onderliggende mechanismen en regulering van bevriezen te vermijden. De lezer wordt verwezen naar een recent overzicht 15 voor meer details worden gegeven.
Hoewel ijsvorming bij lage temperaturen lijkt een eenvoudig proces, vele factoren dragen bij aan het bepalen van de temperatuur waarbij ijs nucleates in plantenweefsels en hoe het zich binnen de plant. Parameters zoals de aanwezigheid van extrinsieke en intrinsieke ijskiemvormers, heterogene vs. homogene nucleatie gebeurtenissen, thermische-hysteresis (antivries) eiwitten, de aanwezigheid van specifieke suikers en andere osmolyten en een groot aantal structurele aspecten van de plant kan spelen een belangrijke rol in het vriesproces in planten. Tezamen zijn deze parameters beïnvloeden de temperatuur waarbij een plant bevriest, waarbij ijs ingeleid en hoe deze groeit. Ze kunnen ook invloed hebben op de morfologie van de resulterende ijskristallen.Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om het vriesproces in planten te bestuderen onder laboratoriumomstandigheden, inclusief kernmagnetische resonantiespectroscopie (NMR) 16, magnetic resonance imaging (MRI) 17, cryo-microscopie 18-19 en lage temperatuur scanning elektronenmicroscopie (LTSEM ). 20 Het invriezen van hele planten in laboratorium en veldinstellingen is echter voornamelijk bewaakt met thermokoppels. Het gebruik van thermokoppels bevriezing studie is gebaseerd op het vrijkomen van warmte (smeltenthalpie) wanneer water een faseovergang van vloeibaar naar vast ondergaat. Het invriezen wordt vervolgens geregistreerd als een exotherme gebeurtenis. 21-23 Hoewel thermokoppels zijn de typische voorkeursmethode bij het bestuderen bevriezen in planten, het gebruik ervan heeft vele beperkingen die de hoeveelheid gegevens die tijdens de bevriezing gevallen beperkt. Bijvoorbeeld met thermokoppels moeilijk bijna onmogelijk om te bepalen waar het ijs wordt geopend planten, hoe het propageert,als het zich voortplant in een gelijkmatig tempo, en als sommige weefsels blijft ijsvrij.
Vooruitgang in een hoge resolutie infrarood thermografie (HRIT) 24-27, echter, zijn aanzienlijk toegenomen de mogelijkheid om informatie over de bevriezing proces in hele planten te verkrijgen, vooral bij gebruik in een differentiële imaging-modus. 28-33 In dit verslag, we beschrijven de toepassing van deze technologie om verschillende aspecten van het invriesproces en verschillende parameters die invloed hebben en waar en op welke temperatuur ijs ingeleid planten bestuderen. Een protocol zal worden dat de capaciteit van de ijs nucleatie-actieve (INA) bacterie Pseudomonas syringae (Cit-7) fungeren als extrinsieke nucleator initiërende bevriezing kruidachtige plant bij een hoge, temperaturen onder nul demonstreren.
High-resolution Infrared Camera
Het protocol en voorbeelden gedocumenteerd in dit rapport gebruik van een hoge resolutie infraroodvideo radiometer. De radiometer (figuur 1) levert een combinatie van infrarode en zichtbare spectrum afbeeldingen en temperatuurgegevens. De spectrale respons van de camera in het traject van 7,5-13,5 pm en levert 640 x 480 pixel resolutie. Zichtbare spectrum afbeeldingen gegenereerd door de ingebouwde camera kan worden gefuseerd met IR-beelden in real time, wat de interpretatie van complexe infraroodbeelden vergemakkelijkt. Een reeks van lenzen voor de camera kan worden gebruikt om close-up en microscopische observaties te maken. De camera kan gebruikt worden in een stand-alone mode of gekoppeld en gecontroleerd met behulp van een laptop propietary software. De software kan worden gebruikt om een verscheidenheid van thermische data ingebed in de opgenomen video te verkrijgen. Het is belangrijk op te merken dat een groot aantal infrarood radiometers zijn commercieel verkrijgbaar. Daarom is het essentieel dat de onderzoeker over hun beoogde toepassing met een deskundige productengineer en dat de onderzoeker test het vermogen van elke specificatiesc radiometer om de benodigde informatie te verstrekken. De imaging radiometer in het protocol beschreven wordt in een acrylaat (afbeelding 2) geïsoleerd met Styrofoam i n om de blootstelling ontmoedigen om condensatie tijdens de opwarming en afkoeling protocols. Deze bescherming is niet noodzakelijk voor alle camera's of toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Plant Materials
- Gebruik ofwel bladeren of hele planten van het onderwerp plantmateriaal (Hosta spp. Of Phaseolus vulgaris).
2. Voorbereiding van de Water oplossingen die ijskiemvorming Actief (INA) Bacteriën
- Culture INA bacterie Pseudomonas syringae (stam Cit-7) in petrischalen bij 25 ° C over Pseudomonas Agar F bereid met 10 g / l van 100% glycerol per traject van de fabrikant.
- Na kweken voldoende, plaats gegroeid bij 4 ° C totdat ze nodig maar laten 4 ° C gedurende twee dagen voorafgaand aan een hoog ijskiem verzekeren.
- Schraap bacteriën uit een enkele plaat van het oppervlak van de agar met kunststof wegwerp- of herbruikbaar metalen spatel op het moment van gebruik en plaats in 10-15 ml gedeïoniseerd water in een 25 ml wegwerp cuvette. De concentratie moet in het traject van 1 x 7-1 oktober x 10 9 · -1 Ml. De oplossing zal verschijnen troebel. Er is geen noodzaak om de concentratie met behulp van een hemocytometer of spectrofotometer bevestigen, zoals concentreren slechts bij benadering nodig.
- Vortex de cuvette gedurende minimaal 10 seconden om de bacteriën te verspreiden.
Opmerking: De specifieke concentratie van het resulterende mengsel INA niet belangrijk en het beschreven protocol wordt slechts een passend ijskiem vormende activiteit. Dit mengsel van INA bacteriën en water zal later in de nucleatie experimenten gebruikt.
3. Opzetten van een Freezing Experiment
- Plaats de hoge resolutie infraroodcamera (SC-660) in de beschermende acryl box, zodat de lens steekt door de opening in de voorkant van de doos en de draden de camera op een exit laptop of opnameapparaat door de achterste opening van de doos . Bevestig het deksel van de doos en zet de doos in de klimaatkamer of vriezer in een locatie die zal alleow onderwerp plantenmateriaal te zien.
- Geef een donkere achtergrond rond het plantenmateriaal door langs de wanden van de kamer met zwarte knutselpapier voor interferentie met gereflecteerde infrarode energie te voorkomen.
- Plaats de kamer met LED-verlichting om verwarming te minimaliseren van de lichtbron bij het opnemen van beelden in zichtbare golflengten is vereist. Slechts een minimale verlichting, zoals een op batterijen werkende kast licht of andere kleine LED-inrichting, is vereist voor de planten zichtbaar door de camera.
- Zodra zichtbare beelden van het onderwerp plantmateriaal worden genomen, schakelt u de LED-verlichting. Verdeel alle externe bedrade verbindingen (firewire aansluiting op de computer, het netsnoer, enz.) Om de camera via een poort of andere opening in de kamer.
- Vul geen extra ruimte in de haven of de opening met isolerend schuim materiaal te voorkomen of te verminderen temperatuur gradiënten in de kamer. Stel de begintemperatuur van de kamer op 1 ° C.
- Lijn planten of plantendelen, zodat het plantmateriaal in het beeldveld weergave van de camera en het plantmateriaal zichtbaar op de afstandsbediening weergavescherm of binnen de gekozen software.
- Laat planten equilibreren bij 1 ° C gedurende 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte van het plantenmateriaal voorafgaand aan het initiëren van een gecontroleerd experiment bevriezen. Dit zorgt ervoor dat de temperatuur van de plant niet achter luchttemperatuur vertraging door velen graden na het invriezen experiment wordt gestart. Evenwichtstoestand is bereikt wanneer de temperatuur van het plantenmateriaal binnen 0,5 ° C van luchttemperatuur.
- Leg een laag Styrofoam isolatie boven de bodem van potplanten als potplanten worden gebruikt. Nadat de planten zijn evenwicht gebracht, begint het koelen van de kamer.
Opmerking: De isolatielaag op het bodemoppervlak van de pot vermindert de hoeveelheid voortdurende warmteverlies van de pot aan de lucht rond de plant, en voorkomt dat de wortels van freezing, aangezien dit niet typisch voordoen bij een frost event karakter als gevolg van de grote reservoir van restwarmte in de bodem.
- Leg een laag Styrofoam isolatie boven de bodem van potplanten als potplanten worden gebruikt. Nadat de planten zijn evenwicht gebracht, begint het koelen van de kamer.
- Stel de gewenste camera parameters (kleurenpalet, temperatuurbereik, specifieke gebieden van belang, enz.), Zoals besproken in 3.4.1-3.4.4.
- Selecteer de regenboog palet aan de temperatuurschommelingen te geven tijdens het bekijken van het live-beeld.
- Stel het temperatuurbereik tot 5 ° C door instellen van de temperatuur balk net onder de afbeelding in de software.
- Kies de lineaire schaal (algoritme) voor het omzetten van de infrarode gegevens in beeld valse kleuren zoals gedefinieerd door de geselecteerde palet (regenboog) en stel het bereik van de temperatuur tot 5 ° C en voor het automatisch volgen op basis van de afbeelding. Als alternatief, pas de ingestelde bereik handmatig tijdens het uitvoeren van het experiment.
- Gebruik de temperatuur van een bepaald punt of een gemiddelde temperatuur binnen het afgebakende gebied van de rente door de softwzijn. Haal de temperatuurgegevens van alle pixels van de opgenomen video sequentie of het in de beeldinformatie bestandsgegevens. Figuur 3 toont een typische screenshot vanuit ResearchIR software.
- Plaats een cursor op een locatie op het plantenweefsel dat een specifiek punt van belang vertegenwoordigt. Definieer het gebied van belang als de punten (1 -3 pixels in grootte), dozen, lijnen, ellipsen of cirkels. Meerdere combinaties van punten of vormen kunnen worden verdeeld over het beeld.
- Het opnemen van een video-opname
- Stel de camera om 's 60 Hz en de opname handmatig worden gestopt.
- Geef de locatie op de computer of externe schijf waar de opgenomen video bestand wordt geplaatst.
- Begin met opnemen.
Opmerking: Opnemen op een externe harde schijf is zeer aan te bevelen omdat grote videobestanden worden gegenereerd. Opgenomen video bestanden kunnen later worden bewerkt om alleen het gedeelte met het ne bevattencessary informatie. Dit zal sterk verminderen van de bestandsgrootte. - Verlaag de temperatuur van de kamer stapsgewijs met 0,5 -1,0 ° C. Wacht tot de plant temperatuur in evenwicht met de luchttemperatuur en dan weer lager de temperatuur met 0,5-1,0 ° C. Afhankelijk van de massa van het plantenweefsel wordt waargenomen en de morfologie kan equilibreren 10 tot 15 min. Aldus geeft een afkoelsnelheid van ongeveer 4 ° C / hr.
- Ga door op deze manier totdat de plant bevriest en observaties zijn voltooid. Stop de opname wanneer het vriesproces voltooid.
Opmerking: Het plantenweefsel is geëquilibreerd met luchttemperatuur als het plantmateriaal en achtergrond overeen kleur aangezien ze bij dezelfde temperatuur. Aangezien de voorgeschiedenis en de temperatuur van het plantenweefsel zijn hetzelfde, kan het moeilijk zijn het plantenmateriaal visualiseren totdat weer lager de temperatuur en er is temperatuurverschil tussen het plantenweefsel enir temperatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ice-kiemvormend activiteit van de Ice + bacterie, Pseudomonas syringae (stam Cit-7)
Een 10 ul druppel water en 10 pl water dat P. syringae (Cit-7) werden op de abaxiale oppervlak van een blad Hosta geplaatst (Hosta spp.) (figuur 4). Zoals geïllustreerd, de druppel water met de INA bacteriën bevroor eerste en was verantwoordelijk voor het induceren van het blad te bevriezen, terwijl de druppel water op het bladoppervlak bleef bevroren.
Invriezen en Ice Voortplanting in een Woody Plant
Figuur 5 illustreert zowel ijs initiatie en ijs propagatie in een stam van de eik (Quercus robur). IJsvorming werd in het vasculaire cambium floëem gebied van de steel en gepropageerd omtreksrichting rond de steel. De snelheid van ijs vermeerdering in woody stengels in een lengterichting veel groter is dan in een laterale en circumferential richting. 31
De tarieven van Ice Voortplanting en Belemmeringen voor Ice Voortplanting
Ijs werd in de stam van een bonenplant (P. vulgaris) op de plaats waar INA bacteriën waren geplaatst (figuur 6A, pijl). Na de eerste bevriezing evenement, ijs gepropageerd op en neer de steel (figuur 6B-C). De videoreeks, waarin een tijdstempel heeft en meetafstand op de steel, laat toe de snelheid van ijs propagatie berekenen over een bepaalde afstand. De grafiek in figuur 6 toont het percentage ijs propagatie van de steel van de boon plant vanaf het punt van initiële invriezen en illustreert een verlaagde snelheid van propagatie ijs als ijs passeert door de nodale gebied van de plant. Met behulp van infrarood thermografie maakt het ook mogelijk om de aanwezigheid van fysische barrières die de voortplanting van ijs in specifieke weefsels te voorkomen bepalen. Figuur 7 </ Strong> illustreert het bevriezen in een alpiene species, Loiseleuria procumbens, waar de vegetatieve deel (stengel en bladeren) van de plant is bevroren, maar de terminal bloemknoppen bevroren blijven. Ijsafzetting Pas in 126-164 minuten na bevriezen van de stengel en blad had plaatsgevonden en de resulterende exotherme reactie was verdwenen. Als reproductieve scheuten van alpine houtachtige soorten gevoelige 3,33 bevriezen, bevriezing vermijden is van cruciaal belang om reproductief succes.
Vermogen van Hydrofobe Belemmeringen voor Blok extrinsieke ijskiemvorming Induced Bevriezing
Een tomatenplant (Solanum lycopersicum) werd bekleed met een hydrofobe-kaolien gebaseerde materiaal (figuur 8A) om te bepalen of de hydrofobe barrière extrinsieke ijskiem geïnduceerde invriezen kunnen blokkeren. De mate van contact van vloeistofdruppeltjes met het bladoppervlak veel groter in onbeklede blad (
Figuur 1. Hoge-resolutie Infrared Radiometer. Het afgebeelde model is een FLIR SC-660 Infrarood Video Camera.
Figuur 2. beschermende omhulling voor de infrarood camera. Het acryl vak wordt gebruikt om de camera te huisvesten en te voorkomen dat zich condens vormt op de infrarood camera tijdens het invriezen en ontdooien experimenten. (A) Doos met top verwijderd. (B) camera aangebracht in het vak acryl en gesloten deksel.
Figuur 3. bekijken en analyseren van infraroodbeelden en Remote Camera Control. Screen schot van ResearchIR software. De software wordt gebruikt om het live-beeld temperatuurgegevens bekijken, camera-instellingen, opnemen enkele beelden te veranderen, maken video-opnames, en te analyseren in de beelden. Plaats op rechts toont opties voor het wijzigen van de camera-instellingen tijdens het invoegen op linksonder toont een temperatuur histogram van het live-beeld.
Figuur 4. extrinsieke nucleation geïnduceerde bevriezing van Hosta blad (Hosta spp.). Niet-bevroren druppeltjes water en INA bacterie, Pseudomonas syringae (stam Cit-7), zijn aanwezig op de abaxiale oppervlak van het blad (A). INA druppel bevriest eerst (B) initieert en bevriezen van het blad (C). Ice verspreidt door het blad (D) en ondanks de bevriezing van het blad, de waterdruppel blijft bevroren (E). Druppel water op oppervlakte van blad bevriest nadat het gehele blad bevroren en begint te koelen op de randen (F).
Figuur 5. Ice initiatie en propagatie in de stam van een houtige planten (Quercus robur) Left Panel:. Dwarsdoorsnede van een houtige stengel van eikenhout. (AH) Inleiding van bevriezen evenement in het gebied van het floëem en vasculaire cambium (A) en progressie van ijsvorming rond de steel (B - H). Kuprian en Neuner, ongepubliceerd.
Figuur 6. Rate ijs propagatie in een boon fabriek (Phaseolus vulgaris) berekend met behulp van hoge resolutie infrarood thermografie. (A) Ice gestart in steel (pijl). (B - C) Ice vermeerdering op en neer de stam. Grafiek aan de bovenkant van de figuur toont de snelheid van ijs voortplanting gepresenteerd als de afstand ijs reisde na verloop van tijd als het hoger op de stam van de oorspronkelijke plaats van het vriespunt. Een vertraging in de ice propagatie opgetreden als ijs verplaatst via de knooppunten deel van de plant stengel. Dit cijfer werd aangepast van Wisniewski et al 24.
Figuur 7. Barrier om ijsvorming in het alpine houtige plant, Loiseleuria procumbens (alpine azalea). (A) Zichtbaar licht beeld van de stam van alpine azalea tonen centrale stam, bevestigd bladeren en terminal knoppen. (B - C) Freezing wordt gestart in de stam en ijs propageert uit in bladeren. Terminal knoppen blijven bevroren. (D - E) Terminal knoppen bevriezen onafhankelijk 126-164 min na de eerste bevriezing van stengel en bladeren. Gedurende deze tijd de warmte van enthalpie die door het bevriezen van de stengel en blad reeds verdwenen. Kuprian en Neuner, unpublished.
Figuur 8. Hydrofobe barrières blokkeren extrinsieke kiemvorming geïnduceerde bevriezen van tomaat (Solanum Lycopersicon). (A) Hydrofobe-kaolien gebaseerde materiaal aangebracht op tomatenplanten. (B - C). Verminderde mate van contact tussen het bladoppervlak en druppels vloeistof met INA bacteriën op gecoat (B) vs. ongecoat (C) bladeren. (D) Uncoated planten (rechts) ondergaat een exotherme reactie in verband met de bevriezing van de plant, terwijl gecoate plantenresten onderkoelde en bevroren bij ongeveer -6 ° C. Dit cijfer is aangepast van Wisniewski et al. 34
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Water heeft de mogelijkheid om onderkoeling bij temperaturen onder 0 ° C en de temperatuur waarbij water bevriest kan heel variabel zijn. 36 De grenstemperatuur voor onderkoeling van zuiver water is ongeveer -40 ° C en wordt gedefinieerd als homogene nucleatie punt. Wanneer water bevriest bij temperaturen warmer dan -40 ° C wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van heterogene kiemvormers waarmee kleine ice embryo te vormen die dan dienen als een katalysator voor ijsvorming en groei. 37 Er zijn een groot aantal moleculen in de natuur voorkomen fungeren als zeer efficiënt ijs kiemvormers, waardoor de meeste bevriezen van water in de natuur optreedt bij temperaturen net onder 0 ° C. Het vermogen om te reguleren of beïnvloeden de activiteit van heterogene nucleatiemiddelen heeft een aanzienlijk potentieel als nieuwe benadering voor vorstbescherming planten. Begrijpen hoe ijs vormen en zich voortplant in het bevriezen van gevoelige en invriezen-tolerante planten is essentieel voor achieving deze doelstelling.
Zoals vermeld in de inleiding, zijn verschillende methoden toegepast om het vriesproces in planten te bestuderen onder laboratoriumomstandigheden echter bevriezing van planten in de natuur is voornamelijk gevolgd met gebruik van thermokoppels. High-resolution infrarood thermografie (HRIT) 24-28,34, biedt verscheidene duidelijke voordelen als een methode voor het bestuderen van het vriesproces in planten. HRIT maakt het mogelijk om de oorspronkelijke plaats van ijsvorming observeren, het aantal events bevriezing nodig om een gehele plant te bevriezen, eigenlijk zien hoe ijs wordt vermeerderd in een plant en eventueel belemmeringen ijs vermeerdering aanwezig, en bepalen of alle delen van een planten blijven ijsvrij. Belangrijker nog, het maakt het mogelijk om het vriesproces geheel installaties nemen plaats kleine geïsoleerde delen van een plant die zijn verwijderd uit de moederplant.
Het huidige rapport schetst de toepassing van HRIT aan de studie van freezing in intacte planten of plantendelen en geeft verschillende voorbeelden van hoe deze technologie kan worden gebruikt om verschillende parameters die bepalen hoe en wanneer ijsvorming in planten beïnvloeden onderzoeken hoe ijs wordt gepropageerd. Kritische aspecten van het uitvoeren van deze studies betrekking hebben op de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van de infrarood camera, de gebruikte parameters in het setup van de camera en het opnemen van videofragmenten, de koeling tarief, de structurele / morfologische complexiteit van het onderwerp wordt bekeken, en kennis over infrarood wetenschap. Deze artikelen zullen afzonderlijk worden aangepakt.
Gevoeligheid en nauwkeurigheid van de infrarood camera (radiometer)
De exotherme gebeurtenissen bij het invriezen van plantenweefsels die worden gevisualiseerd zijn erg klein, variërend van <0,1 tot ongeveer 0,5 ° C. Daarom is de infraroodcamera moet gevoelig genoeg zijn om gemakkelijk te onderscheiden kleine temperatuurschommelingen. Temperatuurnauwkeurigheid is ook een belangrijk aspect envereist dat de camera is gekalibreerd op een regelmatige basis (ten minste eenmaal per jaar). Hoewel dit kan door de gebruiker, vereist het gebruik van verschillende zwarte lichamen die een breed gebied van temperaturen. Daarom is het het beste om de camera-fabriek gekalibreerd hebben. Indien een hoge nauwkeurigheid temperatuur is absoluut noodzakelijk, is het sterk aanbevolen dat een thermokoppel worden gebruikt in samenhang met de infrarood camera. Dit kan worden aangebracht nabij het object dat wordt onderzocht om een nauwkeurige schatting van luchttemperatuur geven.
Camera parameters
Een groot aantal parameters kunnen worden aangepast op geavanceerde, high-end infrarood camera. Bij gebruik van de camera weergeven en / of opnemen bevriezen gebeurtenissen, is het belangrijk dat beelduitmiddel worden gebruikt om een afbeelding te verkleinen lawaaierige, waardoor het gemakkelijker plantendelen en invriezen events te visualiseren. Afbeelding middeling ontstaat wanneer een hoge kwaliteit beeld is geselecteerd in de camera-instellingen. Aangezien kleine bevriezing exotherms wordt verwacht, is het ook belangrijk bij het bekijken van het vriesproces de temperture overspanning van de camera op een temperatuurbereik deksel (2-5 ° C). Dit is nodig omdat de software de geselecteerde kleurenpalet over het volledige bereik voor de camera zal verdelen. Daarom, als er 10 kleuren in het palet en men de op 100 ° C as, het zou slechts een kleurverandering zijn als er een 10 ° C temperatuurverandering. Een hoge capture rate (tien frames per seconde) moet worden gebruikt zodat kleine exotherme gebeurtenissen, die snel verdwijnen, niet worden gemist. Verschillende kleurenpaletten en grijstinten kan worden geselecteerd uit een drop-down menu. Selectie van de meest geschikte pallet moet worden gebaseerd op of deze de beste optie voor het visualiseren van de thermische gebeurtenissen plaats. Geavanceerde camera's bieden ook een aantal opties voor het opnemen van een video volgorde en / of het vastleggen van afzonderlijke beelden. Een bepaald aantal frames over een bepaalde tijdsduur kunnen worden geselecteerd.Dit is het beste voor het opnemen sequenties van korte duur (in minuten) in plaats van uren. Als alternatief kan het aantal frames per seconde worden aangegeven en de camera ingesteld op handmatig of na een bepaald aantal frames de opname te stoppen. Geavanceerde camera's bieden ook de mogelijkheid om opnames te beginnen of eindigen op basis van vooraf gedefinieerde triggers (temperatuur of tijd).
Koeling tarief
Het is belangrijk dat de temperatuur van het plantenmateriaal wordt bekeken niet drastisch verschillen van de temperatuur gedurende het koelen. Als de temperatuur te snel wordt verlaagd, zal planten onderkoeling en bevriezen bij een lagere temperatuur dan ze zouden onder natuurlijke koeling tarieven. De meeste studies raden een afkoelsnelheid van 1-2 ° C h-1, in het bijzonder bij temperaturen boven -5 ° C, die meer dan voldoende tijd planten evenwicht met de temperatuur komen geeft. In werkelijkheid kan het plantenmateriaal in evenwicht komen sneller. Dezekan worden bepaald door de temperatuur van het plantmateriaal met de temperatuur van de achtergrond rond de plant. Als de plant in evenwicht, zal het moeilijk zijn om de plant te onderscheiden van de achtergrond in het infraroodbeeld zoals het zal zijn bij dezelfde temperatuur als de achtergrond en de afbeelding wordt vrijwel homogeen van kleur te vertonen.
Structurele morfologische complexiteit van het object dat bekeken
Omdat de beelden die worden weergegeven afbeeldingen van de temperatuur vertegenwoordigen, zullen objecten die overlappen weergegeven als aangrenzende objecten plaats afzonderlijke objecten. Dit kan onderscheiden het vriespunt gebeurtenissen voorkomende zeer moeilijk en ook de moeilijkheidsgraad te bepalen hoe ijs wordt gepropageerd in de plant. De beste manier om met dit probleem om eerst werken met eenvoudige voorwerpen (losse bladeren, stengels, enz.) En vervolgens opbouwen complexere objecten. Ervaring in het werken met specifieke mariaal heeft grote waarde in het omgaan met dit probleem. Bovendien kan de mogelijkheid om het infraroodbeeld overlay bovenop een digitaal zichtbaar-lichtbeeld ook grote hulp zijn bij het analyseren en begrijpen van de infrarood data.
Kennis van infrarood wetenschap
Hoewel het voordelig kunnen eenvoudigweg de camera op een voorwerp zou zijn en dat de temperatuurgegevens ontvangen wordt 100% accuraat begrijpen hoe infrarood energie reageert met de omgeving kan verhogen die begrijpen hoe de research-grade gebruiken infraroodcamera's en interpreteren van de gegevens. Men moet enigszins vertrouwd met de voorwaarden emissiviteit, reflectie en absorptie worden. Voor het grootste deel, kan de camera zonder zorgen over deze parameters worden gebruikt, maar ze kunnen bijdragen aan de aard van het beeld wordt weergegeven als de totale kwaliteit en nauwkeurigheid verklaren. Kortom, wanneer infrarode energie raakt een object kan het ofwel r zijneflected of geabsorbeerd en vervolgens uitgestoten. De aard van het object dat wordt onderzocht, kan dus invloed op de nauwkeurigheid van de gegevens worden ontvangen. Als een object een hoge reflectiecoëfficiënt, zal men een beeld representatiever omringende objecten die infraroodstralen energie dan het object zelf ontvangen. De absorptie van infrarode energie zonder uitstoot infraroodenergie kan ook leiden tot het verkrijgen false temperatuurgegevens van het object dat wordt onderzocht. De camera sensors detecteren uitgestraalde infraroodenergie derhalve worden de meest accurate temperaturen verkregen van objecten die een hoge emissiviteit heeft. Gelukkig hoeft planten hebben een hoog stralingsvermogen waardoor nauwkeurige temperatuurmetingen. Lagere niveaus van de emissie kan voor worden gecompenseerd door het aanpassen van deze parameter in de camera-instellingen die vervolgens zal gebruik maken van een algoritme om een passende aanpassing van de temperatuur uitlezing te maken.
Het vermogen om nauwkeurig te bepalen hoe en wanneer planten vriesis essentieel voor het begrijpen van de evolutie van freeze-vermijdingsmechanisme en de rol van de structuur in het invriesproces. Bevriezing, Hoewel dit een eenvoudige, is een complex proces en planten zijn tal van structurele aanpassingen ontwikkeld om bevriezing te voorkomen, hokjes ijsvorming en de voortplanting van ijs te voorkomen. Hoge resolutie infraroodthermografie is een nieuw en krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de complexiteit van het vriesproces bestuderen planten en leiden tot de ontwikkeling van effectieve nieuwe methoden voor vorstbescherming. Een beter begrip van freeze-vermijden kan ons ook helpen om te begrijpen hoe deze adaptieve mechanismen zijn geëvolueerd, en de rol die zij spelen in de biologie en de overleving van verschillende plantensoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Oostenrijkse Science Fund (FWF): P23681-B16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared Camera | FLIR | SC-660 | Many models available depending on application |
| Infrared Analytical Software | FLIR | ResearchIR 4.10.2.5 | $3,500 |
| Pseudomonas syringae (strain Cit-7) | Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California Berkeley icelab@berkeley.edu | ||
| Pseudomonas Agar F | Fisher Scientific | DF0448-17-1 |
References
- Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
- Neuner, G., Hacker, J. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. Lütz, C. , Springer. 163-174 (2012).
- Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? - Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
- Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. , CAB International. 1-11 (2009).
- Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
- Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
- Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
- Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, Spring. 1031-1039 (2007).
- Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
- Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
- Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
- Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
- Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
- Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
- Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
- Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
- Ishikawa, M., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. Li, P. H., Sakai, A. , Academic Press. 325-340 (1982).
- Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
- Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
- Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
- Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
- Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
- Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
- Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
- Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
- Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
- Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
- Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
- Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
- Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
- Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
- Wisniewski, M., Fuller, M. P. Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. Margesin, R., Schinner, F. , Springer. 105-118 (1999).
- Franks, F. Biophysics and biochemistry at low temperatures. , Cambridge University Press. (1985).
- Neuner, G., Kuprian, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. Hincha, D., Zuther, E. , Springer. 91-98 (2014).
