Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması Published: June 21, 2015 doi: 10.3791/52715
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 6
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

Abstract

Yerinde kurtarma (ISR) Amerika Birleşik Devletleri uranyum çıkarma baskın bir yöntemdir. ISR sırasında, uranyum, bir cevher gövdesinden elde ayrıştırılan ve iyon alışverişi yoluyla ekstre edilmiştir. Ortaya çıkan üretim boşaltma su (PBW) arsenik ve diğer ağır metaller gibi kirletici içerir. Etkin ISR uranyum tesisinden pbw numuneleri kuprik oksit nanopartiküllerinin (CuO-NPS) ile muamele edildi. Arsenik, selenyum, uranyum ve vanadyum dahil PBW azaltılmış öncelikli kirleticiler, bir CuO-NP tedavi. İşlem görmemiş ve CuO-NP PBW MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromid) ile tespit edilmiştir hücre büyüme ortam ve canlılığı değişikliklerin sıvı bileşen olarak kullanılmıştır muamele deney insan embriyonik böbrek (HEK 293) ve insan hepatoselüler karsinoma (Hep G2) hücrelerinde. CuO-NP tedavi geliştirilmiş HEK ve HES hücre canlılığı ile ilişkili bulunmuştur. Bu yöntemin Sınırlamalar büyüme ortamı bileşenleri tarafından ve osmol sırasında pbw sulandırma dahilality ayarı yanı sıra gerekli pH ayarı. Bu yöntem, seyrelme etkisi nedeniyle ve bununla birlikte geleneksel hafif asidik olan pbw pH değişiklikleri gibi daha geniş bir bağlamda sınırlıdır; Bu yöntem daha nötr sularda CuO-NP tedavi değerlendiren geniş bir kullanıma sahip olabilir.

Introduction

Yaklaşık ABD'nin elektrik arzının% 20 enerji bağımsızlığı artırmak için ulusal teşvikler kısmen dayalı nükleer enerji ve tarafından sağlanmaktadır, ABD'nin nükleer kapasite 1 artması beklenmektedir. Nükleer enerjinin dünya çapında büyüme de ABD 2 dışında meydana gelen büyümenin çok ile, devam etmesi beklenmektedir. 2013 yılı itibariyle, ABD uranyum% 83 ithal edildi, ancak rezervlerin 952.544 metrik ton ABD'de 3,4 var. 2013 yılında 7 yeni tesis uygulamaları ve Wyoming, New Mexico ve Nebraska 5 ila 14 restart / genişleme uygulamaları vardı. ABD'de, uranyum ağırlıklı yerinde kurtarma (ISR) 6 süreçler yoluyla ekstre edilir. ISR az arazi bozulması neden olur ve çevresel kirleticiler 7 serbest bırakabilirsiniz atık yığınları oluşturarak kaçınır. ISR uranyum ile sızıntı suyu elde edilir ve bundan sonra yeraltı cevher gövdesinin, uranyum süzdürülmesi için su bazlı oksitleme çözümler kullanırbir iyon değişim işlemi 8. Cevher vücutta negatif su dengesini korumak için, sızıntı suyunun bir kısmı, denilen üretim suyu (PBW) kanar, kapalı havası alınır. PBW bir kısmı ters osmoz (RO) kullanılarak dekontamine madencilik sürecine yeniden tanıttı, ancak toksik kirletici olarak kabul edilebilir yüzey için devlet düzenleyici kurumlar tarafından belirlenen seviyelere ve azaltılmış olabilir eğer PBW ayrıca, yararlı endüstriyel veya tarımsal kullanımlar olabilir yeraltısuyu 9. Şu anda, en ISR uranyum tesisleri PBW kirlilikleri uzaklaştırmak için RO kullanın. Ancak, RO işleme enerji yoğun ve düzenlenmiş bertaraf gerektiren zehirli atık salamura, üretir.

Birçok su dekontaminasyon yöntemleri Adsorbanların, membranların ve iyon değişimi de dahil olmak üzere, mevcuttur. Bunlardan, adsorpsiyon en yaygın olarak kullanılan ve nanoparçacık sentezinde son gelişmeler adsorban bazlı su dekontaminasyon yetenekleri 10 süreçleri geliştirmiştir. Bakır oxiDaha önce yoğun uranyum ISR PBW üzerinde çalışılmıştır olmasaydı de nanopartiküller (CuO-NPS), ancak yeraltı suyundan kirletici çıkarılması son çalışmalarda, CuO-NPS öncesi veya sonrası su arıtma adımlarını gerektirmeyen dahil olmak üzere benzersiz özelliklere (bulunmuştur örneğin, pH veya redoks potansiyelini) ayarlama ve farklı pH'larda, tuz konsantrasyonlarında veya rakip iyonları), 11 yılında, örneğin (farklı su kompozisyonlarında iyi performans. Buna ek olarak, CuO-NPler kolayca yeniden CuO-NPS tekrar edilebilir, bundan sonra, sodyum hidroksit (NaOH) ile yıkanarak ekstre edilmesi yoluyla rejenere edilir. Doğal sularından CuO-NP iz metal filtreleme yetenekleri Detayları daha önce 11-14 yayınlandı.

Su tedavisi için yararlı olmakla birlikte, metal oksit nanopartiküllerinin canlı organizmalar için toksik olabilir, ancak toksisite ölçüde nanoparçacık özellikleri ve bileşenleri 10,15,16, kısmen bağlıdır. Bu nedenle, bu simult çalışma için önemlidirAlan uygulamaları öncesinde aneous kirletici çıkarma ve nanoparçacık toksisiteleri. Bu çalışma (arsenik, selenyum, vanadyum ve uranyum dahil) PBW öncelikli kirleri çıkarmak için CuO-NPS yeteneği belirlenir ve PBW sitotoksisite üzerinde CuO-NP tedavisinin etkisini değerlendirdi.

PBW aktif ISR uranyum tesisi toplanan ve öncelikli kirletici çıkarılması CuO-NP tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. CuO-NP tedavi öncesi ve sonrası PBW sitotoksisite de değerlendirildi. PBW çevreyle ilgili karışımları da dahil olmak üzere karışımların toksisitesini okuyan vurgu koyuyoruz Toksik Maddeler ve Hastalık Sicil (ASTDR) için karmaşık bir jeolojik (çevresel / endüstriyel) karışımı hem Çevre Sağlığı ve Bilim (NIEHS) Ulusal Enstitüsü ve Ajansı bunlar doğal, ister endüstriyel, hem de in vitro test teşvik mevcut olarak ayrıca in vivo test edilmesi için kimyasal öncelik17-19. Düşük doz karışımına kronik maruziyet en azından çoğu laboratuvar çalışmalarının kısa süre içinde belirgin etkiler üretmek değil, çünkü kronik düşük doz karışımı maruz çalışmalar zorlamaktadır. Benzer bir şekilde, kimyasal karışımların in vitro çalışmalar en fazla 2 ya da daha fazla metal 20,21 tanımlanmış bir laboratuvar yapımı karışımına hücrelerin maruz kalmaktadır. Bu çalışmalar temel bilgileri sağlar, ancak basitleştirilmiş karışımlar karışım bileşenlerinin tam aralık mevcut bir yerli, çevresel numunede, oluşabilecek karmaşık antagonistik ve sinerjistik etkileşimleri çoğaltmak yok.

Bu çalışmanın amacı GT için alternatif kirletici kaldırma süreçlerini incelemek ve kültürlü insan hücreleri kullanılarak PBW sitotoksisite üzerine (CuO-NP) tedavinin etkisini değerlendirmek idi. Sonuçlar kirletici giderimi için daha verimli ve çevre dostu yöntemlerin geliştirilmesi yoluyla uranyum endüstrisine yarar olabilir. Bu çalışma sağlarilk kanıt CuO-NPS tarafından PBW öncelikli kirleticiler azalmasının memeli hücrelerinde 22 sitotoksitesini azaltır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün numuneler Wyoming bir uranyum ISR tesisin uranyum sıvı işleme binasında toplandı.

1. Üretim Boşaltma Su (PBW)

  1. Bir ISR uranyum tesisinden su örneklerinin iki tür toplayın: PBW ve osmoz (RO) su ters. Iyon değişimi işleminden sonra bir izleme musluktan ama ters osmoz dekontaminasyon önce GT toplayın. PBW ters osmoz tedavisi ile dezenfekte edildikten sonra RO örnekleri toplayın.
    Not: yıkama maddesi, bir sütun içinde toplanmış ve iyon değişimi için hazırlanır uranyum sıvı işleme bina birden fazla sıra alanlardan boru hatlarında taşınır. Yaklaşık iyon değişimi sonrası liksivantın% 1-3 devresinden çıkarılır ve denir üretim boşaltma su (PBW) olduğunu. PBW madencilik süreçlerinde yeniden kullanılabilir ya da RO filtrasyon ile demineralize / dekontamine edilir.
  2. Sıfır baş boşluk göre su yüksek yoğunluklu polietilen örnekleri (HDPE) şişe toplamaknumune toplama ve Çevre Kalite Wyoming Bölümü (WYDEQ) 23 analizi için standart işletim prosedürleri.
  3. Onları serin tutmak için yerinde buz üzerinde ve ulaşım örneklerinde sıcaklık ve pH ölçün.
  4. 4 ° C'de saklayın PBW. Aşağıdaki protokolde belirtildiği gibi medya hazırlanması sırasında eklenen konsantre Eagle minimum esansiyel ortam (EMEM-10x) sonrasına kadar serin PBW çözüm tutun.
    Not: PBW donması ya da oda sıcaklığına kadar ılıtıldı halinde çökeleceği bir oksitlenmiş bir çözümdür. Seyreltildikten sonra PBW çözeltisi yeterli olan bu hücrelere ve kuluçka devresi sırasında, uygulamadan önce ısıtılır, 37 ° C çöktürmek olmaz seyreltin.

CuO Nanopartiküller 2. Hazırlık (CuO-NPS)

  1. (P CuCl2 • 2H 2, O, 0.4 M sodyum hidroksit (NaOH) ve 5 g polietilen glikol 250 ml 0.2 M, 250 ml içeren saf etanol çözeltisi birleştirinAltı mm borosilikat cam topları olan yuvarlak tabanlı bir şişe içinde EG).
  2. Değiştirilmiş bir mikro dalga fırın içinde çözelti yerleştirin ve% 20 gücü (6 saniyelik aralıklar, 24 sn kapalı), 10 dakika boyunca ortam hava basıncı altında geri akış altında reaksiyona girmesine izin verir.
  3. Cam topları bırakarak, daha sonra 50 ml konik tüp içine dökülmüştür, oda sıcaklığında (20 ° C) olarak çözelti soğutulur.
  4. Santrifüj boşaltıldı, 30 dakika için 1000 x g'de 50 ml konik tüp içindeki çözelti ve daha sonra 300 ml sıcak su (60-65 ° C), 100 mi etanol içinde bir dizi ile CuO-NP yıkama, ve 100 ml aseton.
  5. 50 ml konik tüpler oda sıcaklığında (20 ° C) CuO-NPs kurulayın.
  6. Bir harç içine tüplerin dışında CuO-NPs kazıyın. Kalay folyo CuO-NP Kapak ve kalan sıvının çıkması için bir fırın içinde 110 ° C'ye, CuO-NP ısıtın. Tek parti haline CuO-NPs birleştirin ve CuO-NPs tartın.
    NOT: CuO-NPlerin ve pbw CuO-NP tedavisinin hazırlık Su Elemeleri gerçekleştirilmiştirEkosistem Bilimi ve Yönetimi, University of Wyoming lık Laboratuvarı. CuO-NP sentezi Martinson ve Reddy (2009) 11 prosedürü takip etti.

CuO-NPlerin ile PBW 3. Tedavi

  1. Pbw 50 ml, ardından, 50 ml konik tüp, 50 mg, CuO-NP (1 mg / ml) ilave et. Tüp kapatılır ve 250 rpm'de bir masa üstü orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika için reaksiyona sokulmuştur.
  2. Santrifüj örnek tüpleri 30 dakika boyunca 250 xg'de ve daha sonra 0.45 mikron şırınga filtre kullanarak süpernatant filtre. Santrifüj hızını değiştirebilir ve zaman CuO-NPS santrifüj tüpüne kompakt hale sağlamak için nanopartikül bağlı olabilir.

4. Element Analizi

  1. Aşağıdaki element analizi için muamele edilmemiş (kontrol) ve CuO-NP-muamele PBW örnekleri hazırlayın.
  2. 2.0 arasında bir pH değerine eser metal dereceli nitrik asit ile CuO-NP-tedavi edilen ve edilmeyen pbw hacimde (40 mi) asitleştirin. Endüktif olarak coupl göre katyonlar için asitleştirilmiş PBW alikotları analized plazma Kütle Reddy ve Roth (2012) 13 de tarif edildiği gibi spektroskopisi (ICP-MS).
  3. CuO-NP-tedavi edilen ve edilmeyen pbw unacidified alikotları (20 mi) Hazırlama ve Reddy ve Roth (2012) 13 de tarif edildiği gibi iyon kromatografisiyle (IC) anyonları için unacidified alikotları analiz eder.
    NOT: Alikot Tarım Analitik Hizmetleri Wyoming Bölümü Laramie WY 82070. IC ve ICPMS prosedürünün açıklaması Reddy ve Roth, (2012), 13 bulunabilir tarafından analiz edildi.

Pbw kullanarak hücre kültür ortamının 5. hazırlanması

  1. İki kontrol (EMEM-1x ve RO + medya) ve sekiz PBW testi medya çözümleri canlılığı çalışmalarında (her işlem görmemiş GT ve CuO-NP-muamele medya dört konsantrasyonu) kullanın. Aşağıdaki gibi çözeltilerin Özetler şunlardır:
    1. ENEM-1x kontrolü için, L-glutamin ve sodyum bikarbonat zaten eklendi ile Eagle asgari temel medya (EMEM-1x) satın alın. (FBS cenin sığır serumu ekleme) Ve üreticinin talimatlarına göre antibiyotikler.
      Not: ENEM-1x hücre büyümesi ve L-glutamin ve sodyum bikarbonat ihtiva eden uygun konsantrasyona kadar seyreltilmiş satın alınır. ENEM-1x cenin sığır serumu (FBS) ve penisilin ve streptomisin (50 IU / ml penisilin ve 50 ug / ml streptomisin) bir antibiyotik karışımı eklenmesini gerektirir. Bu, bu çalışmada kullanılan iki hücre türü için üreticinin tavsiye edilen büyüme ortamı, çünkü EMEM-1x bir kontrol ortamı olarak kullanılır. Konsantre ENEM-10x testi çözümler üretmek tesis veya tedavi edilmemiş veya CuO-NP-tedavi PBW RO su ile seyreltilir. Konsantre ENEM-10x nedenle bu fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin ve streptomisin antibiyotik karışımı ilave olarak ilave edilir, L-glutamin veya sodyum bikarbonat içermeyen satın alırken.
    2. RO kontrol çözümü için ISR tesisi toplanan RO su kullanın. PBW Test ortamı sadece RO wat% 100 yerine aynı protokolü kullanınPBW yerine ISR tesisinden er. Laboratuvar tedavi edilmezse ve CuO-NP-işlenmiş bir çözüm kullanımı RO veya ultra saf su sulandırmak için.
    3. Hücre kültür ortamı bileşenler ile karıştırılmadan önce dört test konsantrasyonu arıtılmamış pbw seyreltilir. Aşağıdaki kombinasyonlarda (laboratuvar) RO arıtılmamış PBW karıştırılarak tedavi edilmezse PBW çözümleri dört farklı konsantrasyonları hazırlayın:% 100 (saf PBW + hiçbir RO su),% 75 (GT + 62.5 ml RO su içinde 187.5 ml), % 50 ya da% 25 (pbw RO su + 187.5 mi 62.5 mi) (pbw RO su + 125 mi, 125 mi) eklendi.
    4. Seyreltik hücre kültür ortamı bileşenler ile karıştırılmadan önce, dört adet test konsantrasyonlara pbw CuO-NP-işlemden geçirildi. Pbw karıştırılarak CuO-NP-muamele PBW çözümleri dört farklı konsantrasyonda hazırlanması aşağıdaki kombinasyonlarda (1 mg ile ön-muamele edilmiş / ml CuO-NP, 30 dakika boyunca) (laboratuvar) RO:% 100 (saf CuO- NP-muamele PBW + bir RO su),% 75 (CuO-NP-muamele PBW + 62.5 mi RO su 187.5 mi),% 50 (125ml RO pbw su + 125 ml) ya da% 25 (CuO-NP ile muamele edilmiş pbw RO su + 187.5 mi) 62.5 ml CuO-NP-işlemden geçirildi.
  2. % 100 RO 190 ml ve% 100,% 75,% 50 ya da konsantre EMEM-10x 25 ml ekleyerek RO + ortam, muamele edilmemiş pbw + ortam ve CuO-NP-muamele PBW + ortam konsantrasyonu 250 ml hazırlayın Aşama 6.1.3 ve 6.1.4 oluşturulan önceden hazırlanmış tedavi edilmemiş veya CuO-NP-muamele PBW konsantrasyonlarının% 25.
  3. NaOH veya HCI ile 7.4 'e, her çözeltinin pH ayarlayın.
  4. 25 ml (% 10), fetal sığır serumu (FBS), 2.5 ml L-glutamin, 0.55 g NaHCO 3 ve 1.25 ml Pen: Her bir muamele edilmemiş ve CuO-NP-muamele pbw konsantrasyonu olarak RO + ortamı aşağıdaki standart bileşenleri ile Ek / Strep (50 lU / ml penisilin ve / ml streptomisin 50 ng).
  5. Muamele edilmemiş pbw + ortam her bir konsantrasyonu ozmolalitesini ayarlayın, RO suyun eklenmesi ve ölçü bir osmometre kullanılarak 290-310 mOsm / kg arasında PBW + medya ve RO + ortamı CuO-NP-işlemden geçirildi.
  6. Kullanarak her çözüm Filtre4 ° C'da bir 0.22 mikron vakum filtre birimi ve saklayın.
    Not: tedavi edilmemiş pbw + ortam konsantrasyonlarda% 56,% 44 de,% 29 ve% 16.5 ve CuO-NP ile% 5 aralığında son ortam konsantrasyonları, değişebilir, osmolalite ayarlamak için kullanılan RO su miktarı hafif varyasyonlar nedeniyle % 53,% 45,% 30 ve% 17 PBW + ortam konsantrasyonları işlemden geçirildi.

6. Hücre Canlılık

NOT: Böbrek ve karaciğer ağır metal toksisitesi hedef organlar olduğu göz önüne alındığında, kültürlü insan embriyonik böbrek (HEK293) hücreler (HEK) ve insan hepatosellüler karsinom (HepG2) hücreleri (HEP) test yöntemleri 24-26 kullanır.

  1. 2-3 gün, üretici talimatlarına göre deneyde kullanılan, 96 gözlü levhalar kaplama önce HEK ve HES hücre kültürü hazırlayın.
  2. 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) deneyi kullanılarak hücre canlılığı ölçülür.
    Not: MTT tahlili protokolü MEE değiştirildiğirloo ve ark. (2011) 27.
    1. Toz biçiminde MTT elde edilir. 50 mg / ml'lik bir stok konsantrasyonu telafi etmek için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ekleyin. 2 saat için çözüm çalkalayın ve sonra 1.5 ml dondurucu güvenli tüpleri içine 0.45 mikron şırınga filtresi ve kısım ile filtre. 4 ° C'de ışık ve mağaza tüpleri koruyun.
  3. 5 dakika boyunca 1.000 xg'de tripsin, santrifüj kullanılarak kendi kültür yemeklerinden HEK ve HEP hücreleri çıkarın ve tripsin süzün. 5 ml PBS ilave edilerek tek hücre çözelti elde etmek için hücreleri karıştırın. Daha sonra, çözelti mililitresi başına bir hücre sayımı elde etmek için bir hemasitometre tek bir hücre çözeltisinin 20 ul geçerlidir. 5 dakika boyunca 1.000 xg'de tekrar hücreleri Santrifüj ve PBS hücrelerini durulama için kullanılan süzün. 500 hücrenin hücre konsantrasyonunu ayarlamak için EMEM-1x uygun miktarda / 100 ul (100 ul / oyuk).
  4. Buharlaştırma kontrol etmek için 200 ul PBS ile plakanın çevre kuyu doldurun.
  5. Tohum hücresi500 hücre yoğunluğunda iy (hücreleri ile kaplı değildir), çevre kuyuları için hariç olmak üzere, her bir göze 100 ul / eklemeler.
    NOT: HEK ve HEP hücrelerinin Tohumculuk yoğunluk artışı zirve günlerinde 4-5 civarında meydana gelmesine izin deneysel büyüme eğrilerine dayanmaktadır. Tüm hücre hatları ekim yoğunluğunu tahmin etmek için büyüme eğrileri hazırlayın.
  6. Bunların, hücre yoğunluğu taban MTT okumaları gerçekleştirmeden önce (plakaya bir şekilde sıkı bir adezyon) kurtarmak için izin 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe hücreleri.
  7. (Çevre dahil) olanlar sütunundan tohumlama ortamı kaldırma ve 1 st için çukurlara MTT 100 ul (ortam içinde 5 mg / ml) eklenerek hücre yoğunluğu başlangıçtaki MTT okumaları gerçekleştirin.
  8. Bir saat sonra, MTT çıkarın ve canlı hücreler (20 dk) ile üretilen MTT-formazanın eritilmesi için dimetil sülfoksit (DMSO), 100 ul ilave edin.
  9. Bir baz elde etmek için 570 nm bir emme dalga boyu birinci sütun optik yoğunluk (OD) okuhat okuma.
    1. Tüm plakaları doğru seribaşı ve hücreler levhalar arasında sürekli büyüyor emin olmak için temel okumalar kullanın. Sütundan DMSO'yu kaldır önümüzdeki 24 saat için kuluçka önce test ediliyor.
      Not: DMSO plakasında bırakılırsa, gece boyunca bu ortam hacminde bir azalmaya neden olan bitişik sütunundan nem çeker.
  10. Test çözeltileri sıcak (yani, EMEM-1x, RO, muamele edilmemiş pbw CuO-NP-muamele PBW ortam çözeltiler), bir su banyosu içinde 37 ° C arasındadır.
  11. Ve ENEM-1x, RO + ortam, muamele edilmemiş PBW + ortam konsantrasyonlarına veya CuO-NP 100 ul ile ikame (çevre veya başlangıç ​​okuma için kullanılan ilk sütun dahil değil) plakanın geri kalanından tohumlama ortamını çıkarın ile tedavi edilen PBW + medya konsantrasyonları (plaka başına bir çözelti). Yedi gün (Günler 2-8) 'in bir toplam, test konsantrasyonları ya da kontrol Çözeltilerin hücreleri inkübe edin.
    NOT: Toplam Orada 10 tabak: 1 EMEM-1x, 1 RO + medya, her işlem görmemiş PBW + medya konsantrasyonu 1 (% 56,% 44,% 29 ve% 16.5) ve her CuO-NP-muamele PBW + medya konsantrasyonu bir tabak (% 53,% 45 hücre hattı başına deney başına% 30 ve% 17).
  12. Bazal MTT okuma izleyen her gün, kendi plakasının sonraki sütundan (6,11 altında not listelenen) kontrol ve test çözümleri çıkarın (örneğin 2. Gün test ve kontrol ortamı, kuyular BG satırda 3 kaldırılır, 3. Gün: satır 4, kuyular BG vb) ve yukarıdaki adımda 6,7-6,9 tarif edildiği gibi MTT protokolü tekrarlayın.
  13. Yedi gün boyunca her gün protokolünü tekrarlayın. Her satır (6 kuyu) için OD sonuçlarını ortalamasını ve yedi günlük büyüme eğrisi oluşturmak için zamana karşı bildirdi.
  14. Hücre canlılığı üzerindeki bakır şelasyon etkisini değerlendirmek için GT CuO-NP-muamele + kendi plakaları çözüm eklemeden önce test çözümleri kontrol etmek için D-penisilamin 100 mcM ekleyebilir ve dışındaki medya, yukarıdaki gibi aynı prosedürü uygulayın. Veri anal yapınYsis bilimsel grafik yazılımı kullanarak.

7. Jeokimyasal Modelleme

  1. Aşağıdaki web sitesinden Görsel MINTEQ sürüm 3.0 / 3.1 ücretsiz indir http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    Not: Visual MINTEQ metal türleşme, çözünürlük, doğal sularda sorpsiyon vb hesaplanması için ücretsiz bir kimyasal denge modelidir. Buna ek olarak, iyon tepkimeleri, iyon aktiviteleri, iyon kompleksleri ve element çıkarılması 28 olası mekanizmalarını incelemek için tedavi (Kütle Spektroskopisi sonuçları) önce ve sonra elemanlarının konsantrasyonuna kıyasla doygunluk indeksleri tahmin etmek için kullanılır.
  2. Program ve girdi pH, alkalinite ve programa değişik elementlerin konsantrasyonları da dahil olmak üzere 4. adımda, gelen kütle spektroskopisi verileri açın.
    NOT: Yeraltısuyu in situ urani içinde sırasında okside olduğu göz önüne alındığında,um çıkarma işlemi, giriş için arsenik, vanadyum, ve uranyum oksitlenmiş türleri kullanılır.

8. İnhibitör Konsantrasyon 50 (IC50)

  1. İlk üç ayrı çalışma gününde, 5 canlılığı (OD ortalama) ortalaması alınarak muamele edilmemiş ve CuO-NP-muamele PBW + ortam konsantrasyonları için IC50 hesaplayın.
  2. ENEM-1x gün beş canlılık ortalamalarından tedavi edilmezse ve CuO-NP-muamele PBW + medya konsantrasyonlarının çıkarma gün beş canlılık ortalamaları canlılığı farklılıkları hesaplamak için. Sonra ENEM 5 günde ortalama canlılığı ile canlılık farklılıkları bölmek ve yüzde inhibisyon elde etmek için 100 ile çarpın.
  3. Her işlemden geçirilmemiş ve CuO-NP-muamele PBW + medya konsantrasyonu için yüzde canlılığı elde etmek için 100 (EMEM-1x canlılığı) den yüzde inhibisyon çıkarın.
  4. Tek bir konsantrasyon ve 100 yüzde canlılığı ile EMEM-1x ayarlayarak bilimsel grafik yazılımı içine girdi; günlüğüne tüm konsantrasyonlarını dönüşümüÖlçek (X = Log (X)) ve en küçük kareler uyum analizi ile doğrusal olmayan regresyon gerçekleştirin.

9. Veri analizi

  1. Bir iki kuyruklu eşleştirilmiş, Öğrenci T-testi ile tedavi edilmemiş ve CuO-NP-tedavi PBW öğelerin konsantrasyonları karşılaştırın.
  2. Yedi gün boyunca toplanan büyüme eğrisi verileri kullanılarak eğri (AUC) altındaki alanların hesaplayın ve tekrarlayan ölçümlerde varyans analizi (ANOVA) ile değişimini analiz etmek, tüm gruplar arasında Tukey post hoc karşılaştırma ardından (n = 3).
  3. . Tedavi edilmemiş ve CuO-NP-muamele GT + (yukarıda anlatılan) medya çözümleri hem büyüme eğrisinin günden beş verileri kullanarak IC 50 hesaplayınız 0.05 anlamlı olarak kabul edilir <P değerleri.
    NOT: İstatistiksel analiz amacıyla, yarım algılama sınırı kütle spektroskopisi değerleri, o sınırın 29 altında iyonları konsantrasyonları seviyelere atandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muamele edilmemiş ve CuO-NP-muamele pbw PBW bileşeni konsantrasyonu ve pH değeri, Tablo 1 'de bildirilmiştir. Martinson ve Reddy (2009), CuO-NP sıfır şarj noktası 9.4 ± 0.4 olarak tahmin edilmektedir bildirmiştir. Bu koşullar altında, pbw pH 7.2-7.4 idi ki, su nanopartikül yüzeyi pozitif negatif yüklü türler soğurulması için izin tahsil için neden, CuO-NP protonları bağışta. Arsenik, selenyum, uranyum ve vanadyum (Tablo 1) de dahil olmak üzere pbw arasında, CuO-NP tedavisi çıkarıldı öncelikli kirleticiler. Ortalama arsenik konsantrasyonu [0.002 mg / L (iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testi, p <0.0001) 0.0175 den]% 87 oranında azalmıştır. CuO-NP, aynı zamanda tedavisi, indirgenmiş selenyum (% 30), uranyum (% 78), vanadyum (% 92) ve fosfat (% 85) (p <0.05).

Türleşme modelleme sonuçları, Tablo 2'de rapor, analitik sonuçların desteklenmesi ve:% 99kolondan 4 2- olarak bulunur ve pbw toplam çözünmüş selenyum 94 -% pbw Tal çözündürüldü arsenik Haso 4 2 ve H 2 ASO 4 olarak mevcuttur. Bu türler olumsuz CuO-NPS adsorbasyonunun dolayısıyla yetenekli, tahsil edilir. Türleşme modelleme PBW vanadyum türlerinin% 99 olumsuz da CuO-NPS adsorpsiyonu teşvik tahsil edilir öngördü. Ancak, türleşme modelleme CuO-NPS adsorpsiyonu sınırlayan türlerin negatif yüklü olan uranyum, sadece 35.5% öngördü. Doygunluk indekslerinin Analizi arsenic-, selenium-, uranyum ya da vanadyum içeren minerallerin hiçbir tür doygunluk yakın (yani, mineral yağış) düzeyleri, CuO-NPS destekleyici adsorpsiyon, karşı yağış olduğunu öngördü.

Öncelikli kirletici maddelerin beklenen konsantrasyonu muamele edilmemiş ve CuO-NP-muamele pbw, seyreltilmemiş kontrol ortamının örnekleri (EMEM-1x),% 56 elde edilen ortam içinde olup olmadığını değerlendirmek için,muamele edilmemiş PBW + Medya ve% 53 CuO-NP-muamele PBW + ortam ICP-MS ile analiz edilmiştir. Seyreltilmemiş kontrol ortamı (EMEM-1x), L-glutamin ve sodyum bikarbonat ile birlikte ticari bir üründür (ön) eklendi. Kontrol ENEM-1x Bakır ve selenyum konsantrasyonları hafifçe onlar hücre büyümesi için gerekli olduğundan beklendiği gibi yüksek, ancak arsenik, uranyum ve vanadyum Tablo 3'te rapor, önemsiz edildi. Ön çalışmalar, arsenik, selenyum ve vanadyum konsantrasyonları azalma olduğunu gösterdi CuO-NP tedavi ve azalış CuO-NP-muamele GT + medyada konsantrasyonlarda temsil edildiğini. CuO-NP-muamele GT + medyada uranyum ölçülen konsantrasyon tedavi edilmemiş PBW göre azaldı, ve bu azalmanın Görsel MINTEC v.3 modelleme ile tahmin edilenden daha belirgin oldu. Beklendiği gibi bakır düzeyleri CuO-NP-muamele medyada yükseldi.

Memeli ilgili pbw sitotoksisitesini iyileştirmek için CuO-NP tedavi etme yeteneğini tayin etmek içinHücreler, canlılık önce pbw + ortam çözeltilerine maruz bırakılan hücrelerde ve CuO-NP tedaviden sonra değerlendirildi. Hem HEK (Şekil 1A) ve HEP (Şekil 1B) hücreleri yedi gün boyunca işlemden geçirilmemiş ya da tedavi pbw + ortamın farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır. CuO-NP tedavisi her iki hücre hatlarında hücre canlılığı geliştirilmiş ise muamele edilmemiş pbw + ortam içinde yetiştirilen hücreler olarak, canlılık, konsantrasyona bağımlı bir şekilde zayıflatılmıştır. Şekil 1C'de entegre EAA yetiştirilen HEK hücreleri pbw CuO-NP ile muamele + ortam muamele edilmemiş pbw + ortam üç en yüksek konsantrasyonlarda (% 29,% 44 ve% 56) ile karşılaştırıldığında daha uygun olduğunu göstermektedir. Muamele edilmemiş pbw + ortam (% 44 ve% 56), sadece, iki yüksek konsantrasyonlarda CuO-NP-muamele pbw + ortam (Şekil 1D) ile karşılaştırıldığında bozulmuş canlılığı göstermiştir: HEP hücreler biraz farklı canlılığı göstermiştir. pbw daha seyreltik konsantrasyonlar HEP hücreler için daha az toksik olduğu ve hücre yaşayabilirliği daha işlenerek etkilenir.% 16.5 Tedavi edilmeyen GT + medyada yetiştirilen hem HEK ve HES hücrelerinin canlılığı% 53 CuO-NP-muamele GT + medya (p <0.05) yetiştirilen hücreler önemli ölçüde farklı değildi. Böylece, CuO-NP tedavi kontrol seviyeleri yakın canlılığı ile PBW sitotoksisitesini iyileştirmek için ortaya çıktı. Yukarıda ele alındığı gibi, pbw CuO-NP tedavisi bakır konsantrasyonlarında bir artış ile bağlantılıdır. Artış Reddy ve Roth (2012) tarafından daha önceki sonuçlarına göre, beklenen, hangi onlar yeraltı suyundan arsenik kaldırmak için CuO-NPs kullanılır. Bakır artış pbw belirli bir su kimyasına bağlı olarak, ancak 1.3 mg / L arasında EPA MCL altında kalmıştır. Bununla birlikte, bakır konsantrasyonlarında artış, daha iyi canlılığı katkıda bulunduğunu ekarte etmek için önemli olduğunu (yani, ya da bunun yerine öncelikli kirletici azalması, ve ek olarak). Buna göre, bakır celatçı D-penisilamin EMEM-1x kontrolü, RO + medya kontrolü, tedavi edilmemiş ve CuO-NP-muamele PBW + medya çözümleri ve th eklendiyukarıda tarif edildiği gibi en MTT canlılığı büyüme eğrisi, oluşturulmuştur. Bakır kenetleme belirgin değildi RO + ortam kontrolü, muamele edilmemiş ve CuO-NP-muamele pbw + ortam içinde inkübe edilmiş HEK ya da Hepatit hücrelerden canlılığını etkileyen (sonuçlar gösterilmemiştir).

Yarım maksimal inhibisyon konsantrasyonu (IC50), HEK beş gün büyüme ve muamele edilmemiş pbw + ortam (Tablo 4A) ve CuO-NP-muamele pbw + ortam (Tablo 4B) yetiştirilen HEP hücrelerinden hesaplandı. Muamele edilmemiş pbw + ortam içinde büyümüş HEK hücreleri için, IC50 değeri 1,264 (% pbw log) idi. Böylece, muamele edilmemiş PBW + ortam canlılığında% 50 azalma elde etmek için 18.38% seyreltilmiş olması gerekir. CuO-NP-muamele pbw + ortam içinde büyümüş HEK hücreleri için, IC50 değeri 2,744 (% pbw log) idi. Bu sonuç, teorik olarak çözeltinin sitotoksisite PBW + ortamı içindeki% 50 DE üretmek üzere (% pbw = 2,744 log)% 500 ile konsantre edilmesi gerekir tedavi ölçüde azaldığını göstermektedircanlılığı kırışık. Tedavi edilmeyen GT + medyada yetiştirilen HEP hücreleri için, IC 50 (% ağırlıkça log) 1.243 idi. Bu canlılığında% 50 bir azalma elde etmek için% 17.5 pbw + ortam bir seyreltme gerektirecektir. Bunun aksine, CuO-NP-muamele pbw + ortam içinde büyümüş HEP hücreleri için, IC50 (% pbw log) 5,327 idi. CuO-NP-muamele pbw + ortam içinde hücrelerin canlılığı EMEM-1x (kontrol) içinde büyüyen hücrelerin farklı değildi, çünkü bu değer büyük olasılıkla, çok büyüktü. Beşinci günde iki HEK ve HES hücresel büyümenin, Şekil 2 'de gösterilen Parlak alan görüntüleme. CuO-NP-muamele PBW + ortam (Şekil 2E, F) Hücre sayısı ve bağlanma muamele edilmemiş pbw + ortam (Şekil 2C ve D) ile karşılaştırıldığında geliştirilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1: Büyüme Eğrileri. Büyüme eğrileri canlılığı ve g değerlendirmek için kullanıldıTedavi sırasında kültürlerin rowth. HEK (A) ve HEP için büyüme eğrileri (B) hücreler,% 53, CuO-NP-muamele pbw + ortam (üst panel) ile karşılaştırıldığında pbw + ortam dört seyreltileri yetiştirilir. ENEM-1x kontrolü (EMEM) RO % 53 CuO-NP ile muamele ,% 16,5 arıtılmamış PBW ,% 29 işlenmemiş PBW % 44 işlenmemiş PBW % 56 işlenmemiş PBW . HEK (C) ve HEP (D) 7 gün büyüme eğrisi verileri (alt paneller) eğrisi (AUC) analiz altındaki alan. * P <0.05 RO kontrol ile karşılaştırıldığında ENEM kontrolü, #p <0.05 ile karşılaştırıldığında, §p <0,05% 53 CuO NP-muamele PBW-ortam ile karşılaştırıldığında. (Iki kuyruklu ANOVA ile karşılaştırıldığında kullanılarakTukey post hoc analizi, n = 3)

Şekil 2,
Şekil 2:. EMEM-1x kontrolü (EMEM) (A, B: öncesi ve CuO-NP tedaviden sonra hücre morfolojisi parlak alan mikroskopisi HEK (sol sütun) ve HEP (sağ kolon), 5. günde hücrelerin (20X), yetiştirilen ),% 56 işlem görmemiş PBW + ortam (C, D) ve% 53 CuO-NP-muamele PBW + ortam (E, F), hücre morfolojisi incelemek için kullanılmıştır. ENEM-1x kontrolü (EMEM) içinde yetiştirildi ve HEK HEP hücreleri (A, B), sağlıklı, yakın konfluent bir gelişme göstermektedir. Muamele edilmemiş pbw + ortam içinde büyümüş HEK ve HES hücre sayıları azalttı ve (C, D), bağımsız olarak görünür. CuO-NP-muamele GT + medyada yetiştirilen HEK ve HEP hücreleri daha iyi eki ve sağlıklı, daha konfluent hücreleri (E göstermek F).

Eleman (mg / L) Ortalama, Aziz Dev. & Önemi
Tedavi öncesi Tedavi Sonrası
Arsenik 0.018 ± 0.001 0.002 ± 0.0 ***
Selenyum 1.8 ± 0.07 1.3 ± 0.05 **
Bakır 0.0015 ± 0.001 0.93 ± 0.43 *
Kalsiyum 102 ± 82 106 ± 15
Stronsiyum 3.3 ± 1.1 1.5 ± 0.4 *
Magnezyum 44 ± 2.1 47 ± 1.7
Sodyum 610 ±; 0.0 627 ± 27
Uranyum 0.98 ± 0.03 0.21 ± 0.03 ***
Baryum 0.037 ± 0.02 0.019 ± 0.01
Potasyum 12 ± 0.0 12 ± 0.8
Silisyum 12 ± 0.7 12 ± 0.5
Vanadyum 1.3 ± 0.07 0.1 ± 0.02 ***
Fosfat 0.35 ± 0.07 0.05 ± 0.0 ***
Sülfat 805 ± 21 807 ± 15
Iletkenlik 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7.31 ± 0.09 7.36 ± 0.05

Tablo 1:. Öncesi ve CuO-NP tedavi sonrasında katyon ve anyonların analizi Ortalama elemanı konsantrasyonları önce ve CuO-NP ile muamele edildikten sonra. CuO-NP-tedavi edilen ve edilmeyen pbw konsantrasyonu arasındaki önemi, * = p <0.05 olarak belirlenmiş ** = p <0.01 ve *** = p <0.001. Boş hücre anlamlı bir fark gösterir. Klorür konsantrasyonu 8.180 ± 0.707 ± 46.5 ile 55,25 arasında değişmektedir. Alüminyum, bor, molibden ve konsantrasyonları düşük nedeniyle CuO-NP tedavisine önemli bir değişim gösterdi. Manganez konsantrasyonları tutarlı değildi.

Bileşenler Toplam konsantrasyon% Tür
Arsenik 58.7 Haso 4 2-
41.2 H 2 Aso 4 -
Uranyum 64.1 Ca2 UO 2 (CO3) 3 (sulu)
32.2 CaUO 2 (CO3) 3 2-
0.03 UO 2 (CO3) 2 2-
3,5 UO 2 (CO3) 3 4-
0.09 Ca2 UO 2 (CO3) 3 (sulu)
0,02 CaUO 2 (CO3) 3 2-
Selenyum 94.3 SeO 4 2-
5.6 CaSeO 4 (sulu)
Vanadyum 2.1 HVO 4 2-
95.7 H 2 VO 4-
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0,01 HV 2 O 7 3-
0,01 V 4 O 12 4-

Tablo 2: Türler Görsel MINTEQ Sür kullanarak modelleme. 3.0 yazılımı. Görsel MINTEQ ver. 3.0 yazılımı (Teknoloji KTH Royal Institute, Valhallavägen, İsveç), Tablo 1 'de listelenen PBW bileşenlerin metal Türleşmeyi hesaplamak için kullanıldı. (Sulu) = Sulu bu türün katı formda karşı.

ENEM Kontrolü İşlenmemiş
PBW PBW + medya
Arsenik 0.003 ± 0.0 0.017 ± 0.0 0.010 ± 0.001
Bakır 0.01 ± 0.0 0.0015 ± 0.001 0.018 ± 0.0
Selinium 0.013 ± 0.002 1.75 ± 0.07 1.15 ± 0.06
Uranyum 0.00015 ± 0.0 0.975 ± 0.03 0.71 ± 0.01
Vanadyum 0.0015 ± 0.0 1.25 ± 0.07 0.785 ± 0.007
CuO NP-muamele
PBW PBW + medya
Arsenik 0.0022 ± 0.001 0.0015 ± 0.0
Bakır 0.926 ± 0.4 0.81 ± 0.0
Selinium 1.25 ± 0.05 0.855 ± 0.0.02
Uranyum 0.208 ± 0.03 0,45 ± 0,01
Vanadyum 0.102 ± 0.02 0,0795 ± 0,01

Tablo 3:. Medyada kirletici yoğunlukları EMEM-1x kontrol öncelikli kirletici (mg / L) (EMEM), muamele edilmemiş pbw konsantrasyonları, CuO-NP-muamele pbw muamele edilmemiş PBW + ortam ve CuO-NP-muamele PBW + Medya ortam bileşenleri eklendikten sonra (n = 3) muamele edilmemiş PBW + medya ve temsil edilmiştir tedaviye bağlı kirletici konsantrasyonu değişiklikleri sağlamak için değerlendirildi pbw CuO-NP ile muamele + ortam cel uygulananls.

Bir Tedavi edilmeyen PBW + Medya
Tedavi edilmeyen pbw konsantrasyonları (X log) % Canlılık (HEK hücreleri) % Canlılık (HEP hücreleri)
ENEM 100 100
% 16,5 (1,217) 51.4 50.8
% 29 (1.462) 39 33.3
% 44 (1,643) 19.3 14.7
% 56 (1.748) 14.5 9.4
IC 50 Log [PBW] 1.264 1.243
B PBW + Media CuO-NP-tedavi
CuO-NP-Tedavi PBW (log X) konsantrasyonları % Canlılık (HEK hücreleri) % Canlılık (HEP hücreleri)
ENEM 100 100
% 17 (1.230) 86.7 119.8
% 30 (1.477) 75.8 86.7
% 45 (1.653) 81 92.4
% 53 (1.724) 70.3 97.5
IC 50 Log [PBW] 2,744 5,327

Tablo 4: IC 50. IC50 hesaplaması canlılığının% 50 engellenmesi için gerekli olan işlem görmemiş pbw + ortam veya CuO-NP-muamele pbw + ortam konsantrasyonunu temsil eder.   muamele edilmemiş PBW + Medya (A) veya CuO-NP-muamele PBW + Medya (B) dilüsyonları maruz HEK ve HES hücreleri için, 5. günde, yüzde canlılığı yarım maksimum inhibitör konsantrasyonunu (IC50) tahmin etmek için kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Önceki çalışmalar CuO-NPS yeraltı suyu 11,13,30,31 gelen arsenik kaldırıldı bildirdi. Bu çalışma, bu daha önceki bulguları destekler ve aynı zamanda CuO-NPS PBW ek kirlilikleri uzaklaştırmak olduğunu bildiriyor. Bu çalışma aynı zamanda CuO-NPS diğer kirletici ve potansiyel rakip iyonların 11 varlığına rağmen, arsenik uzaklaştırılması etkili olduğuna dair önceki raporlar teyit etmektedir. Türleşme modelleme CuO-NPS adsorpsiyon için izin PBW vanadyum türlerinin% 97 negatif yüklü olduğunu tahmin ve toplu arıtma vanadyum% 92 kaldırıldı.

Bu CuO-NP kullanarak PBW belirli kirlilikleri kaldırarak etkilerini araştırmak ve daha sonra kaldırılması ile ilişkili sitotoksisite değişiklikleri değerlendirmek için ilk çalışmadır. Sonuçlar, bir in vitro bir yaklaşım kullanarak karmaşık karışımların sitotoksisite değişiklikleri araştıran mümkün olabileceğini göstermektedir ancak bu yöntemler sınırsız değildir. PBW f kullanılamadıHayatta kalmak için, çünkü hücreler üzerinde ull gücü, kültürlenmiş hücreler, tanımlanmış bir büyüme ortamı ve spesifik osmolalite gerektirir. PBW + Medya da pH ayarlaması yapılmadan hücreleri üzerinde kullanılamadı. pbw pH önce 7.31 ve bununla birlikte tedavi sonrası 7.36 idi; Büyüme ortamı bileşenlerinin ilave seyreltme bağlı olarak yaklaşık 6.8 pH azalır. PH ayarlaması, ancak hücre kültür ortamının hazırlanmasında normal adım; PBW + ortamının pH değerinin ayarlanması ortam komponentleri ile elemanının türlerin moleküler etkileşimleri değiştirmiş olabilir. İşlem görmemiş ve CuO-NP-muamele PBW test çözeltileri (PBW + ortam) elde etmek üzere çeşitli oranlarda konsantre edilmiş EMEM-10X büyütme ortamı ile bir araya getirilmiştir. ICP-MS analizi, önemli ölçüde CuO-NP-muamele (arsenik, bakır, selenyum, uranyum, vanadyum) etkilenen metallerin konsantrasyonu ortam bileşenleri ve ozmolalite ayarlama ile seyreltildikten sonra beklenen konsantrasyonlarda olduğu doğrulamak için test ortamı üzerinde gerçekleştirilmiştir. azalmaCuO-NP-muameleden sonra, arsenik, selenyum ve vanadyum tedavi edilmemiş pbw + ortam ve CuO-NP ile muamele pbw + ortam arasındaki konsantrasyon farkları yansıtılır. Uranyum konsantrasyonları tahmin edilenden CuO-NP-muamele GT + medyada yüksektir. ICP-MS verileri (Tablo 1) modelleme öngörülenden daha fazla uranyum CuO-NP tedavisi sırasında PBW çıkarıldı düşündürmektedir. Türleşme modellemesi (Tablo 2) pH 7.3, uranyum türlerinin sadece% 35.5 negatif yüklü olduğunu öngördü. Model büyük uranyum türleri, kalsiyum karbonat uranil (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3), nötr olduğunu öngörür.

Uranyumun gözlenen% 78 çıkarılması nedeniyle (kalsiyum karbonat uranil mineral gibi) uranyum adsorpsiyon ve yağış bir arada muhtemelen oldu. Jeokimyasal modellemeye dayalı olarak, adsorpsiyon ile ayrılmıştır uranyum yüzdesi CuO-NP daha yüksek bir konsantrasyon için izin hesaplanan daha azdırile tedavi edilen PBW + medya. CuO-NP-tedavi ile uranyum çıkarma mekanizması açık değildir ve daha fazla araştırma gerektirmektedir. PBW Ancak ENEM-10x eklendiğinde kalsiyum, potasyum ve magnezyum konsantrasyonunda bir artış tahmin edildi; Hiçbir fark CuO-NP-muamele GT + medyada vs tedavi edilmeyen görüldü yüzden CuO-NP-tedavi bu unsurlar önemli bir değişim vermedi. medya bileşenleri ile gerçek çevresel birleştirerek tekniği tedavi nedeniyle element konsantrasyonları görülen değişiklikleri temsil başarılı oldu; Ancak GT oksitlenmiş doğa PBW + medya yapılabilir nasıl sınırlı. Test ortamı içinde elemanların maksimum konsantrasyonunu arttırmak için yapılan bir girişimde, toz haline getirilmiş hücre kültür ortamı başlangıçta pbw + ortamı olmak için muamele edilmemiş ve CuO-NP-muamele pbw ile karıştırıldı. toz haline getirilmiş ortam, genellikle, kalsiyum tuzlarının çökelmesine yol açtı ve yoğunlaştırma üreten RO Su ile daha fazla seyreltme gerekli pbw + ortam osmolalitesinin artmışSıvı 10x ortam ile elde edilenlere yakın yerel yönetim bu. Bu sorunlar nedeniyle oksidatif durumuna PBW özgü büyük olasılıkla ve diğer daha az duyarlı karışımları ile ilgili bir sorun olmayabilir.

MTT deneyi Bu mitokondriyal aktiviteyi ölçmek suretiyle hücre genel sağlık değerlendiren bir tanınan standart, yüksek verimli bir deney olduğu sitotoksikliğinin değerlendirilmesi için seçildi. Bu yöntem, avantaj ve dezavantajlara sahiptir. 96-kuyulu bir formatın, bununla birlikte birden çok veri noktasının elde edilmesi için yararlı olduğunu bulmuştur; 5. günde hücrelerin çoğunluğu, ideal sağlıksız yuvarlak ve artık plakaya eklenmiş. medya vakum kullanılarak çıkarıldı önce Şekil 2'de fotoğrafların çekildiği; medyayı kapalı aspirasyon ve ardından MTT çözeltisi tedavi edilmeyen PBW görülen Gün İki sonrası MTT sinyalinin genel plato katkıda kötü yapışmış olan hücrelerin unattached hücreleri kaldırılmış veya müstakil olabilir ekledi. varsayım o yüzen hücreler ölü veya ölmekte ve olmasıdırnly yapışmış hücreler, bu yöntem kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu nanopartiküller kullanan çalışmalara göre MTT analizi sınırlamaları dikkate almak da önemlidir.

Daha önceki çalışmalar, doğrudan kültürlenmiş hücreler uygulandığında, nanopartiküller büyüklüğü gibi eşsiz fiziksel özelliklere bağlı olarak, baz kimyasal özellikleri ötesinde, içsel toksisiteye sahip olan ve 32,33 şekil olabilir bildirmiştir. Bu çalışmada, biz hücreler üzerine direkt CuO-NPs geçerli değildi. Bunun yerine, hücreler daha önce CuO-NPlerin çoğunluğunu uzaklaştırmak için santrifüjlendi, CuO-NP ile muamele edildi ve daha sonra PBW pbw + ortamı hazırlamak için kullanıldı önce daha fazla CuO-NPS temizlemek için iki kez süzüldü edilmiş pbw maruz bırakılmıştır. MS sonuçları tedaviden sonra bakır bir artış gösterdi. Bu tedavi PBW u kalmaya santrifüj / filtrasyon adımlarda geçmiş olabilir tedavisi veya CuO-NPS sırasında nanopartiküller gelen çözüldü bakır iyonları olabilirGT + medyayı yapmak sed. CuO-NPler 85 ± 1 m2 / g, 11 BET ölçülen yüzey alanı ile 12-18 nm aralığında bir boyutta, ancak, bakır en olursa olsun, tedavi pbw bakır konsantrasyonlarında çok az artış toplamak için bilinen dayanır kaynağın santrifüj ve süzme sonra çıkartılır. Geliştirilmiş hücre sağlığı ve izdiham Görsel onay (Şekil 2) nedeniyle pbw CuO-NP tedavisi için geliştirilmiştir canlılığı MTT tahlil sonuçlarını desteklemektedir. Değerlendirmek (ya da karakterize) olabilir CuO-NPS neden benzer karıştırıcı etkilerini diğer yöntemleri kullanarak gelecekteki çalışmalar.

Insan embriyonik böbrek (HEK 293) ve insan hepatoselüler karsinoma (Hep G2) hücreler toksisite testleri için seçilmiştir. Bu ağır metal organ toksisitesi 24,25,34-40 klinik alakalı bir standart hücre hatları vardır. Düşük bir tohum yoğunluğu MTT testleri için kullanılmıştır. Hücreler geri bırakıldı / oyuk 500 hücre ekildi24 saat süre ile ve daha sonra, test ortamına maruz bırakılmıştır. Düşük tohum yoğunluğu günde 6 veya 7 Chakraborty ve ark aşırı birleşik ve sabit hale gelmeden önce, günde yaklaşık 5 günlük faz ile, bir büyüme eğrisi elde etmek için gerekli idi. (2010), bildirilen kültürlenmiş böbrek üzerindeki kadmiyum toksisite çalışmasında Alt birleşik hızla çoğalan hücreleri konfluent (latent) hücrelerden daha fazla sitotoksisite gösterdi: proksimal tübül hücreleri (PTC), confluency ve çoğalması durumu kadmiyum maruziyeti yanıtı etkilenen (latent vs çoğalan). Diğer deney için kullanılanlara benzer yüksek bir konsantrasyonda (yüksek konflüansa) de pbw maruz HEP HEK hücreleri MTT deneyi ile görülen morfolojik sağlam bir değişiklik göstermemiştir (sonuçlar gösterilmemiştir). Yapışmayan hücre hatları veya hasat ve tüm hücreleri toplamak protokollerini kullanarak sitotoksisitede değişiklikleri içine daha fazla araştırma (örn flow sitometri) ihtiyaç vardır.

Çalışmalarda bize MTT yöntemi başka bir sınırlamananopartiküller ing nanopartiküller bazı türleri, hücresel beslenme engel olabilir olmasıdır. Hücre kültürü ortamı, tipik olarak, hücre büyümesini desteklemek için örneğin fetal sığır serumu (FBS) olarak ilave protein kaynakları, ihtiva etmektedir. Çalışmalar metal oksit nano partıkuler bağlı nanopartiküllerin yüksek emme kapasitesine, FBS içinde önemli bir büyüme bileşenleri tüketebilir göstermiştir. Metal oksit nanopartiküllerinin kalsiyum 41 ile etkileşim yoluyla FBS bağlamak için gösterilmiştir. Çözeltinin pH'ına bağlı olarak, metal nanopartiküller, pozitif veya negatif bir yük taşıyabilir. Sitotoksisite çalışmaları ortam Ca + 2 de dahil olmak üzere, katyonlar yüzerildiği metal nanopartiküller hücre kültürüne ilave gösterilen ve daha sonra FBS içinde proteinler ile ilgili bağlanma yerleri kalsiyum NP-Ca 2 + kompleksinin bağlanması ile FBS / serum albümini kaldırma var. Bu temelde hücreleri açlıktan ve na atfedilen sitotoksisite artan medya Ca 2+ ve FBS konsantrasyonunu azaltır41 noparticles. Ayrıca, FBS / Ca 2+ ile nanopartiküllerin öncesi maruz sitotoksik etkisini azaltarak, nanopartiküller kaplı. Ancak, doğrudan CuO-NPS medya maruz vermedi. Ayrıca, onları emişli CuO-NPS üzerine Ca 2+ anlamlı emilimini belirten 2+ konsantrasyonları CuO-NPS ile tedaviden sonra PBW görüldü Ca anlamlı azalma, FBS ile bağlamak için. Ancak, pbw kalsiyum konsantrasyonu nanoparçacık kaynaklı düşüş belirgin olmayabilir yeterince yüksektir. Bu başlarında çalışmalara kıyasla yüksek kalsiyum düzeylerini içeren pbw CuO-NPlerin, arsenik emme yetenekleri bir azalma yoktu çünkü bu çalışmada kullanılan CuO-NPS, işleme sırasında kalsiyum büyük miktarda emici olduğu hala düşüktür düşük kalsiyum ile yeraltısuyu 13 konsantrasyonlar.

veri CuO-NPS arsenik, selenyum vanadyum ve URA kaldırmak olduğunu göstermektediruranyum ve bu MTT tahlilinde gelişmiş HEK ve HES hücre canlılığı ile ilişkilidir. canlılık artırıldı hangi mekanizma (lar) henüz belirlenmemiş olması gerekir, ancak diğer mekanizmalar arasında CuO-NP ile öncelikli kirleticiler kaldırılması, bağlı olabilir. Bu çalışma aynı zamanda standart hücre kültürü metotları daha pahalı ve zaman alıcı bir in vivo hayvan çalışmaları geçmeden önce, tamamlanmak üzere, potansiyel olarak mekanik çalışmalar, bir dizi izin veren bir nanopartikül ISR su ıslah yönteminin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir . Buna ek olarak, CuO-NPS CuO-NPS pH ayarlaması veya su oksidasyonunu gerekmez çünkü, madencilik süreçlerinde ve alüminyum, demir, titanyum ve manganez oksitleri gibi geleneksel Adsorbanların göre metal karışımlarının tedavisi için daha çok yönlü olabileceği Arsenik çıkarılması, ve CuO-NP silikat ve sülfat rekabet anyonlar fosfat varlığında, arsenit ve arsenat hem çıkarın. Ayrıca, CuO-NPS rejenere ve yeniden olabilir-kullanılmış, tepkin madde maliyetlerini ve bertaraf 12 ihtiyacı harcanan işleme atık yan ürünlerin payını azaltır.

MTT protokolünün Potansiyel sınırlamalar düşük hücre pozlama sırasında yoğunluğu, hücre dekolmanı ve sinyal kaybı, hücre açlık ve CuO-NP değiştiren MTT reaktivitesi hücrelerin olası doğrudan maruz bulunmaktadır. Hücre yoğunluğu ve sıyrılma sorunları bu gibi yüksek tohumlama yoğunlukları sağlayan akış sitometrisi, hem de bütün hücrelerin toplanması (yani, hem yüzen hem de ekli) gibi alternatif bir test ile ele alınabilir. Hücre açlık sorular periyodik tedavisinin ortamında büyüme faktörü konsantrasyonları ölçülerek değerlendirilebilir. Gelecekteki iş tedavi sırasında farklı sitotoksisite mümkün CuO-NP maruz değişmiş tahlil faaliyeti olmadığını hitap edecek deneyleri, hücre açlık ölçümleri mevcut protokol uygulayarak ve aynı zamanda contamina kaldırmak için CuO-NPS yeteneğini test üzerinde durulacakNTS ve Superfund siteleri ve atık havuzlarında atık olarak kompleks karışımların diğer türleri, sitotoksisitesini etkiler. Bu tür çalışmalar aynı zamanda yöntemler çeşitli ortamlarda sağlam olup olmadığını ele olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
  2. International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
  3. Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
  4. Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
  5. Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
  6. U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
  7. The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. , Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
  8. Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
  9. Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
  10. Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47 (12), 3931-3946 (2013).
  11. Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336 (2), 401-411 (2009).
  12. Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
  13. Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51 (1), 83-91 (2012).
  14. Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47 (12), 4022-4031 (2013).
  15. Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112 (10), 5073-5091 (2012).
  16. Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
  17. Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117 (8), 348-353 (2009).
  18. Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 139-162 (2010).
  19. Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). , Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
  20. Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63 (1), 132-142 (2001).
  21. Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254 (2), 154-166 (2011).
  22. Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. , University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
  23. Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
  24. Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220 (3), 292-301 (2007).
  25. Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21 (3), 343-354 (2007).
  26. Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
  27. Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
  28. Gustafsson, J. Visual MINTEQ. , Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
  29. Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 173-182 (2013).
  30. Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90 (9), 1387-1396 (2011).
  31. Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186 (1), 367-375 (2011).
  32. Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8 (9), 1-19 (2011).
  33. Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23 (7), 1365-1371 (2009).
  34. Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65 (23), 2029-2052 (2002).
  35. Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99 (4), 105-110 (2005).
  36. Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187 (1), 39-48 (2003).
  37. Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62 (5), 543-547 (2010).
  38. Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28 (6), 532-541 (2011).
  39. Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12 (1), 639-648 (2012).
  40. Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12 (10), 1161-1208 (2005).
  41. Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22 (3), 543-553 (2009).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 100 Enerji üretimi uranyum su dekontaminasyon nanopartiküller toksisite sitotoksisite,
Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması<em&gt; In Situ</em&gt; Kurtarma Bleed Su ve Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair,… More

Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., Clark, S. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter