Abstract
En la recuperación in situ (ISR) es el método predominante de extracción de uranio en los Estados Unidos. Durante ISR, el uranio es lixiviado a partir de un cuerpo de mineral y se extrae a través del intercambio de iones. La producción resultante de purga de agua (PBW) contiene contaminantes como el arsénico y otros metales pesados. Las muestras de PBW de una instalación de uranio ISR activa fueron tratados con nanopartículas de óxido cúprico (CuO-PN). Tratamiento CuO-NP de PBW reducida contaminantes prioritarios, incluyendo arsénico, selenio, uranio y vanadio. Ensayo no tratada y CuO-NP tratada PBW fue utilizado como el componente líquido de los medios de crecimiento celular y los cambios en la viabilidad se determinaron por el MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) en el riñón embrionario humano (HEK 293) y células de carcinoma hepatocelular humano (Hep G2). Tratamiento CuO-NP se asoció con una mejor HEK y la viabilidad celular HEP. Las limitaciones de este método incluyen la dilución de la PBW por componentes de medios de crecimiento y durante osmollidad de ajuste, así como el ajuste de pH necesario. Este método está limitado en su contexto más amplio debido a los efectos de dilución y los cambios en el pH de la PBW que es tradicionalmente ligeramente ácido sin embargo; este método podría tener un uso más amplio de evaluar el tratamiento CuO-NP en aguas más neutrales.
Introduction
Aproximadamente el 20% del suministro eléctrico de Estados Unidos es proporcionada por la energía nuclear y, basado en parte en los incentivos nacionales para aumentar la independencia energética, los Estados Unidos se espera la capacidad nuclear para aumentar 1. El crecimiento mundial de la energía nuclear también se espera que continúe, con gran parte del crecimiento que ocurre fuera de los EE.UU. 2. A partir de 2013, se importó el 83% de uranio de Estados Unidos, pero existen 952.544 toneladas métricas de reservas en los EE.UU. 3,4. En 2013 hubo 7 nuevas aplicaciones de las instalaciones y aplicaciones 14 reinicio / dilatación entre Wyoming, Nuevo México y Nebraska 5. En los EE.UU., el uranio se extrae predominantemente a través de la recuperación in situ (ISR) procesa 6. ISR causa menos interrupciones tierra y evita la creación de montones de relaves que pueden liberar contaminantes ambientales 7. ISR utiliza soluciones oxidantes a base de agua para lixiviar el uranio desde el cuerpo de mineral de bajo tierra, después de lo cual el uranio se extrae de la lixiviados a travésun proceso de intercambio de iones 8. Para mantener un balance hídrico negativo en el cuerpo de mineral, una parte de los lixiviados, llamado producción sangrar agua (PBW), está purgado. Una parte de la PEP se descontamina mediante ósmosis inversa (RO) y re-introducido en el proceso de minería, pero PBW también podría tener usos industriales o agrícolas beneficiosas, si los contaminantes tóxicos pueden reducirse a niveles aceptables determinadas por los organismos reguladores estatales para la superficie y subterránea 9. Actualmente, la mayoría de las instalaciones de uranio ISR utilizan RO para eliminar los contaminantes de PBW. Sin embargo, el procesamiento RO consume mucha energía y produce salmuera residuos tóxicos, que requiere la eliminación regulada.
Existen muchos métodos de descontaminación de agua, incluyendo adsorbentes, membranas, y el intercambio de iones. De éstos, la adsorción es el más comúnmente utilizado, y los acontecimientos recientes en la síntesis de nanopartículas ha mejorado las capacidades de descontaminación del agua basada en procesos adsorbente 10. Oxi cúpricode nanopartículas (CuO-PN) no habían sido estudiados ampliamente en uranio ISR PBW, pero en estudios recientes de eliminación de contaminantes de las aguas subterráneas, CuO-PN se encontró que tienen propiedades únicas, entre ellas que no requiere etapas de tratamiento de aguas antes o después ( por ejemplo, el ajuste de pH o potencial redox) y un buen rendimiento en diferentes composiciones de agua (por ejemplo, en diferentes pHs, concentraciones de sal, o iones que compiten) 11. Además, CuO-NPs son fácilmente regenerados por lixiviación con hidróxido de sodio (NaOH), después de lo cual la regenerado CuO-NPs puede ser reutilizado. Detalles de CuO-NP metales traza capacidades de filtrado de aguas naturales han sido publicados anteriormente 11-14.
Aunque útiles para el tratamiento de agua, las nanopartículas de óxido de metal pueden ser tóxicos para los organismos vivos, pero la extensión de la toxicidad depende, en parte, en las características de nanopartículas y componentes 10,15,16. Por lo tanto, es importante para estudiar simulttoxicidades aneous eliminación y nanopartículas de contaminantes antes de aplicaciones de campo. El presente estudio determinó la capacidad de CuO-PN para eliminar los contaminantes prioritarios PBW (incluyendo arsénico, selenio, vanadio y uranio), y se evaluó el efecto del tratamiento CuO-NP en PBW citotoxicidad.
PBW se recogió de una instalación de uranio ISR activo y utilizado para determinar la eficacia del tratamiento CuO-NP en la eliminación de contaminantes de prioridad. PBW citotoxicidad antes y después del tratamiento CuO-NP también se evaluó. PBW es un geológica compleja mezcla (industrial / ambiental) y tanto el Instituto Nacional de Salud Ambiental y Ciencia (NIEHS) y la Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades (ATSDR) están poniendo énfasis en el estudio de la toxicidad de mezclas de relevancia ambiental, incluidas las mezclas tal como existen en la naturaleza o industriales configuración, así como la promoción en pruebas in vitro para dar prioridad a los productos químicos para pruebas posteriores in vivo17-19. Los estudios de las exposiciones, la mezcla de baja dosis crónicas son un reto debido a la exposición crónica a una mezcla de baja dosis no produce efectos evidentes, al menos no en el corto período de tiempo de la mayoría de los estudios de laboratorio. Del mismo modo, la mayoría en estudios in vitro de mezclas químicas exponga las células a una mezcla de laboratorio hechas definido de 2 o más metales 20,21. Estos estudios proporcionan información de referencia, pero mezclas simplificados no se replican las complejas interacciones sinérgicas y antagónicas que pueden ocurrir en una muestra ambiental natal, donde están presentes la gama completa de componentes de la mezcla.
Los objetivos de este estudio fueron examinar los procesos de eliminación de contaminantes alternativos para PBW y para evaluar el efecto del tratamiento (CuO-NP) en PBW citotoxicidad usando células humanas cultivadas. Los resultados podrían beneficiar a la industria del uranio mediante el desarrollo de métodos más eficientes o amigables con el ambiente para la eliminación de contaminantes. Este estudio proporcionala primera evidencia de que la reducción de contaminantes prioritarios en PBW por CuO-PN reduce la citotoxicidad en células de mamíferos 22.
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Protocol
Todas las muestras se recogieron en el edificio de procesamiento de líquidos de uranio de una instalación de ISR uranio en Wyoming.
1. Producción de purga de agua (PBW)
- Recoge dos tipos de muestras de agua de una planta de uranio ISR: PBW y ósmosis inversa (RO) de agua. Recoger PBW de un grifo seguimiento al finalizar el proceso de intercambio de iones, pero antes de la descontaminación de ósmosis inversa. Recoger muestras RO después de la PEP se descontamina por el tratamiento de ósmosis inversa.
NOTA: Lixiviante se transporta en tuberías de varios campos así a la construcción de procesamiento de líquidos de uranio, donde se recoge en una columna y se preparó para el intercambio de iones. Aproximadamente el 1-3% de la lixiviante después de intercambio iónico se retira del circuito y del agua de purga de producción denominado (PBW). PBW se vuelve a utilizar en los procesos mineros o descontaminar / desmineralizada con la filtración de ósmosis inversa. - Recoger muestras de agua en polietileno de alta densidad (HDPE) con espacio de cabeza cero de acuerdoa los procedimientos operativos estándar para la recolección y el análisis del Departamento de Calidad Ambiental de Wyoming (WYDEQ) 23 muestra.
- Medir la temperatura y el pH en el lugar y muestras de transporte en hielo para mantenerlos frescos.
- PBW Almacenar a 4 ° C. Mantenga la solución PBW fresco hasta después de medio esencial mínimo (EMEM-10x) del Águila concentrado se añade durante la preparación de los medios de comunicación como se indica en el siguiente protocolo.
NOTA: PBW es una solución oxidada que precipitará si se le permite congelar o calentó a temperatura ambiente. Después de la dilución la solución PBW es suficientemente diluida que no va a precipitar cuando se calienta a 37 ° C antes de la aplicación a las células y durante la incubación.
2. Preparación de CuO nanopartículas (CuO-PN)
- Combinar una solución etanólica puro que contiene 250 ml de 0,2 M CuCl 2 • 2H 2 O, 250 ml de hidróxido de sodio 0,4 M (NaOH), y 5 g de polietilenglicol (PEG) en un matraz de fondo redondo con seis mm bolas de cristal de borosilicato.
- Coloque la solución en un horno de microondas modificado y permitir que reaccione a reflujo a presión atmosférica durante 10 minutos a 20% de potencia (intervalos de 6 segundos en 24 segundos apagado).
- Enfriar la solución a temperatura ambiente (20 ° C), a continuación se decanta en tubos de 50 ml cónicos, dejando las bolas de vidrio.
- Centrifugar la solución en los 50 ml en tubos cónicos de 1.000 xg durante 30 min, se decantó y, a continuación, lavar el CuO-NPs con una secuencia de 300 ml de agua caliente (60-65 ° C), 100 ml de etanol y 100 ml de acetona.
- Seque el CuO-PN a la temperatura ambiente (20 ° C) en los 50 ml tubos cónicos.
- Raspe la CuO-PN de sus tubos en un mortero. Cubra el CuO-PN con papel de aluminio y calentar el CuO-PN a 110 ° C en un horno para eliminar el líquido restante. Combine CuO-PN en un solo lote y pesar el CuO-PN.
NOTA: La preparación de CuO-NPs y tratamiento CuO-NP de PBW se llevaron a cabo en agua Qualdad Laboratorio de Ciencias del Ecosistema y Gestión de la Universidad de Wyoming. CuO-NP síntesis siguió el procedimiento de Martinson y Reddy (2009) 11.
3. Tratamiento de PBW con CuO-PN
- Añadir 50 mg (1 mg / ml) de CuO-NP a un tubo cónico de 50 ml seguido por 50 ml de PBW. Sellar el tubo y se hizo reaccionar durante 30 minutos en la cima de agitación banco a 250 rpm.
- Tubos de muestra se centrifuga a 250 xg durante 30 min y luego filtrar el sobrenadante utilizando un filtro de jeringa de 0,45 micras. Alterar la velocidad centrífuga y el tiempo puede depender de la nanopartícula para asegurar la CuO-NPs convertirse compacto en el tubo de centrífuga.
4. Análisis Elemental
- Preparar sin tratar (control) y las muestras tratadas PBW-CuO-NP para el análisis elemental de la siguiente manera.
- Acidificar alícuotas (40 ml) de NP-tratada y no tratada CuO PBW con ácido nítrico de grado de trazas de metales a un pH de 2,0. Analizar alícuotas PBW acidificadas de cationes por coupl inductivamenteed plasma-espectroscopía de masas (ICP-MS) como se describe en Reddy y Roth (2012) 13.
- Preparar alícuotas no acidificado (20 ml) de NP-tratada y no tratada CuO PBW y analizar las alícuotas no acidificado para aniones por cromatografía iónica (IC) como se describe en Reddy y Roth (2012) 13.
NOTA: Las alícuotas fueron analizados por el Departamento de Servicios Analíticos Agricultura Wyoming, Laramie WY 82070. Una descripción del procedimiento IC y ICPMS se puede encontrar en Reddy y Roth, (2012) 13.
5. Preparación de Cultivo Celular Medios Usando PBW
- Utilice dos de control (EMEM-1x y RO + medios de comunicación) y ocho soluciones de medios de prueba PBW (cuatro concentraciones cada uno de PBW sin tratar y tratada con medios CuO-NP) en los estudios de viabilidad. Panorama de las soluciones son como sigue:
- Para el control de EMEM-1x, la compra mínima de comunicación esencial de Eagle (EMEM-1x) con L-glutamina y bicarbonato de sodio ya agregaron. Añadir suero fetal bovino (FBS) Y antibióticos según las instrucciones del fabricante.
NOTA: EMEM-1X se compra diluido a la concentración apropiada para el crecimiento celular y que contiene L-glutamina y bicarbonato de sodio. EMEM-1x requiere la adición de suero fetal bovino (FBS) y una mezcla de antibióticos de la penicilina y estreptomicina (50 UI / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina). EMEM-1X se utiliza como un medio de control, ya que es el medio de crecimiento recomendado por el fabricante para ambos tipos celulares utilizadas en este estudio. Concentrado EMEM-10x se diluye con agua RO de la instalación o no tratada o tratada-CuO-NP PBW para producir las soluciones de ensayo. Concentrado EMEM-10x cuando se compran no contiene L-glutamina o bicarbonato de sodio por lo que estos se añaden además del suero fetal bovino (FBS) y una mezcla de antibióticos de la penicilina y estreptomicina. - Para la solución de control RO utilizar agua RO recogidos de la instalación ISR. Utilice el mismo protocolo que los medios de prueba PBW único sustituto 100% RO water de la instalación de ISR en lugar de PBW. Para diluir el agua no tratada y el uso solución tratada-CuO-NP RO o ultrapura del laboratorio.
- Diluir sin tratar PBW en cuatro concentraciones de ensayo antes de la mezcla con los componentes de medios de cultivo celular. Preparar las cuatro concentraciones diferentes de soluciones de PBW no tratados mediante la mezcla de PBW no tratada con RO (de laboratorio) en las siguientes combinaciones: 100% (PBW puro + no hay agua RO), 75% (187,5 ml de PBW + 62,5 ml de agua RO), 50% (125 ml de PBW + 125 ml de agua RO) o 25% (62,5 ml de PBW + 187,5 ml de agua RO).
- Diluir CuO-NP-tratada PBW en cuatro concentraciones de ensayo antes de la mezcla con los componentes de medios de cultivo celular. Preparar las cuatro concentraciones diferentes de soluciones de PBW tratados con CuO-NP mezclando PBW (pre-tratados con 1 mg / ml CuO-NP para 30 min) con RO (de laboratorio) en las siguientes combinaciones: 100% (puro CuO- PBW tratada-NP + no hay agua RO), 75% (187,5 ml de tratado-CuO-NP PBW + 62,5 ml de agua RO), 50% (125ml de CuO-NP-tratada PBW + 125 ml de agua RO) o 25% (62,5 ml de PBW tratado con CuO-NP + 187,5 ml de agua RO).
- Para el control de EMEM-1x, la compra mínima de comunicación esencial de Eagle (EMEM-1x) con L-glutamina y bicarbonato de sodio ya agregaron. Añadir suero fetal bovino (FBS) Y antibióticos según las instrucciones del fabricante.
- Preparar 250 ml de RO + medios de comunicación, PBW sin tratar + medios de comunicación y concentración PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP mediante la adición de 25 ml de concentrado EMEM-10x a 190 ml de la RO 100% y el 100%, 75%, 50% o 25% de las concentraciones PBW no tratados o tratados con CuO-NP prefabricados creados en el paso 6.1.3 y 6.1.4.
- Ajuste el pH de cada solución a 7,4 con NaOH o HCl.
- Suplemento cada concentración de no tratada y tratada-CuO-NP PBW así como RO + medios de comunicación con los siguientes componentes estándar: 25 ml (10%) de suero bovino fetal (FBS), 2,5 ml de L-glutamina, 0,55 g de NaHCO3 y 1,25 ml Pen / Strep (50 IU / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina).
- Ajuste la osmolalidad de cada concentración de PBW + medios de comunicación no se trata, PBW + medios de comunicación y los medios de comunicación RO + CuO-NP tratada a 290-310 mOsm / kg mediante la adición de agua de ósmosis inversa y medida utilizando un osmómetro.
- Filtra cada solución utilizandouna unidad de 0,22 micras de vacío filtro, y se almacena a 4 ° C.
NOTA: Debido a las ligeras variaciones en la cantidad de agua de ósmosis inversa se utiliza para ajustar la osmolalidad, variar las concentraciones de medios de comunicación finales dentro de un rango de 5%, con concentraciones de medios de comunicación en el 56%, 44% PBW sin tratar +, 29% y 16,5% y CuO-NP concentraciones PBW + medios de comunicación tratado en 53%, 45%, 30% y 17%.
6. Viabilidad celular
NOTA: Dado que los riñones y el hígado son órganos diana de la toxicidad de metales pesados, emplean células cultivadas de riñón embrionario humano (HEK293) (HEK) y el carcinoma hepatocelular humano (HepG2) células (HEP) Métodos de ensayo 24-26.
- Preparar un cultivo de células HEK y HEP 2-3 días antes de placas las placas de 96 pocillos usados en el experimento según las instrucciones del fabricante.
- Medir la viabilidad celular usando el 3- [4,-2-il-5 dimetiltiazol] -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo.
NOTA: El protocolo de ensayo MTT se modificó a partir Meerloo et al. (2011) 27.- Obtener MTT en forma de polvo. Añadir salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una concentración madre de 50 mg / ml. Agitar la solución durante 2 horas y luego se filtra con un filtro de jeringa de 0,45 micras y alícuota en tubos de 1,5 ml seguras congelador. Proteja los tubos de luz y se almacena a 4 ° C.
- Retire las células HEK y HEP de sus placas de cultivo utilizando tripsina, centrifugar a 1000 xg durante 5 min y decantar la tripsina. Añadir 5 ml de PBS y mezclar las células para obtener una solución de una sola célula. A continuación, aplique 20 l de la solución de una sola célula a un hemocitómetro para obtener un recuento de células por mililitro de solución. Centrifugar las células de nuevo a 1.000 xg durante 5 min y decantar el PBS utilizado para lavar las células. Añadir la cantidad apropiada de EMEM-1x para ajustar la concentración de las células a 500 células / 100 l (100 l / pocillo).
- Llenar los pocillos perímetro de la placa con 200 l de PBS para el control de evaporación.
- Seed celulars a una densidad de 500 células / pocillo añadiendo 100 l a cada pocillo, a excepción de los pozos perimetrales (que no se siembran con células).
NOTA: densidad de siembra de células HEK y HEP se basa en las curvas de crecimiento experimentales que permiten que el pico de crecimiento que se produzca alrededor de los días 4-5. Preparar las curvas de crecimiento de todas las líneas celulares para estimar la densidad de siembra. - Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C lo que les permite recuperar (forma adherencias ajustados a la placa) antes de realizar lecturas MTT línea de base de la densidad celular.
- Realizar lecturas MTT basales de la densidad celular mediante la eliminación de los medios de comunicación de la siembra de la primera columna (no incluyendo el perímetro) y la adición de 100 l de MTT (5 mg / ml en medios de comunicación) a los pocillos durante 1 hr.
- Después de una hora, retirar el MTT y añadir 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) para disolver el formazano MTT-producida por las células viables (20 min).
- Leer la densidad óptica (DO) de la primera columna a una longitud de onda de absorción de 570 nm para obtener una baselectura de línea.
- Utilice lecturas de línea de base para asegurar que todas las placas se sembraron correctamente y que las células están creciendo constantemente entre las placas. Retire el DMSO de la columna que se prueban antes de incubar durante las próximas 24 horas.
NOTA: Si DMSO se deja en la placa durante la noche que tira de la humedad de la columna adyacente, causando una reducción en el volumen de los medios.
- Utilice lecturas de línea de base para asegurar que todas las placas se sembraron correctamente y que las células están creciendo constantemente entre las placas. Retire el DMSO de la columna que se prueban antes de incubar durante las próximas 24 horas.
- Calentar las soluciones de ensayo (es decir, el EMEM-1x, RO, PBW no tratada y soluciones de medios PBW tratados con CuO-NP) a 37 ° C en un baño de agua.
- Eliminar los medios de comunicación de siembra del resto de la placa (no incluyendo el perímetro o la primera columna que se utilizó para la lectura basal) y se reemplazó con 100 l de EMEM-1x, + medios de comunicación, medios de comunicación PBW sin tratar + RO concentraciones o CuO-NP las concentraciones de medios de comunicación PBW tratado con + (una solución por placa). Se incuban las células en sus concentraciones de ensayo o soluciones de control para un total de siete días (Días 2-8).
NOTA: Hay 10 placas totales: 1 EMEM-1x, 1 RO + medios de comunicación, 1 de cada tratado concentración PBW + medios de comunicación (56%, 44%, 29% y 16,5%) y un plato de cada concentración PBW + medios tratado con CuO-NP (53%, 45% , 30% y 17%) por experimento por línea celular. - Cada día después de la lectura MTT línea de base, extraiga las soluciones de control y de prueba (que figuran en la nota debajo de 6,11) de la columna siguiente de su respectiva placa (por ejemplo, el día 2 los medios de prueba y control se retiran de la fila 3, pozos BG; Día 3: Fila 4, los pozos de BG etc.) y repetir el protocolo de MTT como se describe en los pasos 6.7 a 6.9 anteriores.
- Repita el protocolo cada día durante siete días. Media de los resultados de DO para cada fila (6 pozos) y reportado contra el tiempo para generar una curva de crecimiento de siete días.
- Para evaluar el efecto de quelación de cobre sobre la viabilidad celular en PBW CuO-NP-tratada + medios de comunicación siguen el mismo procedimiento que el anterior, excepto añadir 100 mM de D-penicilamina para controlar y soluciones de ensayo antes de la adición de las soluciones a sus respectivas placas. Realizar anal datosanalysis usando software de gráficos científica.
7. Modelado Geoquímica
- Descargue la versión de Visual MINTEQ 3.0 / 3.1 un programa gratuito de la siguiente página web http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
NOTA: Visual MINTEQ es un modelo de equilibrio químico freeware para el cálculo de la especiación del metal, los equilibrios de solubilidad, absorción, etc., para las aguas naturales. Además, se utiliza para predecir la especiación de iones, las actividades de iones, complejos de iones y los índices de saturación que se compara con la concentración de elementos antes y después del tratamiento (resultados de la espectroscopia de masas) para examinar los posibles mecanismos de elemento de eliminación 28. - Abra el programa y la entrada de los datos de espectroscopia de masas desde el paso 4, incluyendo pH, alcalinidad y las concentraciones de los diferentes elementos, en el programa.
NOTA: Dado que el agua subterránea se oxida durante en urani situum proceso de extracción, utilizar especies oxidadas de arsénico, vanadio, y el uranio para la entrada.
8. Concentración inhibitoria 50 (IC 50)
- Calcular la IC 50 para las concentraciones PBW + medios no tratados y tratados con CuO-NP por primera promedio de la viabilidad (promedios de DO) en el día 5 de tres ensayos separados.
- Restar día cinco promedios de viabilidad de los medios de comunicación PBW + concentraciones no tratados y tratados con CuO-NP de cinco días promedios de viabilidad de EMEM-1x para calcular diferencias de viabilidad. Luego divida las diferencias de viabilidad de la viabilidad media en el Día 5 en EMEM, y se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de inhibición.
- Restar el porcentaje de inhibición a partir de 100 (viabilidad EMEM-1x) para obtener el porcentaje de viabilidad para cada concentración de PBW + medios no tratados y tratados con CuO-NP.
- De entrada en software científico de gráficos mediante el establecimiento de EMEM-1X a una concentración de uno y un porcentaje de viabilidad de 100; transformar todas las concentraciones en logescala (X = Log (X)) y realizar la regresión no lineal con menos análisis en forma cuadrada.
Análisis de datos 9.
- Comparar las concentraciones de elementos en no tratados y tratados con NP-CuO PBW con una, a la par, prueba t de Student de dos colas.
- Calcular las áreas bajo la curva (AUC) mediante el uso de los datos de la curva de crecimiento recogidas durante siete días y analizar la varianza con medidas repetidas de análisis de la varianza (ANOVA), seguido por la comparación de Tukey post hoc entre todos los grupos (n = 3).
- Calcule el IC 50 mediante el uso de los datos desde el primer día cinco de la curva de crecimiento tanto para PBW sin tratar y tratada con CuO-NP + soluciones de medios (descrito anteriormente). Los valores de p <0,05 se consideró significativo.
NOTA: Para los fines del análisis estadístico, los valores de espectroscopia de masas de la mitad del límite de detección fue asignado a los iones de los niveles de concentraciones por debajo de ese límite 29.
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Representative Results
Concentraciones de los componentes PBW y pH en no tratado y tratado-CuO-NP PBW se reportan en la Tabla 1. Martinson y Reddy (2009), informaron que el punto de carga cero de la CuO-NP se estima en 9,4 ± 0,4. Dado que el pH de PBW era 07/02 a 07/04, en estas condiciones, el agua dona protones a CuO-NPs, haciendo que la superficie de las nanopartículas que se cargará positivamente lo que permite la adsorción de especies cargadas negativamente. Tratamiento de CuO-NP retirados contaminantes prioritarios de PBW, incluyendo arsénico, selenio, uranio y vanadio (Tabla 1). La concentración de arsénico promedio se redujo en un 87% [0,0175 a 0,002 mg / L (dos colas prueba t pareada, p <0,0001)]. Tratamiento CuO-NP también redujo significativamente selenio (30%), uranio (78%), vanadio (92%), y fosfato (85%) (p <0,05).
La especiación resultados de la modelización, reportado en la Tabla 2, compatible con los resultados analíticos: 99% de aTal arsénico disuelto en PBW está presente como HASO 4 2- y H 2 AsO 4 - y 94% de selenio disuelto total en PBW está presente como SEO 4 2-. Estas especies están cargadas negativamente, por lo tanto, capaz de adsorber a CuO-PN. Modelado de especiación predijo que el 99% de las especies de vanadio en PBW se carga negativamente, también promueve la adsorción a CuO-PN. Sin embargo, el modelado especiación predijo sólo el 35,5% del uranio especies están cargadas negativamente, lo que limitaría la adsorción a CuO-PN. El análisis de los índices de saturación predijo que ninguna especie de arsénico, selenio, uranio o minerales que contienen vanadio eran cerca de la saturación (es decir, la precipitación mineral) niveles, el apoyo a la adsorción a CuO-PN, frente a la precipitación.
Para evaluar si las concentraciones esperadas de contaminantes prioritarios están en los medios de comunicación hecho de no tratada y tratada-CuO-NP PBW, las muestras de medios de control sin diluir (EMEM-1X), 56%sin tratar PBW + medios de comunicación y la PBW tratado con CuO-NP 53% + medios fueron analizadas por ICP-MS. Medios de control sin diluir (EMEM-1x) es un producto comercial suministrado con L-glutamina y bicarbonato de sodio (pre-agregado). Las concentraciones de cobre y selenio en el control de EMEM-1x se elevaron ligeramente como se esperaba, ya que son esenciales para el crecimiento celular, pero el arsénico, uranio y vanadio eran insignificantes, reportado en la Tabla 3. Los estudios preliminares mostraron que, arsénico, las concentraciones de selenio y vanadio se redujeron en tratamiento CuO-NP y que la disminución fue representado en las concentraciones en el PBW + medios tratado con CuO-NP. La concentración medida de uranio en el PBW + medios tratado con CuO-NP se disminuyó en comparación con no tratados PBW, y esta disminución fue más pronunciada de lo previsto por el modelado v.3 MINTEC Visual. Niveles de cobre subieron en medios tratado con CuO-NP como se esperaba.
Para determinar la capacidad de tratamiento de CuO-NP para mejorar la citotoxicidad de PBW en mamíferoscélulas, la viabilidad se evaluó en las células expuestas a soluciones de PBW + medios de comunicación antes y después del tratamiento CuO-NP. Tanto las células HEK (Figura 1A) y HEP (Figura 1B) fueron expuestas a diferentes concentraciones de PBW + medios no tratada o tratada para un máximo de siete días. En las células cultivadas en PBW sin tratar + medios de comunicación, la viabilidad se vio afectada de una manera dependiente de la concentración, mientras que el tratamiento CuO-NP mejoró la viabilidad celular en ambas líneas celulares. El AUC integrado en la Figura 1C muestra que PBW células HEK se cultivan en CuO-NP-tratados + medios eran más viable en comparación con PBW sin tratar + medios de comunicación en las tres concentraciones más altas (29%, 44% y 56%). Células Hep mostraron ligeramente diferente viabilidad: sólo las dos concentraciones más altas de PBW sin tratar + medios de comunicación (44% y 56%) mostraron deterioro de la viabilidad en comparación con PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP (Figura 1D). Las concentraciones más diluidas de PBW eran menos tóxicos para las células HEP, y la viabilidad celular menos afectados por el tratamiento. Losviabilidad de ambas células HEK y HEP cultivadas en 16,5% PBW sin tratar + medios de comunicación no fue significativamente diferente de las células cultivadas en PBW tratado con CuO-NP 53% + medios de comunicación (p <0,05). Así, el tratamiento CuO-NP apareció para mejorar la citotoxicidad de PBW, con la viabilidad cerca de los niveles de control. Como se discutió anteriormente, el tratamiento CuO-NP de PBW se asocia con un aumento en las concentraciones de cobre. Se esperaba que el aumento, basándose en los resultados anteriores de Reddy y Roth (2012), en el que se utilizan CuO-NPs para eliminar el arsénico del agua subterránea. El aumento de cobre depende de la química específica de agua de la PBW, pero permaneció por debajo de EPA MCL de 1,3 mg / L. Sin embargo, era importante para descartar que el aumento de las concentraciones de cobre contribuyó a una mejora de la viabilidad (es decir, además de, o en lugar de, la disminución de contaminantes prioritarios). De acuerdo con ello, se añadió el quelante de cobre D-penicilamina al control EMEM-1x, RO Control + medios de comunicación, soluciones PBW + medios no tratados y tratados con CuO-NP, y THen MTT curva de crecimiento viabilidad se generaron, como se describió anteriormente. Quelación de cobre no lo hizo significativo afecta a la viabilidad de cualquiera de las células HEK o HEP incubadas en RO Control + medios de comunicación, medios de comunicación PBW + sin tratar y tratada con CuO-NP (resultados no mostrados).
La máxima concentración inhibitoria media (IC 50) se calculó a partir de cinco días de crecimiento de células HEK y células Hep cultivadas en PBW sin tratar + medios de comunicación (Tabla 4A) y PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP (Tabla 4B). Para las células HEK cultivadas en PBW + medios de comunicación no se trata, el valor IC 50 fue 1,264 (log% PBW). Por lo tanto, los no tratados PBW + medios de comunicación tendrían que ser diluida a 18,38% para llegar a una disminución del 50% en la viabilidad. Para las células HEK cultivadas en PBW + medios tratado con CuO-NP, el valor IC 50 fue 2,744 (log% PBW). Este resultado sugiere que, teóricamente, la citotoxicidad de la solución se reduce a la medida en que tratan necesitarían PBW + medios de comunicación para ser concentrado por 500% (log% PBW = 2,744) para producir un 50% similares depliegue en la viabilidad. Para las células cultivadas en HEP PBW + medios de comunicación no se trata, la IC 50 fue 1,243 (log% PBW). Esto requeriría una dilución de la PBW + medios de comunicación a 17,5% para producir una disminución del 50% en la viabilidad. En contraste, para las células cultivadas en HEP PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP, el IC 50 fue 5,327 (log% PBW). Este valor probable era tan grande, debido a que la viabilidad de las células en PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP no fue significativamente diferente de las células cultivadas en EMEM-1x (control). Formación de imágenes de campo brillante, ilustrado en la Figura 2, tanto del crecimiento celular HEK y HEP en día cinco. El número de células y el apego en los medios PBW + tratados con CuO-NP (Figura 2E, F) se han mejorado en comparación con los no tratados PBW + medios (Figura 2 C, D).
Figura 1: Curvas de crecimiento. Se utilizaron curvas de crecimiento para evaluar la viabilidad y grecimiento de los cultivos durante el tratamiento. Las curvas de crecimiento para células HEK (A) y células HEP (B) obtenidas en cuatro diluciones de PBW + medios de comunicación en comparación con 53% + PBW medios de comunicación (paneles superiores) tratado con CuO-NP. Control de EMEM-1x (EMEM) 
, RO 
, El 53% tratados con CuO-NP 
, 16,5% sin tratamiento PBW 
, 29% sin tratamiento PBW 
, 44% sin tratamiento PBW 
, 56% sin tratamiento PBW 
. Área bajo la curva de análisis (AUC) de HEK (C) y HEP (D) datos de la curva de crecimiento 7 días (paneles inferiores). * P <0,05 comparado con el control EMEM, #p <0,05 comparado con el control RO, §p <0,05 en comparación con 53% tratados con NP CuO PBW-media. (En comparación mediante un ANOVA de dos de cola conAnálisis post hoc de Tukey, n = 3)
Figura 2:. La morfología celular antes y después del tratamiento CuO-NP microscopía de campo brillante (20X) de HEK (columna izquierda) y las células en el día 5 HEP (columna derecha), que se cultiva en: control de EMEM-1x (EMEM) (A, B ), se utilizó 56% PBW + medios (C, D) y 53% PBW tratado con CuO-NP + medios de comunicación (E, F) sin tratar para examinar la morfología celular. Células HEK y HEP cultivadas en el control EMEM-1x (EMEM) (A, B) muestran un crecimiento casi confluentes saludable. Células HEK y HEP cultivadas en PBW + medios no tratados han reducido los números y aparecen individual (C, D). Células HEK y HEP cultivadas en PBW + medios tratado con CuO-NP muestran una mejor fijación y las células sanas, más confluentes (E F).
| Elemento (mg / L) | Normal, San Dev. Y Importancia | ||
| Antes del tratamiento | Después Del Tratamiento | ||
| Arsénico | 0,018 ± 0,001 | 0.002 ± 0,0 | *** |
| Selenio | 1,8 ± 0,07 | 1,3 ± 0,05 | ** |
| Cobre | 0,0015 ± 0,001 | 0,93 ± 0,43 | * |
| Calcio | 102 ± 82 | 106 ± 15 | |
| Estroncio | 3,3 ± 1,1 | 1,5 ± 0,4 | * |
| Magnesio | 44 ± 2,1 | 47 ± 1,7 | |
| Sodio | 610 ±; 0.0 | 627 ± 27 | |
| Uranio | 0,98 ± 0,03 | 0,21 ± 0,03 | *** |
| Bario | 0,037 ± 0,02 | 0.019 ± 0.01 | |
| Potasio | 12 ± 0,0 | 12 ± 0,8 | |
| Silicio | 12 ± 0,7 | 12 ± 0,5 | |
| Vanadio | 1,3 ± 0,07 | 0,1 ± 0,02 | *** |
| Fosfato | 0.35 ± 0.07 | 0.05 ± 0.0 | *** |
| Sulfato | 805 ± 21 | 807 ± 15 | |
| Conductividad | 3.125 ± 143 | 3190 ± 62 | |
| pH | 7.31 ± 0.09 | 7.36 ± 0.05 | |
Tabla 1:. Análisis de cationes y aniones antes y después del tratamiento CuO-NP Promedio concentraciones de elementos antes y después del tratamiento con CuO-NP. Importancia entre la concentración de-NP-tratada y no tratada CuO PBW se designan como * = p <0,05, ** = p <0,01 y *** = p <0,001. Una celda en blanco indica que no hay diferencias significativas. Concentraciones de cloruro oscilaron entre 46,5 ± 0,707 y 55,25 ± 8,180. Concentraciones de aluminio, boro, molibdeno y eran bajos y no mostraron cambios significativos debido al tratamiento CuO-NP. Las concentraciones de manganeso no fueron consistentes.
| Componentes | % De concentración total | Especies |
| Arsénico | 58.7 | Haso 4 2- |
| 410.2 | H 2 AsO 4 - | |
| Uranio | 64.1 | Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (ac) |
| 32.2 | CaUO 2 (CO 3) 3 2- | |
| 0.03 | UO 2 (CO 3) 2 2- | |
| 3.5 | UO 2 (CO 3) 3 de 4 | |
| 0.09 | Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (ac) | |
| 0.02 | CaUO 2 (CO 3) 3 2- | |
| Selenio | 94.3 | SEO 4 2- |
| 5.6 | Caseo 4 (aq) | |
| Vanadio | 2.1 | HVO 4 2- |
| 95.7 | H 2 VO 4- | |
| 2.1 | H 2 V 2 O 7 2- | |
| 0.01 | HV 2 O 7 3- | |
| 0.01 | V 4 O 12 4- |
Tabla 2: Especies modelar utilizando MINTEQ ver Visual. Software 3.0. MINTEQ ver Visual. 3.0 software (KTH Royal Institute of Technology, Valhallavägen, Suecia) se utilizó para calcular la especiación del metal de los componentes PBW listados en la Tabla 1. (Aq) = acuosa en contraposición a la forma sólida de esa especie.
| Control de EMEM | Si no se trata | ||
| PBW | PBW + medios | ||
| Arsénico | 0.003 ± 0,0 | 0.017 ± 0,0 | 0,010 ± 0,001 |
| Cobre | 0.01 ± 0.0 | 0,0015 ± 0,001 | 0.018 ± 0,0 |
| Selinium | 0,013 ± 0,002 | 1.75 ± 0.07 | 1.15 ± 0.06 |
| Uranio | 0,00015 ± 0,0 | 0.975 ± 0.03 | 0,71 ± 0,01 |
| Vanadio | 0,0015 ± 0,0 | 1.25 ± 0.07 | 0,785 ± 0,007 |
| Tratado-NP CuO | |||
| PBW | PBW + medios | ||
| Arsénico | 0,0022 ± 0,001 | 0,0015 ± 0,0 | |
| Cobre | 0.926 ± 0,4 | 0.81 ± 0.0 | |
| Selinium | 1.25 ± 0.05 | 0.855 ± 0.0.02 | |
| Uranio | 0.208 ± 0.03 | 0.45 ± 0.01 | |
| Vanadio | 0,102 ± 0,02 | 0,0795 ± 0,01 | |
Tabla 3:. Las concentraciones de contaminantes en los medios de comunicación Las concentraciones de contaminantes prioritarios (mg / l) en el control de EMEM-1x (EMEM), sin tratar PBW, PBW tratado con CuO-NP, PBW sin tratar + medios de comunicación y medios de comunicación tratado PBW + CuO-NP- después de añadir componentes de medios (n = 3) fueron evaluados para asegurar cambios en la concentración de contaminantes debido al tratamiento estuvieron representados en no tratados PBW + medios de comunicación y PBW CuO-NP-tratada + medios aplicados a cells.
| A no tratada PBW + Medios | ||
| Las concentraciones de PBW no tratada (registro X) | % De viabilidad (células HEK) | % De viabilidad (células Hep) |
| EMEM | 100 | 100 |
| 16,5% (1.217) | 51.4 | 50.8 |
| 29% (1,462) | 39 | 33.3 |
| 44% (1.643) | 19.3 | 14.7 |
| 56% (1.748) | 14.5 | 9.4 |
| IC 50 Log [PBW] | 1,264 | 1,243 |
| B CuO-NP-tratada PBW + Medios | ||
| Las concentraciones de Teñidos CuO-NP PBW (registro X) | % De viabilidad (células HEK) | % De viabilidad (células Hep) |
| EMEM | 100 | 100 |
| 17% (1,230) | 86.7 | 119.8 |
| 30% (1,477) | 75.8 | 86.7 |
| 45% (1,653) | 81 | 92.4 |
| 53% (1.724) | 70.3 | 97.5 |
| IC 50 Log [PBW] | 2,744 | 5,327 |
Tabla 4: Cálculo de IC 50. El IC 50 representa la concentración de PBW sin tratar + medios de comunicación o PBW tratado con CuO-NP + medios de comunicación que se requiere para una inhibición del 50% de viabilidad. La viabilidad por ciento en el día 5 para las células HEK y HEP expuestos a diluciones de PBW sin tratar + Media (A) o tratados con CuO-NP PBW + Media (B) se utilizaron para calcular la concentración inhibitoria máxima media (IC 50).
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Discussion
Estudios previos reportaron que CuO-PN retira el arsénico del agua subterránea 11,13,30,31. Este estudio apoya estos hallazgos anteriores y también informa que CuO-PN eliminar contaminantes adicionales de PBW. Este estudio también confirma informes anteriores que CuO-PN son eficaces en la eliminación de arsénico, a pesar de la presencia de otros contaminantes y posibles iones que compiten 11. Modelado de especiación predijo que el 97% de las especies de vanadio en PBW se carga negativamente, lo que permite la adsorción a CuO-PN, y el tratamiento por lotes elimina el 92% de vanadio.
Este es el primer estudio para investigar los efectos de la eliminación de contaminantes específicos de PBW usando CuO-NP y, a continuación, evaluar los cambios en la citotoxicidad asociados con la eliminación. Los resultados demuestran que la investigación de los cambios en la citotoxicidad de mezclas complejas utilizando un enfoque in vitro puede ser posible, pero estos métodos no son sin límites. PBW no podía utilizarse fULL fuerza sobre las células, porque para sobrevivir, las células cultivadas requiere un medio de crecimiento definido y osmolalidad específica. Medios PBW + no podrían también ser utilizados en las células sin ajuste de pH. El pH de la PBW fue 7,31 antes y después del tratamiento sin embargo 7,36; la adición de componentes de medios de crecimiento redujo el pH a aproximadamente 6,8, dependiendo de la dilución. Ajuste del pH es un paso normal, en la preparación de medios de cultivo celular sin embargo; ajustar el pH de los medios de comunicación PBW + puede haber alterado las interacciones moleculares de las especies de elementos con componentes de medios. No tratados y tratados-CuO-NP PBW se combinaron con medios de crecimiento concentrado EMEM-10X en diversas proporciones para obtener las soluciones de ensayo (pep + medios de comunicación). Análisis ICP-MS se realizó en medios de prueba para verificar que las concentraciones de metales afectados significativamente por CuO-NP-tratamiento (arsénico, cobre, selenio, uranio, vanadio) se encontraban en concentraciones esperadas tras la dilución por los componentes de los medios de comunicación y el ajuste de la osmolalidad. La disminuciónen el arsénico, selenio y vanadio después CuO-NP-tratamiento se refleja en las diferencias de concentración entre PBW sin tratar + medios de comunicación y la PBW tratado con CuO-NP + medios de comunicación. Concentraciones de uranio son más altos en la PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP de lo previsto. Datos de ICP-MS (Tabla 1) sugiere que más de uranio fue retirado de PBW durante el tratamiento CuO-NP de lo previsto por el modelado. La especiación de modelado (Tabla 2) predijo que a pH 7,3, sólo el 35,5% de las especies de uranio están cargadas negativamente. El modelo predice que la principal especie de uranio, carbonato de uranilo calcio (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3), es neutral.
La eliminación observado 78% del uranio era probablemente debido a una combinación de adsorción de uranio y precipitación (tal como un carbonato de calcio mineral de uranilo). Basado en la modelización geoquímica, el porcentaje de uranio eliminado por adsorción es menor que calcula lo que permite una mayor concentración en el CuO-NPPBW tratado con + medios de comunicación. El mecanismo de extracción de uranio por CuO-NP-tratamiento no está clara y requiere una mayor investigación. Se espera que cuando se añadió a PBW sin embargo EMEM-10x Un aumento en la concentración de calcio, potasio y magnesio; CuO-NP-tratamiento no produjo un cambio significativo en estos elementos así no se observó diferencia en la no tratada vs. PBW + medios de comunicación tratado con CuO-NP. La técnica de combinar la ambiental real con componentes de medios tuvo éxito en la representación de los cambios observados en las concentraciones de elementos debido al tratamiento; Sin embargo la naturaleza oxidada del PBW limita cómo podrían hacerse las PBW + medios de comunicación. En un intento de aumentar la concentración máxima de los elementos de los medios de prueba, medios de cultivo celular en polvo se mezcló con originalmente sin tratar y tratada con CuO-NP PBW para hacer PBW + medios de comunicación. Los medios de comunicación en polvo a menudo como resultado la precipitación de sales de calcio y aumentó la osmolalidad de la PBW + medios de comunicación que requiere una dilución mayor con agua RO, produciendo concentraciones cercanos a los obtenidos con líquidos 10x medios de comunicación. Estos temas son los más propensos PBW-específica debido a su estado oxidativo y pueden no ser un problema con otras mezclas menos sensibles.
El ensayo MTT fue elegido para evaluar la citotoxicidad porque es un ensayo de alto rendimiento estándar reconocido que evalúa la salud general de las células mediante la medición de la actividad mitocondrial. Este método tiene ventajas y desventajas. El formato de 96 pocillos es útil para obtener múltiples puntos de datos sin embargo; la mayoría de las células en el día 5 fueron aspecto enfermizo, redondeado y ya no unido a la placa. Las fotografías de la figura 2 se tomaron antes de que se retiró el medio utilizando un vacío; la aspiración de los medios de comunicación, y luego añadir la solución de MTT puede haber eliminado las células no unidas o separado células pobremente adheridas, lo que contribuye a la meseta general de la señal MTT después del Día Dos visto con PBW sin tratar. El supuesto es que las células flotantes están muertos o moribundos y oólo las células unidas se evaluó a través de este método. También es importante tener en cuenta las limitaciones del ensayo MTT con respecto a los estudios que utilizan nanopartículas.
Estudios previos han informado de que, cuando se aplica directamente a las células cultivadas, las nanopartículas pueden tener toxicidad inherente, más allá de sus propiedades químicas base, en función de sus características físicas únicas, tales como tamaño y forma 32,33. En este estudio, no aplicamos el CuO-PN directamente sobre las células. En lugar de ello, las células fueron expuestas a PBW que habían sido tratados previamente con CuO-NPs, se centrifugó para eliminar la mayoría de la CuO-NPs y después se filtró dos veces para eliminar más CuO-NPs antes de la PBW se utilizó para preparar PBW + medios de comunicación. Los resultados MS mostraron un aumento en cobre después del tratamiento. Esto podría ser iones de cobre que fueron disueltos de las nanopartículas durante el tratamiento o CuO-NPs que pueden haber pasado a través de las etapas de centrifugación / filtración a permanecer en el PBW tratada used de hacer la PBW + medios de comunicación. CuO-NPs varían en tamaño desde 12 hasta 18 nm con una superficie BET medida de 85 ± 1 m 2 / g 11 pero se sabe que agregar y basado en el aumento mínimo de las concentraciones de cobre en la PBW tratada, la mayor parte del cobre independientemente de la fuente se elimina después de la centrifugación y filtración. Confirmación visual de la mejora de la salud celular y la confluencia apoyar los resultados del ensayo MTT de la mejora de la viabilidad debido al tratamiento CuO-NP del PBW (Figura 2). Los estudios futuros utilizando otros métodos puede evaluar (o caracterizar a) efectos de confusión similares causadas por CuO-PN.
Células de riñón embrionario humano (HEK 293) y Human Carcinoma hepatocelular (HEP G2) fueron elegidos para las pruebas de toxicidad. Estas son las líneas celulares estándar que son clínicamente relevantes para la toxicidad orgánica heavy metal 24,25,34-40. Una baja densidad de siembra fue utilizado para los ensayos de MTT. Las células se sembraron a 500 células / pocillo, se dejó recuperardurante 24 horas y, a continuación, se expone a los medios de ensayo. La baja densidad de siembra fue necesario para alcanzar una curva de crecimiento con una fase de registro de alrededor de 5 días, antes de convertirse en sobre-confluentes y estacionaria en el día 6 o 7. Chakraborty et al. (2010) informó que en un estudio de toxicidad de cadmio en riñón cultivadas células del túbulo proximal (PTC), la confluencia y el estado de proliferación (proliferantes vs reposo) afectada la respuesta a la exposición al cadmio: células sub-confluentes proliferando mostraron más citotoxicidad de células confluentes (en reposo). Células Hep y HEK expuestos a PBW a concentraciones más elevadas (mayor confluencia) similares a los utilizados para otro ensayo (resultados no mostrados) no mostraron los cambios robustos en la morfología observada con el ensayo de MTT. Se necesita más investigación sobre los cambios en la citotoxicidad utilizando líneas de células no adherentes o protocolos que cosechan y recogen todas las células (por ejemplo, la citometría de flujo).
Otra limitación del método de MTT en los Estados Unidos estudiosing nanopartículas es que algunos tipos de nanopartículas pueden interferir con la nutrición celular. Medios de cultivo celular típicamente contienen fuentes de proteínas añadidos, tales como suero bovino fetal (FBS), para complementar el crecimiento celular. Los estudios han demostrado que las nanopartículas de óxido de metal puede agotar los componentes de crecimiento importantes en FBS, debido a la mayor capacidad de absorción de las nanopartículas. Nanopartículas de óxido de metal se han demostrado para enlazar a FBS a través de una interacción con calcio 41. Dependiendo del pH de la solución, nanopartículas metálicas pueden llevar una carga positiva o negativa. Los estudios de citotoxicidad han demostrado que las nanopartículas metálicas añaden a los medios de cultivo celular adsorben cationes, incluyendo Ca 2+ y retire FBS / albúmina sérica través de la unión del complejo 2 + NP-Ca a la sitios en proteínas en el FBS unión de calcio. Esto disminuye la concentración de Ca 2+ y FBS a partir de los medios de comunicación, esencialmente de hambre las células y el aumento de la citotoxicidad atribuido a la nanoparticles 41. Por otra parte, antes de la exposición de las nanopartículas a FBS / Ca 2+ recubierto las nanopartículas, disminuyendo su efecto citotóxico. Sin embargo, no nos exponemos directamente los medios de comunicación a CuO-PN. Además, no hay disminución significativa de Ca 2+ se observaron concentraciones en PBW después del tratamiento con CuO-PN, indicando que no hay absorción significativa de Ca 2+ en el CuO-PN cebado que se unen con el FBS. Sin embargo, la concentración de calcio en la PBW es lo suficientemente alta que una disminución inducida por nanopartículas puede no haber sido evidente. Todavía es poco probable que el CuO-NPs utilizado en este estudio están absorbiendo grandes cantidades de calcio durante el proceso, porque no había disminución en la capacidad de absorción de arsénico de la CuO-NPs en PBW, que contiene altos niveles de calcio en comparación con estudios anteriores con aguas subterráneas con un calcio inferior concentraciones de 13.
Los datos demuestran que CuO-NPs eliminar el arsénico, selenio y vanadio uranium, y esto se asocia con la mejora de la viabilidad celular HEK y HEP en el ensayo de MTT. El mecanismo (s) por el cual se mejora la viabilidad aún no se ha determinado, pero podría ser debido a la eliminación de contaminantes prioritarios por CuO-NP, entre otros mecanismos. El estudio también demuestra que los métodos estándar de cultivo celular se puede utilizar para evaluar la eficacia de un método de tratamiento de agua ISR nanopartículas, permitiendo potencialmente a una serie de estudios mecanicistas que esté terminado, antes de pasar a los estudios in vivo en animales más costosos y lentos en . Además, CuO-NPs puede llegar a ser más versátil para procesos de minería y para el tratamiento de mezclas de metal que adsorbentes convencionales, como óxidos de aluminio, hierro, titanio, y manganeso, desde CuO-NPs no requieren ajuste de pH o la oxidación de agua para la eliminación de arsénico, y CuO-NPs eliminar tanto arsenito y arseniato en presencia de los aniones fosfato en competencia, silicato y sulfato. También, CuO-NPs puede ser regenerada y re-Se usa, lo que reduce los costos de reactivos y la cantidad de subproductos de desecho tratamiento gastado en necesidad de la eliminación de 12.
Las limitaciones potenciales del protocolo MTT incluyen la baja densidad celular en el momento de la exposición, el desprendimiento de las células y la pérdida de la señal, la inanición de células y la posible exposición directa de las células a CuO-NP MTT alterar la reactividad. La densidad celular y las cuestiones desprendimiento podrían abordarse mediante el uso de una prueba alternativa tales como citometría de flujo, que permite mayores densidades de siembra, así como la recopilación de todas las células (es decir, tanto flotante y adjunta). Preguntas hambre celular podrían evaluarse midiendo las concentraciones del factor de crecimiento en los medios de comunicación periódicamente durante el tratamiento. El trabajo futuro se centrará en la aplicación del protocolo actual a diferentes ensayos de citotoxicidad que abordar si es posible la exposición alterado la actividad ensayo CuO-NP, mediciones de la inanición celular durante el tratamiento y también probar la capacidad de CuO-PN para eliminar ContaminaNTS y afectan la citotoxicidad de otros tipos de mezclas complejas, como los residuos procedentes de sitios de Superfund y estanques de eliminación de residuos. Dichos estudios también abordan si los métodos fueron robustos en diversos entornos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CuCl2 | Sigma | 203149 | |
| Borosilicate glass balls | VWR | 26396-639 | 6 mm |
| Nitric Acid | Fisher | A509-P500 | Trace metal grade |
| 0.45 μm syringe filter | Fisher | SLHA 033S S | |
| 10x EMEM | Fisher | BW12-684F | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | Fisher | BP379-100 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Penicillin/Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| 0.22 μm vacuum filter unit | Fisher | 09-740-28C | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPG2 | ATCC | HB-8065 | |
| Trypsin | Sigma | SV3003101 | |
| MTT | Sigma | M2128 | |
| D-penicillamine | Fisher | ICN15180680 | |
| 96-well plates | Fisher | 07-200-92 | |
| DMSO | Fisher | D12814 | |
| Spectra Max 190 | Molecular Devices | ||
| Visual MINTEQ version 3.0 | KTH Royal Institute of Technology | ||
| ICP-MS | Agilent | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| IC DIONEX DX 500 | Dionex | Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013. | |
| VWR Incubator | VWR |
References
- What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
- International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
- Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
- Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
- Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
- U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
- The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. , Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
- Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
- Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
- Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47 (12), 3931-3946 (2013).
- Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336 (2), 401-411 (2009).
- Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
- Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51 (1), 83-91 (2012).
- Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47 (12), 4022-4031 (2013).
- Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112 (10), 5073-5091 (2012).
- Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
- Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117 (8), 348-353 (2009).
- Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 139-162 (2010).
- Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). , Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
- Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63 (1), 132-142 (2001).
- Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254 (2), 154-166 (2011).
- Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. , University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
- Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
- Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220 (3), 292-301 (2007).
- Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21 (3), 343-354 (2007).
- Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
- Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
- Gustafsson, J. Visual MINTEQ. , Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
- Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 173-182 (2013).
- Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90 (9), 1387-1396 (2011).
- Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186 (1), 367-375 (2011).
- Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8 (9), 1-19 (2011).
- Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23 (7), 1365-1371 (2009).
- Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65 (23), 2029-2052 (2002).
- Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99 (4), 105-110 (2005).
- Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187 (1), 39-48 (2003).
- Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62 (5), 543-547 (2010).
- Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28 (6), 532-541 (2011).
- Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12 (1), 639-648 (2012).
- Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12 (10), 1161-1208 (2005).
- Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22 (3), 543-553 (2009).
