Die Verwendung von hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) für das Studium der Ice Ice Keimbildung und Ausbreitung in Pflanzen

Introduction

Eisigen Temperaturen, die beim Pflanzen aktiv wachsenden auftreten kann tödlich sein, vor allem, wenn die Anlage hat wenig oder keine Frosttoleranz. Solche Frost Ereignisse haben oft verheerende Auswirkungen auf die landwirtschaftliche Produktion und können auch eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Gemeinschaftsstruktur in natürlichen Populationen von Pflanzen, vor allem im alpinen, subarktischen und arktischen Ökosysteme ^1-6. Episoden starker Frühlingsfrösten haben große Auswirkungen auf Obstproduktion in den USA und Südamerika in den letzten Jahren ^7-9 hatten und wurden von der frühen Beginn der warmen Wetter, gefolgt von mehr typische mittlere niedrigen Temperaturen verschärft. Die frühe warme Wetter induziert Knospen zu brechen, aktivieren das Wachstum der neuen Triebe, Blätter und Blumen, die alle sehr wenig bis gar keine Frosttoleranz ^1,3,10-12 haben. Solche unberechenbar Wettermuster sind berichtet worden, um eine direkte Reflexion der fortschreitenden Klimawandel und erwartet, dass sie ein gemeinsames Wettermuster für die fores seineeable Zukunft ^13. Die Bemühungen um die wirtschaftliche, effektive und umweltfreundliche Management-Techniken oder Agrochemikalien, die eine erhöhte Frosttoleranz bereitstellen kann einen begrenzten Erfolg für eine Vielzahl von Gründen, hatte aber das kann teilweise auf die Komplexität der Frosttoleranz und Gefriervermeidungsmechanismen in Pflanzen zurückgeführt werden. ¹⁴

Die adaptiven Mechanismen mit Frost Überleben in Pflanzen assoziiert sind traditionell in zwei Kategorien eingeteilt, das Einfrieren und Gefriertoleranz Vermeidung. Die erste Kategorie ist mit biochemischen Mechanismen, durch eine bestimmte Gruppe von Genen, die Pflanzen, die Spannungen mit der Gegenwart und der dehydratisierende Wirkung von Eis in seinen Geweben tolerieren ermöglichen geregelt verbunden. Während die letztere Kategorie ist typischerweise, aber nicht ausschließlich, mit strukturellen Aspekte einer Pflanze, die, wenn zu bestimmen, wann und wo sich Eis in einer Pflanze ¹⁴ verbunden. Trotz der Prävalenz von freeze Vermeidung als Ad-aptive Mechanismus hat wenig Forschung in der letzten Zeit für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und Regulation der Gefriert Vermeidung gewidmet. Der Leser wird auf eine aktuelle Übersicht ¹⁵ für mehr Details zu diesem Thema verwiesen.

Während die Bildung von Eis bei niedrigen Temperaturen kann wie ein einfacher Prozess erscheinen, viele Faktoren tragen zur Bestimmung der Temperatur, bei der Eis Keime in Pflanzengewebe und wie es breitet sich in der Anlage. Parameter, wie die Anwesenheit von extrinsischen und intrinsischen Eiskernbildnern heterogene vs. homogene Keimbildung, thermische Hysterese (Frostschutz) Proteine, das Vorhandensein von spezifischen Zucker und anderen Osmolyten, und eine Vielzahl von strukturellen Aspekte der Anlage spielen eine bedeutende Rolle des Gefrierprozesses in Pflanzen. Gemeinsam beeinflussen diese Parameter die Temperatur, bei der eine Pflanze friert, wo Eis initiiert und wie es wächst. Sie kann auch Auswirkungen auf die Morphologie der resultierenden Eiskristallen.Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um den Gefrierprozeß in Pflanzen, die unter Laborbedingungen, einschließlich kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) ^16, Kernspintomographie (MRI) ^17, Kryo-Mikroskopie ^18-19 und Tieftemperatur-Rasterelektronenmikroskopie Studie (LTSEM ). ²⁰ Freezing ganzer Pflanzen im Labor- und Feldeinstellungen hat sich jedoch hauptsächlich mit Thermoelementen überwacht. Die Verwendung von Thermoelementen, um ein Einfrieren zu studieren ist an der Freisetzung von Wärme (Schmelzwärme), wenn das Wasser einen Phasenübergang von einer Flüssigkeit zu einem Feststoff basiert. Einfrieren wird dann als exotherme Ereignis aufgezeichnet. ^21-23 Obwohl Thermoelemente sind das typische Verfahren der Wahl bei der Untersuchung Gefrier in Pflanzen hat ihre Verwendung vielen Einschränkungen, die die Menge an Informationen während eines Gefrier Ereignis erhalten begrenzen. Zum Beispiel mit Thermoelementen ist es schwierig, fast unmöglich, zu bestimmen, wo das Eis in Pflanzen angezogen, wie sie ausbreitet,wenn es breitet sich mit gleichmäßiger Rate, und wenn einige Gewebe eisfrei bleiben.

Fortschritte in der hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) ^24-27 haben jedoch deutlich erhöht die Fähigkeit, Informationen über den Gefrierprozess in ganzen Pflanzen zu erhalten, vor allem, wenn in einem Differential Imaging-Modus verwendet. ^28-33 In diesem Bericht haben wir beschreiben die Verwendung dieser Technologie, um verschiedene Aspekte des Gefrierprozesses und verschiedene Parameter, die beeinflussen, wo und bei welcher Temperatur und Eis in Pflanzen begonnen zu studieren. Ein Protokoll vorgestellt werden, die die Fähigkeit des Eis-Nukleation aktive (INA) Bakterium Pseudomonas syringae (Cit-7) als extrinsische Nukleator Einleitung Einfrieren in eine krautige Pflanze auf einem hohen, unter Null Temperatur handeln demonstrieren wird.

Hochauflösende Infrarot-Kamera

Das Protokoll und die Beispiele in diesem Bericht dokumentiert nutzen eine hochauflösende Infrarot-Video-Radiometer. Das Radiometer (1) liefert eine Kombination von Infrarot- und sichtbaren Spektrums Bilder und Temperaturdaten. Die spektrale Empfindlichkeit der Kamera ist im Bereich von 7,5 bis 13,5 um und liefert 640 x 480 Pixel Auflösung. Sichtbaren Spektrums erzeugt Bilder durch die integrierte Kamera mit IR-Bilder in Echtzeit, was die Auslegung komplexer, Wärmebilder erleichtert fusioniert werden. Eine Reihe von Linsen für die Kamera verwendet werden, um Nahaufnahmen und mikroskopische Beobachtungen zu machen. Die Kamera kann in einem Standalone-Modus verwendet werden, oder eine Schnittstelle mit einem Laptop mit propietary Software gesteuert. Die Software kann verwendet werden, um eine Vielzahl von in den aufgezeichneten Videos eingebettet thermische Daten zu erhalten. Es ist wichtig anzumerken, dass eine Vielzahl von Infrarot-Radiometer sind kommerziell verfügbar. Daher ist es wichtig, dass die Forscher über ihre vorgesehene Anwendung mit einem erfahrenen Produktingenieur und dass der Forscher testen die Fähigkeit eines spezific Radiometer, um die erforderlichen Informationen zur Verfügung stellen. Das bildgebende Radiometer in der beschriebenen Protokoll verwendet wird, in einem Acryl-Box mit Styropor i n, um die Exposition während der Erwärmung und Abkühlung Protokolle, um Kondensation abzuschrecken isoliert (Abbildung 2) platziert. Dieser Schutz wird nicht für alle Kameras oder Anwendungen benötigt.

Protocol

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien

1. Verwenden Sie entweder Blätter oder ganze Pflanzen unterliegen Pflanzenmaterial (Hosta spp. Oder Phaseolus vulgaris).

2. Herstellung von Wasserlösungen, die Eisnukleation Aktiv (INA) Bacteria

1. Kultur der INA Bakterium Pseudomonas syringae (Stamm Cit-7) in Petrischalen bei 25 ° C auf Pseudomonas Agar F mit 10 g / l 100% Glycerin gemäß den Hersteller Richtung vorbereitet.
2. Nach Kulturen ausreichend, bei 4 ° C gezüchtet, bis sie benötigt aber halten Sie bei 4 ° C für zwei Tage vor der ein hohes Maß an Eiskeimbildungsaktivität gewährleisten.
3. Schaben Bakterien aus einer einzigen Platte von der Oberfläche des Agars mit einem Kunststoff, wegwerfbar oder wiederverwendbar Spatel zum Zeitpunkt der Verwendung und in 10-15 ml entionisiertem Wasser in einem 25 ml-Einwegküvette. Die Konzentration sollte im Bereich von 1 × 10 ⁷ bis 1 x 10 ⁹ be ^· -1. Die Lösung wird trübe erscheinen. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Konzentration unter Verwendung eines Hämozytometers oder Spektralphotometer bestätigen, wie Konzentration muss nur ungefähr sein.
4. Vortexen Küvette für ein Minimum von 10 Sekunden, um die Bakterien zu verteilen.
   Hinweis: Die spezifische Konzentration des erhaltenen INA Gemisch ist nicht wichtig, und die beschriebenen Protokoll wird mehr als ein angemessenes Niveau der Eiskeimbildungsaktivität. Diese Mischung von INA-Bakterien und Wasser wird dann in den Keim Experimente eingesetzt werden.

3. Einrichten eines Freezing Experiment

1. Legen Sie die hochauflösende Infrarotkamera (SC-660) im Inneren des Schutz Acryl-Box, so dass die Linse durch die Öffnung in der Vorderseite der Box und die Drähte der Kamera an einen Laptop oder Aufnahmegerät Ausgang Verbindung durch die hintere Öffnung der Box . Sichern Sie den Deckel der Box und legen Sie das Feld in der Klimakammer oder Gefrierschrank an einem Ort, werden alleow Gegenstand Pflanzenmaterials abzuwarten.
   1. Geben Sie einen dunklen Hintergrund rund um die Pflanze Material von den Wänden der Kammer mit schwarzem Papier, um Störungen durch reflektierte Infrarotenergie zu verhindern.
   2. Setzen Sie die Kammer mit LED-Beleuchtung, um Heizung von der Lichtquelle zu minimieren, wenn die Aufzeichnung von Bildern in sichtbaren Wellenlängen erforderlich ist. Nur ein Minimum an Licht, wie beispielsweise eine batteriebetriebene Schrank Licht oder andere kleine LED-Vorrichtung wird benötigt für die Pflanzen durch die Kamera sichtbar sind.
      1. Sobald sichtbare Bilder des Themas Pflanzenmaterial aufgenommen werden, schalten Sie die LED-Beleuchtung. Alle von externen Kabelverbindungen (FireWire-Anschluss zum Computer, Netzkabel, etc.), um die Kamera über einen Port oder eine andere Öffnung in der Kammer.
   3. Füllen Sie zusätzlichen Platz im Hafen oder die Öffnung mit isolierendem Schaummaterial zu vermeiden oder zu reduzieren Temperaturgradienten innerhalb der Kammer. Stellen Sie die Anfangstemperatur der Kammer bei 1 ° C.
2. Ausrichten Pflanzen oder Pflanzenteile, so dass das Pflanzenmaterial in der Gesichtsfeldansicht der Kamera und das Pflanzenmaterial sichtbar ist auf der Fernbetrachtungsschirm oder innerhalb des gewählten Software.
3. Erlauben Pflanzen auf 1 ° C für 30 min bis 1 Stunde vor dem Einleiten eines gesteuerten Gefrier Experiment äquilibrieren, abhängig von der Größe des Pflanzenmaterials. Dies stellt sicher, dass die Temperatur der Anlage nicht hinter Lufttemperatur liegen sie um viele Grade sobald das Einfrieren Experiment begonnen wird. Äquilibrierung wird erreicht, wenn die Temperatur des Pflanzenmaterials innerhalb von 0,5 ° C Lufttemperatur.
   1. Eine Schicht Styropor-Isolierung auf dem Boden von Topfpflanzen, wenn Topfpflanzen eingesetzt werden. Sobald die Pflanzen äquilibriert beginnen Abkühlen der Kammer.
      Anmerkung: Die Isolationsschicht auf der Bodenoberfläche des Topfes reduziert den Wärmeverlust weiter aus dem Topf zur Luft die Pflanze umgibt, und verhindert, dass die Wurzeln aus freezing, da dies in der Regel nicht während einer Frostereignis in der Natur vorkommen würde aufgrund der massiven Reservoir im Boden vorhandene Restwärme.
4. Stellen Sie die gewünschten Kameraparameter (Farbpalette, Temperaturbereich, bestimmte Bereiche von Interesse, etc.), wie in 3.4.1-3.4.4 diskutiert.
   1. Wählen Sie den Regenbogen-Palette, um die Temperaturschwankungen angezeigt, während Sie das Live-Bild.
   2. Den Temperaturspanne auf 5 ° C durch Einstellen der Temperatur Leiste unter dem Bild in der Software liegt.
   3. Wählen Sie die lineare Skala (Algorithmus) zur Umwandlung der Infrarotdaten in das Falschfarbenbild, wie durch die ausgewählte Palette (rainbow) definiert und stellen Sie den Temperaturbereich bis 5 ° C und automatisch zu verfolgen auf der Basis des Bildes. Alternativ können die eingestellten Bereich manuell einzustellen, während Durchführung des Experiments.
      1. Verwenden Sie die Temperatur einen bestimmten Punkt oder eine durchschnittliche Temperatur innerhalb des definierten interessierenden Bereich von der Softw bereitgestelltsind. Abrufen der Temperaturdaten aller Pixel aus der aufgezeichneten Videosequenz oder aus den Informationen in der Bilddatei eingebettet sind, Fig. 3 zeigt eine typische Bildschirm aus ResearchIR Software.
   4. Platzieren Sie einen Cursor auf einem Standort auf dem Pflanzengewebe, die einen bestimmten Punkt von Interesse darstellt. Definieren Sie den Bereich von Interesse als Punkte (1 -3 Pixel groß), Boxen, Linien, Ellipsen oder Kreise. Mehrere Kombinationen von Punkten oder Formen können auf das Bild befinden.
5. Aufzeichnen einer Videosequenz
   1. Stellen Sie die Kamera auf 60 Hz und für die Aufnahme manuell gestoppt werden aufzuzeichnen.
   2. Geben Sie die Stelle auf dem Computer oder einem externen Laufwerk, in dem die aufgenommene Videodatei platziert wird.
   3. Beginnt die Aufnahme.
      Hinweis: Aufnahme auf eine externe Festplatte ist sehr zu empfehlen, da große Video-Dateien generiert. Aufgenommenen Videodateien können später bearbeitet werden, um nur den Teil mit dem ne enthalten seinwendigen Informationen. Dies wird erheblich reduziert die Dateigröße.
   4. Senken Sie die Temperatur der Kammer schrittweise um 0,5 -1,0 ° C. Warten Sie, bis die Anlage Temperatur im Gleichgewicht mit Lufttemperatur und dann senken Sie die Temperatur wieder um 0,5 bis 1,0 ° C. Je nach Masse des Pflanzengewebes beobachtet und ihre Morphologie kann Äquilibrierung 10-15 min dauern. Somit geben eine Abkühlgeschwindigkeit von etwa 4 ° C / h beträgt.
   5. Fahren Sie so fort, bis die Anlage friert und Beobachtungen abgeschlossen sind. Beenden Sie die Aufnahme, wenn der Gefrierprozess abgeschlossen ist.
      Hinweis: Das Pflanzengewebe wurde mit Luft Temperatur äquilibriert, wenn das Pflanzenmaterial und den Hintergrund dieselbe Farbe haben, da sie bei der gleichen Temperatur. Da der Hintergrundtemperatur und der Temperatur des Pflanzengewebes gleich sind, kann es schwierig sein, das Pflanzenmaterial zu visualisieren, bis wieder senken die Temperatur, und es ist die Temperaturdifferenz zwischen dem Pflanzengewebe undir Temperatur.

Representative Results

Ice-Keimbildungsaktivität der Ice + Bakterium Pseudomonas syringae (Stamm Cit-7)

Ein 10 ul Tropfen Wasser und 10 ul Wasser, P. syringae (Cit-7) wurden auf der Oberfläche eines abaxial Hosta Blatt gelegt (Hosta spp.) (Figur 4). Wie dargestellt, ist der Wassertropfen, die die INA Bakterien erstarrte erste und war für das Blatt zu induzieren zu frieren, während der Tropfen Wasser auf der Blattoberfläche blieb nicht gefrorenen verantwortlich.

Einfrieren und Ice Propagation in einem Woody Plant

5 veranschaulicht sowohl die Initiierung und Eis Eis Ausbreitung in einem Stamm der Eiche (Quercus robur). Eisbildung wurde im Kambium Phloem Bereich des Schaftes initiiert und in Umfangsrichtung um den Schaft propagiert. Die Rate der Eisausbreitung in holzigen Pflanzenstiele in Längsrichtung viel größer ist als in einer seitlichen und circumferenzRichtung. ³¹

Preise von Ice Vermehrung und Hemmnisse Ice Propagation

Ice wurde in den Stamm einer Bohnenpflanze (P. vulgaris) an der Stelle, INA Bakterien vorgelegt wurde (6A, Pfeil) eingeleitet. Nach der anfänglichen Einfrieren Ereignis propagiert Eis nach oben und unten den Stamm (6B-C). Verwendung der Videosequenz, die eine Zeitmarke aufweist, und Messen des Abstands auf dem Schaft, ermöglicht es, die Geschwindigkeit der Eisausbreitung über eine gegebene Distanz zu berechnen. Der Graph in 6 zeigt die Rate der Eisausbreitung bis der Stiel der Bohnenpflanze von dem Punkt des anfänglichen Gefrieren und zeigt eine verringerte Rate des Eisausbreitung als Eis durch den Knotenbereich der Anlage gelangt. Verwendung von Infrarot-Thermographie ermöglicht auch, die Anwesenheit von irgendwelchen physikalischen Hindernissen, die die Ausbreitung von Eis in spezifischen Geweben zu verhindern bestimmen. Figur 7 </ Strong> stellt das Einfrieren in einem alpinen Arten, Loiseleuria procumbens, wo der vegetative Teil (Stengel und Blätter) der Pflanze wurde eingefroren, aber das Terminal Blütenknospen noch nicht gefroren. Eisbildung erst 126-164 min treten nach dem Einfrieren der Stengel und Blätter stattgefunden hatte und die resultierende exotherme Reaktion verbraucht war. Als Fortpflanzungs Triebe der alpine Holzarten sind Einfrieren empfindlicher ^3,33, ist das Einfrieren Vermeidung zu Fortpflanzungserfolg von entscheidender Bedeutung.

Fähigkeit Hydrophobsperren nach Block Extrinsische Eisnukleation Induzierte Freezing

Eine Tomatenpflanze (Solanum lycopersicum) wurde mit einer hydrophoben Kaolin basierenden Material (8A), um festzustellen, ob die hydrophobe Barriere könnte extrinsische Eisnukleation induzierte Einfrieren blockieren beschichtet. Der Grad des Kontakts der Flüssigkeitströpfchen mit der Blattoberfläche war in unbeschichteter Blätter viel größer ( (8C). Wie in 8D dargestellt, unbeschichtet Pflanzen (rechts) zeigte eine exotherme Ereignis typisch für ein Einfrieren Ereignis, während beschichtete Pflanzen (links) blieb nicht gefroren und auf etwa -6,0 ° C unterkühlt. Die Einzelheiten dieser Versuche können in Wisniewski et al. ³⁴ Ein Trend der größeren Hydrophobie in der Blattstruktur der einheimischen Pflanzenarten entlang eines Höhengradienten wurde von Aryal und Neuner festgestellt worden. ³⁵

Abbildung 1. Hochauflösende Infrarot-Radiometer. Das abgebildete Modell ist eine FLIR SC-660 Infrarot-Videokamera.

Abbildung 2. Schutzgehäuse für die Infrarot-Kamera. Ein Acrylfeld wird verwendet, um die Kamera unterzubringen und die Bildung von Kondenswasser auf der Infrarot-Kamera zu verhindern, während Einfrieren und Auftauen Experimente. (A) mit Top-Box entfernt werden. (B) die Kamera in der Acryl-Box eingelegt und der Deckel geschlossen ist.

Abbildung 3. Anzeigen und Analysieren von Wärmebildern und Remote Camera Control. Screenshot vom ResearchIR Software. Die Software wird verwendet, um das Live-Bild in den Bildern zu sehen, die Kameraeinstellungen ändern, Aufzeichnung einzelner Bilder, Videoaufnahmen zu machen, und zu analysieren, Temperaturdaten. Legen Sie auf der rechten Seite zeigt Optionen zum Ändern der Kameraeinstellungen während Einsatz auf unten links zeigt eine Temperatur Histogramm des Livebildes.

Abbildung 4. Extrinsische Keimbildung induziert Einfrieren von Hosta Blatt (Hosta spp.). Nicht fixierte Tropfen von Wasser und INA Bakterien, Pseudomonas syringae (Stamm Cit-7), sind auf der abaxial Oberfläche des Blattes (A) vorhanden ist. INA Tröpfchen einfriert ersten (B) und initiiert Einfrieren des Flügels (C). Eis breitet sich in dem Blatt (D) und auch nach dem Einfrieren des Blattes, bleibt der Wassertropfen nicht gefrorenen (E). Wassertropfen auf der Oberfläche des Blatt friert, nachdem die gesamte Blatt wurde eingefroren und fängt an, an ihren Rändern (F) abkühlen.

Abbildung 5. Ice Beginn und die Ausbreitung in den Stamm einer Gehölz (Quercus robur) Left Panel:. Querschnitt durch einen holzigen Stamm der Eiche. (AH) Initiierung von Einfrieren Ereignis im Bereich des Phloem und Kambium (A) und das Fortschreiten der Eisbildung um den Stamm (B - H). Kuprian und Neuner, unveröffentlicht.

Abbildung 6. Rate von Eis Ausbreitung in einer Bohnenpflanze (Phaseolus vulgaris), berechnet mit hochauflösenden Infrarot-Thermografie. (A) in der Stamm Ice (Pfeil) eingeleitet. (B - C) Ice Ausbreitung nach oben und unten den Stamm. Graph an der Spitze der Abbildung zeigt die Geschwindigkeit der Ausbreitung Eis, wie der Abstand Eis präsentiert reiste im Laufe der Zeit, wie es bewegt den Stamm von der Original-Website des Einfrierens. Eine Verzögerung bei der ice Ausbreitung stattgefunden wie Eis bewegt durch den Knoten Teil der Pflanzenstängel. Diese Zahl wurde von Wisniewski et al modifiziert. ²⁴

Abbildung 7. Barrier zu Eisbildung in der alpinen Gehölz, Loiseleuria procumbens (alpine azalea). (A) Sichtbares Licht Bild der Stamm der alpine azalea zeigt zentralen Stamm, befestigt Blätter und Blütenständen. (B - C) Freezing wird im Stamm initiiert und Eis breitet sich heraus in Blättern. Endknospen bleiben nicht gefroren. (D - E) Endknospen einfrieren unabhängig 126-164 min nach dem anfänglichen Einfrieren von Stamm und Blätter. Während dieser Zeit die Wärme der Enthalpie vom Einfrieren der Stengel und Blätter erzeugt bereits abgeführt. Kuprian und Neuner, unpublished.

Abbildung 8. hydrophobe Barrieren blockieren extrinsische Keimbildung induziert Einfrieren von Tomaten (Solanum Lycopersicon). (A) hydrophob Tomatenpflanzen angewandt Kaolin basierenden Material. (B - C). Reduziertes Niveau einer Berührung zwischen der Blattoberfläche und Tropfen von Flüssigkeit, die INA-Bakterien auf beschichteten (B) vs. unbeschichteten (C) Blätter. (D) Uncoated Pflanze (rechts) erfährt eine exotherme Reaktion mit Einfrieren der Anlage verbunden, während beschichtete Pflanzenreste unterkühlten und nicht gefroren bei etwa -6 ° C. Diese Zahl hat sich von Wisniewski et al modifiziert worden ist. ³⁴

Discussion

Wasser hat die Fähigkeit, auf Temperaturen von weit unter 0 ° C und der Temperatur, bei der Wasser gefriert können ziemlich variabel sein, zu unterkühlen. ³⁶ Die Temperaturgrenze für die Unterkühlung von reinem Wasser beträgt etwa -40 ° C und wird als die homogene Keimpunkt definiert. Wenn Wasser gefriert bei Temperaturen wärmer als -40 ° C wird durch die Anwesenheit von heterogenen Keimbildnern, dass gebracht ermöglichen kleinen Eis Embryonen zu bilden, die dann als Katalysator für die Bildung von Eis und Wachstum zu dienen. ³⁷ Es gibt eine Vielzahl von Molekülen in der Natur, wirken als sehr effizient Eis Nukleierungsmittel, daher am Einfrieren von Wasser in der Natur auftritt bei Temperaturen knapp unter 0 ° C. Die Fähigkeit, die Aktivität von heterogenen Nukleierungsmitteln regulieren oder beeinflussen, ein beträchtliches Potenzial als neuartige Ansatz zur Bereitstellung von Frostschutz auf Pflanzen. Zu verstehen, wie Eis bildet und breitet sich in Einfrieren empfindlicher und Einfrieren tolerante Pflanzen ist wichtig, um achieving dieses Ziel.

Wie in der Einleitung angegeben ist, wurden verschiedene Verfahren verwendet, um den Gefrierprozeß in Pflanzen, die unter Laborbedingungen untersuchen jedoch Einfrieren von Pflanzen in der Natur hauptsächlich mit der Verwendung von Thermoelementen überwacht. Hochauflösende Infrarot-Thermografie (HRIT) ^24-28,34 bietet mehrere deutliche Vorteile als ein Verfahren zur Untersuchung der Gefrierprozess in Pflanzen. HRIT ermöglicht, den Ort der ersten Eisbildung zu beobachten, die Anzahl von Gefrierereignissen erforderlich, um eine ganze Pflanze einzufrieren, tatsächlich beobachten, wie sich das Eis in einer Pflanze ausbreitet und, wenn irgendwelche Hindernisse Eisausbreitung vorhanden sind, und bestimmen, ob irgendwelche Abschnitte einer Pflanze bleiben eisfrei. Am wichtigsten ist, erlaubt es einem, den Gefriervorgang in ganzen Pflanzen statt kleine, isolierte Abschnitte einer Pflanze, die von der Mutterpflanze entfernt wurden, zu beobachten.

Der vorliegende Bericht beschreibt die Anwendung von HRIT dem Studium der freezing in intakten Pflanzen oder Pflanzenteile, und bietet einige Beispiele, wie diese Technologie verwendet, um mehrere Parameter, wie und bei Eisbildung in Pflanzen beeinflussen können, zu untersuchen, und wie Eis ausbreitet. Kritischen Aspekte der Durchführung dieser Studien beinhalten die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Infrarotkamera, die in der Einrichtung von der Kamera und der Speicherung von Videosequenzen verwendeten Parameter die Abkühlgeschwindigkeit, die strukturelle / morphologischen Komplexität des Gegenstandes sichtbar sind, und das Wissen über Infrarot-Wissenschaft. Diese Punkte werden einzeln adressierbar ist.

Empfindlichkeit und Genauigkeit des Infrarotkamera (Radiometer)

Die exotherme Ereignisse beim Einfrieren von Pflanzengeweben, die visualisiert werden, sind sehr klein und reicht von <0,1 bis etwa 0,5 ° C. Deshalb muss die Infrarotkamera empfindlich genug sein, um leicht unterscheiden, kleine Änderungen in der Temperatur. Temperaturgenauigkeit ist auch ein wichtiger Aspekt underfordert, dass die Kamera auf einer regelmäßigen Basis (mindestens einmal pro Jahr) kalibriert. Dies kann zwar durch den Benutzer durchgeführt werden, erfordert es die Verwendung von mehreren schwarzen Körper mit einem breiten Bereich von Temperaturen. Daher ist es am besten, um die Kamera Werk kalibriert haben. Wenn eine hohe Temperaturgenauigkeit ist absolut notwendig, ist es sehr empfehlenswert, dass ein Thermoelement in Verbindung mit der Infrarotkamera verwendet werden. Dies kann angebracht sein nahe dem untersuchten Objekt um eine genaue Schätzung der Lufttemperatur zu ergeben.

Kameraparameter

Eine Vielzahl von Parametern auf fortschrittliche, High-End-Infrarot-Kameras eingestellt werden. Bei der Verwendung der Kamera zu betrachten und / oder aufzeichnen Gefrierereignissen, ist es wichtig, daß die Bildmittelung, um ein verrauschtes Bild zu verkleinern verwendet werden, wodurch es leichter zu Pflanzenteilen und Gefrierereignissen darzustellen. Bildmittelung erfolgt, wenn ein Bild mit hoher Qualität in den Kameraeinstellungen aktiviert ist. Da kleinere Einfrieren exothermens zu erwarten sind, ist es auch wichtig bei der Anzeige der Gefrierprozess, um die temperture Spannweite von der Kamera eingestellt ist, um einen kleinen Temperaturbereich abdecken (2-5 ° C). Dies ist erforderlich, da die Software über die volle Spannweite für die Kamera eingestellt verteilen die ausgewählte Farbpalette. Deshalb, wenn es 10 Farben in der Palette und ein den Bereich auf 100 ° C eingestellt wurde, die nur eine Änderung in der Farbe sein, wenn es eine 10 ° C Temperaturänderung. Eine hohe Erfassungsrate (zehn Bilder pro Sekunde) sollte verwendet werden, so dass kleine exotherme Ereignisse, die sich schnell zerstreuen, nicht entgehen lassen. Verschiedene Farbpaletten und Graustufen können aus einem Dropdown-Menü ausgewählt werden. Auswahl des am besten geeigneten Palette sollte, ob es die beste Möglichkeit zur Visualisierung der thermischen Ereignisse von Interesse basieren. Erweiterte Kameras bieten auch verschiedene Optionen für die Aufnahme einer Videosequenz und / oder die Erfassung von Einzelbildern. Eine bestimmte Anzahl von Rahmen über eine bestimmte Zeitdauer gewählt werden.Dies ist am besten für die Aufzeichnung-Sequenzen von kurzer Dauer (Minuten) statt Stunden. Alternativ kann die Anzahl der Bilder pro Sekunde angezeigt werden, und die Kamera eingestellt Aufnahme manuell oder nach einer bestimmten Anzahl von Rahmen, um zu stoppen. Erweiterte Kameras bieten auch die Möglichkeit für Aufnahmen zu beginnen oder enden, basierend auf vordefinierten Trigger (Temperatur oder Zeit).

Kühlrate

Es ist wichtig, dass die Temperatur des pflanzlichen Materials betrachtet wird nicht dramatisch von der Lufttemperatur während der Abkühlung abweichen. Wenn die Temperatur zu schnell gesenkt werden Pflanzen unterkühlen und frieren bei einer niedrigeren Lufttemperatur, als sie unter natürlichen Kühlraten würde. Die meisten Studien empfehlen eine Abkühlgeschwindigkeit von 1-2 ° C h ^-1, insbesondere bei Temperaturen oberhalb -5 ° C, was ausreichend Zeit für die Pflanzen bis zum Gleichgewicht mit der Lufttemperatur kommen bietet. In Wirklichkeit kann das Pflanzenmaterial ins Gleichgewicht viel schneller kommen. Diesekann durch Vergleichen der Temperatur des pflanzlichen Materials mit der Temperatur des Hintergrundes in der Umgebung der Anlage bestimmt werden. Wenn die Anlage im Gleichgewicht ist, wird es schwierig, die Pflanze aus dem Hintergrund in dem Infrarotbild zu erkennen, wie es bei der gleichen Temperatur wie der Hintergrund und das Bild erscheint in der Farbe fast homogen.

Struktur morphologischen Komplexität des betrachteten Objekts

Da die Bilder betrachteten stellen Bilder von Temperatur, werden Objekte, die überlappen, als zusammenhängende Objekte statt diskreter Objekte erscheinen. Dies kann, wo anspruchsvolle Einfrieren Ereignisse auftreten sehr schwierig und auch die Schwierigkeiten bei der Bestimmung, wie Eis, die in der Anlage zu erhöhen propagiert. Der beste Weg, um mit diesem Problem umzugehen ist, erste Arbeit mit einfachen Objekten (einzelne Blätter, Stengel, etc.) und dann aufzubauen, um komplexere Objekte. Erfahrung im Umgang mit spezifischen material hat großen Wert im Umgang mit diesem Problem. Zusätzlich kann die Fähigkeit, das Infrarotbild auf einem digitalen, sichtbare Lichtbild überlagert auch eine große Hilfe bei der Analyse und das Verständnis der Infrarotdaten.

Die Kenntnis der Infrarot-Wissenschaft

Zwar wäre es vorteilhaft, in der Lage, einfach die Kamera auf ein Objekt sein und wissen, dass die empfangenen Temperaturdaten ist zu 100% korrekt, zu verstehen, wie Infrarotenergie in Wechselwirkung mit seiner Umgebung können diejenigen zu verstehen, wie am besten die Forschungsqualität zu verwenden, stark erhöhen Infrarot-Kameras und die Daten interpretieren. Man sollte ein wenig vertraut mit den Begriffen Emissionsgrad, Reflexionsvermögen und die Absorption zu werden. In den meisten Fällen kann die Kamera ohne sich um diese Parameter verwendet werden, jedoch können sie helfen, die Art des Bildes, das angezeigt wird, und sein Gesamt Qualität und Genauigkeit zu erläutern. Kurz gesagt, wenn Infrarot-Energie auf ein Objekt trifft es entweder reflected oder absorbiert und emittiert. Die Art der untersuchten Objekt kann daher die Genauigkeit der Daten, die empfangen werden. Wenn ein Objekt einen hohen Reflexionsgrad, wird man ein Bild mehr Vertreter der umliegenden Objekte, die emittierende Infrarotenergie sind als das Objekt selbst zu empfangen. Absorption der Infrarotenergie ohne Emission der Infrarotenergie kann auch auf den Erhalt falschen Temperaturdaten von dem Objekt führen, untersucht. Die Kamerasensoren ein emittierte Infrarotstrahlung und daher sind die genauesten Temperaturen von Objekten, die eine hohe Emissivität aufweisen, erhalten. Glücklicherweise Pflanzen haben einen hohen Emissionsgrad ermöglicht genaue Temperaturmessungen. Niedrigere Emissionsgrad kann durch Einstellung dieser Parameter in den Kameraeinstellungen, die dann zu verwenden ist ein Algorithmus, eine angemessene Anpassung der Temperaturanzeige machen kompensiert werden.

Die Fähigkeit, genau zu bestimmen, wie und wann Pflanzen einfrierenist wesentlich für das Verständnis der Evolution von gefrierVermeidungsMechanismus und die Rolle der Anlagenstruktur in der Gefrierprozess. Einfrieren, trotz ihrer scheinbaren Einfachheit ist ein komplexer Vorgang und Pflanzen haben eine Vielzahl von strukturellen Änderungen entwickelt, um ein Einfrieren zu vermeiden, compartmentalize Eisbildung und verhindert die Ausbreitung von Eis. Hochauflösende Infrarot-Thermografie ist ein neues und leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Komplexität des Gefrierprozesses in Pflanzen zu studieren und führen zur Entwicklung wirksamer neuer Methoden der Frostschutz. Ein besseres Verständnis der Gefriertvermeidung können uns auch helfen, zu verstehen, wie diese Anpassungsmechanismen entwickelt haben, und die Rolle, die sie in die Biologie und das Überleben der verschiedenen Pflanzenarten zu spielen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1