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Bioengineering

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

Published: April 3, 2015 doi: 10.3791/52722
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

Summary

Este protocolo detalha um método para isolar vesículas extracelulares (SVE), pequenas partículas membranoso liberados a partir de células, a partir de tão pouco como 10 amostras de soro ul. Esta abordagem evita a necessidade de ultracentrifugação, exige apenas alguns minutos de tempo de ensaio, e permite o isolamento de VE a partir de amostras de volumes limitados.

Abstract

Vesículas extracelulares (SVE), partículas membranoso liberados a partir de vários tipos de células, realizar um grande potencial para aplicações clínicas. Eles contêm ácido nucleico e proteína de carga e são cada vez mais reconhecido como um meio de comunicação intercelular utilizado por ambos eucariota e células procarióticas. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho, os protocolos para o isolamento de veículos eléctricos são muitas vezes moroso, complicado e requer grandes volumes de amostra e equipamento caro, tal como uma ultracentrífuga. Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos uma plataforma de imunoafinidade baseado em papel para separar subgrupos de EVs que é fácil, eficiente e requer volumes de amostra tão baixas como 10 jul. As amostras biológicas podem ser pipetados directamente para zonas de teste de papel que tenham sido quimicamente modificados com moléculas de captura que têm uma afinidade elevada para marcadores de superfície específicos EV. Immunosorben ligado a enzima Nós validar o ensaio por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), com base em papelensaios t (P-ELISA), e análise de transcriptoma. Estes dispositivos baseados em papel permitirá o estudo de EVs na clínica e no ambiente de pesquisa para ajudar a avançar a nossa compreensão das funções EV na saúde e na doença.

Protocol

Um diagrama geral do procedimento de operação é fornecida na Figura 1. Usando as práticas éticas, foram coletadas amostras de sangue de indivíduos saudáveis, e obteve amostras de humor aquoso de pacientes através do Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sob IRB aprovou protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. fabricação de dispositivos de papel

  1. Cortar papel de cromatografia em círculos de 5 mm de diâmetro para fornecer o mesmo layout como uma microplaca de 96 poços. Sanduíche estas peças de papel com duas folhas de poliestireno com registada furos de passagem, e laminado.
  2. Modificar dispositivos de papel, utilizando o método de conjugação química descrita nas etapas seguintes 28.
    1. Tratar de papel com dispositivos de plasma de oxigénio (100 mW, 1% de oxigénio, 30 seg) em uma câmara de plasma.
      ATENÇÃO: cuidado especial deve ser tomado quando se trabalha com trimetoxissilano 3-mercaptopropil e N -γ-maleimidobutiriloxi suecinimidaéster (GMBS), uma vez que ambos são sensíveis à humidade e tóxico. Usar luvas de protecção e evitar a inalação ou contato com a pele e os olhos. Mantenha o frasco bem fechado estoque e permitir que atinjam a temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação de água. Como alternativa, abra a garrafa de dentro de um saco de luva cheia de azoto ou caixa. Alíquota em pequenos frascos para evitar a abertura freqüente da garrafa estoque.
    2. Imediatamente incubar tratada dispositivos de papel em um (v / v) solução de 4% de 3-mercaptopropil trimetoxi silano, em etanol (200 proof) durante 30 min.
    3. Lavar dispositivos de papel com etanol e incubar com 0,01 umol / ml GMBS em etanol durante 15 min.
    4. Lavar com etanol (200 proof) e incubar dispositivos de papel com 10 ug / ml de avidina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 hora a 4 ° C. Armazenar a 4 ° C, se necessário, e usar dentro de 4 semanas.
  3. Molhar cada zona de ensaio de papel com 10 ul de PBS contendo 1% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) Por 3 × 10 min antes de manchar 10 jul biotinilado moléculas de captura por 3 × 10 min. Utilizam anti-CD63 anticorpo (20 ug / ml em PBS contendo 1% (w / v) de BSA e 0,09% (w / v) de azida de sódio) ou anexina V (1:20, v / v em tampão de ligação da anexina V) como moléculas de captura.
  4. Enxaguar anticorpo ou anexina V moléculas anti-CD63 não ligados utilizando 10 ul correspondente PBS contendo 1% (w / v) de BSA ou anexina V soluções tampão de ligação para 3 x 1 min, respectivamente.

2. Serum e Aqueous Humor Coleta e Processamento

  1. Recolha de soro.
    1. Colete 10 ml de sangue periférico por punção venosa em tubos de separação de soro e inverter cuidadosamente o tubo de cinco vezes. Defina o tubo na posição vertical e aguarde 30 min.
    2. Centrifugar a 1.200 x g durante 15 min. Transferir o soro a partir da camada superior para um tubo limpo, e centrifuga-se novamente a 3000 × g durante 30 min.
    3. Passe o sobrenadante com um fil 0,8 mmter. Manter a amostra a -80 ° C até à sua utilização.
  2. Coleção humor aquoso: coletar amostras de humor aquoso de pacientes diagnosticados por um oftalmologista diretamente através de procedimentos e armazenar amostras invasiva a -80 ° C até o uso.

3. Isolamento de Extracelular Vesículas

  1. Amostras pontuais em cada zona de teste de papel a uma taxa de 5 mL / min.
  2. Enxaguar os VE não ligados com 10 ul correspondentes PBS contendo 1% (w / v) BSA a ligação de anexina V ou soluções tampão para 3 x 1 min para dispositivos papel funcionalizados com anti-CD63 ou anticorpos anexina V moléculas, respectivamente. Execute as seguintes ensaios a jusante.

4. jusante Ensaio Exemplo 1: eletromicrografias de digitalização

  1. Corrigir EVs capturadas em funcionalizado zona de teste de papel utilizando 10 mL de 0,5 × fixador de Karnovsky para 10 min.
  2. Lavar as amostras com amplo PBS por 2 × 5 min.
  3. Desidratar oamostras com subsequente etanol 35% durante 10 min, de etanol a 50% durante 2 x 10 min, etanol a 70% durante 2 x 10 min, etanol a 95% durante 2 × 10 minutos, e 100% de etanol durante 4 x 10 min.
  4. Critical seco e por pulverização catódica revestir as amostras com paládio / ouro, e examinar utilizando um microscópio eletrônico de varredura operado em baixa tensão de aceleração de elétrons (~ 5 kV).

5. Downstream Ensaio Exemplo 2: ELISA baseado no Livro

  1. Adicionar uma solução contendo 5 uL de anti-CD9 anticorpo primário a 1: 1000 em PBS a cada zona de ensaio contendo VE capturados. Espere 1 min.
  2. Lavar as amostras com 30 ml de PBS foram agitados a 100 rpm durante 30 segundos.
  3. Adicionar 5 uL de uma solução contendo peroxidase de rábano (HRP) -ligada anticorpo secundário em 1: 1000 em PBS e esperar 1 min.
  4. Lavar as amostras com 30 ml de PBS foram agitados a 100 rpm durante 30 segundos.
  5. Adicionar um substrato colorimétrico 5 ul contendo 1: 1 razão em volume de peróxido de hidrogénio umad 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e digitalizar utilizando um scanner de mesa.

6. Ensaio jusante Exemplo 3: Isolamento de ARN

  1. Mergulhar as amostras em 35 uL de auxílio de isolamento de ARN baseada em polivinilpirrolidona e 265 ul de lise / tampão de ligação para lisar os VE capturados. Vortex vigorosamente.
  2. Adicionar 30 ul de homogenato fornecido no kit de isolamento ao lisado. Vortex vigorosamente e colocar em gelo durante 10 min.
  3. Extrai-se o ARN utilizando a separação do ácido fenol-clorofórmio descrito nas etapas seguintes.
    1. Tome 330 ul de fenol-clorofórmio a partir da camada do fundo do frasco e adiciona-se ao homogeneizado / lisado. Vortex vigorosamente.
    2. Centrifuga-se a 10000 xg durante 5 min. Transferir a fase aquosa (superior) para um tubo limpo e anotar o volume removido.
  4. Precipitar o ARN total com etanol a 100% do volume que é 1,25 vezes o volume da fase aquosa removida na etapa anterior e collect o ARN na solução de eluição pré-aquecido a 95 ° C.
  5. Concentrar e purificar o ARN utilizando um kit de limpeza de ARN de acordo com o protocolo do fabricante.

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Representative Results

A capacidade do dispositivo de papel para isolar subconjuntos de veículos eléctricos assenta de forma eficiente mediante o reconhecimento sensível e específico de marcadores de superfície EV. A modificação das fibras de papel estável com moléculas de captura é conseguido usando a química da avidina-biotina, conforme descrito noutro local 28-30. A eficácia de conjugação química e que o método de fisiossorção é avaliada utilizando leituras baseados em fluorescência. As zonas de teste de papel são preparados seguindo o protocolo etapa 1), excepto a molécula de captura é substituído com moléculas de biotina 20 ng / ml fluoróforo-R-ficoeritrina (PE conjugado com biotina) na etapa 1.3. As zonas de teste de papel são então lavados com PBS para remover moléculas PE-biotina não ligada. Em contraste, 10 ul de 20 ug / mL de PE-biotina em PBS contendo 1% (w / v) de BSA e 0,09% (w / v) de azida de sódio é manchado directamente sobre a zona de teste para o papel de 3 × 10 min, seguido de PBS enxágüe para a realização da fisisorção de moléculas de corante PE-biotina. Quimicamentedispositivos de papel modificados ("paper + crosslinker + corante"), juntamente com dispositivos de papel não transformados ("papel"), os dispositivos de papel modificados com o mesmo protocolo, sem a aplicação de moléculas PE-biotina ("Livro + crosslinker") e os dispositivos de papel com physisorbed moléculas de biotina-PE ("physisorbed-dye") são digitalizados usando um sistema de imagem de registro definido para 540-560 nm de excitação, 575-long-pass nm de emissão, e os dados são salvos na forma de arquivos de 16 bits e analisados utilizando o software ImageJ. Como mostrado na Figura 2A, a intensidade de fluorescência das zonas de teste preparados pelo método de conjugação química é substancialmente mais elevada, em comparação com zonas de teste de papel revestidos fisicamente (valor de p <0,0005, n = 5, teste t de Student). A captura de VE também é específico, tal como exemplificado na Figura 2B, C, onde alguns veículos eléctricos são retidos no dispositivo de papel, quando as moléculas de captura são substituídos por solução PBS.

EVs são heterogêneas em sizes, conteúdos específicos e rotas biogênese. Para ligá-los, os dispositivos de papel revestido com duas moléculas de captura EV diferentes, anticorpos anti-CD63 e anexina V, foram preparados. CD63, um membro da família tetraspaninas (que inclui moléculas CD9, CD63, CD81 e CD82) é enriquecido em membrana EV 31, e anexina V tem uma forte afinidade para a fosfatidilserina (PS) 32,33. Verificou-se que os VE são libertados de forma constitutiva durante a apoptose precoce ou sob condições de stress, em que o processo celular normal assimetria fosfolípido é perdida, conduzindo a um aumento da exposição de PS no folheto exterior da membrana EV. As análises das imagens SEM mostram que a distribuições de tamanho de CD63 + VE e PS + VE são diferentes, com diâmetros médios de 80 e 43 nm, respectivamente (Figura 3) .A bicaudal teste t de Student é utilizado para determinar o valor de p estatística (valor de p <0,0001). Surpreendentemente, CD63 + EVs aparecer mais redondo e maior do que PS + EVs, em média, o que biológicosignificado ainda não foi esclarecido.

RNA de VE capturadas no dispositivo de papel pode ser extraída. Uma análise com um Bioanalyzer mostrou perfis gerais semelhantes para ARN totais extraídos a partir de CD63 + e PS + EV (Figura 4A). Em comparação com as quantidades de RNA extraídos utilizando as técnicas microfluídicos e ultracentrifugação, respectivamente cerca de duas vezes e 39 vezes mais RNAs por unidade de volume de amostra de soro foram extraídos utilizando o dispositivo de papel, embora com um volume de amostra menor (Tabela 1). P-ELISA pode ser levada a cabo para a detecção de veículos eléctricos. Anti-CD9 anticorpo primário e anticorpo secundário conjugado com HRP são usadas neste estudo. A Figura 4B mostra mudanças de valor de cinza produzida pela reacção enzimática de HRP para dispositivos de papel aplicados com 10 ul de PBS, 50% de soro (diluído com PBS), ou 100 % de soro, respectivamente. O valor de cinza aumenta linearmente dentro da gama de amostras de soro testadas.

por exemplo, ultracentrifugação, para ser usado. EVs de humor aquoso paciente isolado com dispositivos de papel revestido com anticorpos anti-CD63 pode ser visto em imagens de MEV como mostrado na Figura 5.

Figura 1
Figura 1. O processo de fabricação e operação dos ensaios à base de papel que visam o isolamento e caracterização de vesículas extracelulares. (A) Filtro de papel é cortada na forma desejada e laminadas. (B) A superfície do papel é modificado com um breve tratamento de plasma de oxigénio e feito reagir com 3-mercaptopropil trimetoxi silano, N </ Em> -γ maleimidobutiriloxi-succinimida, e NeutrAvidin, nessa ordem. Moléculas de captura biotinilada, por exemplo, anticorpos, pode então ser imobilizado por via do forte afinidade entre biotina e moléculas neutravidina. (C) pode ser Biosamples pipeta para o dispositivo de papel funcionalizado. Vesículas extracelulares podem ser isolados. (D) ensaios a jusante, como o SEM, transcriptoma, e ELISA (mostrado), pode ser realizada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. vesículas extracelulares (SVE) pode ser capturado em dispositivos papel funcionalizados com boa especificidade e sensibilidade. (A) moléculas de biotina marcadas por fluorescência são altamente imobilizado sobre o papeldispositivo via processo de conjugação química ("paper + crosslinker + corante") em contraste com a adsorção física ("-dye physisorbed"). Papel não transformados ("papel") e moléculas de conjugação ("Livro + reticulação") pouco contribuem para a intensidade de fluorescência. A imagem SEM representativo mostrando alguns EV (B) são capturadas no dispositivo de papel não-especificamente quando as moléculas de captura é substituído por PBS contendo 1% (w / v) de BSA. (C) Muitas EVs são mantidos em dispositivos de papel revestido com anticorpos anti-CD63. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3-mercaptopropil
Figura 3. Os subgrupos de vesículas extracelulares (SVE) podem ter diferentes distribuições de tamanho de (A).e (B) são representativos de imagens de SEM de VE capturados em dispositivos de papel revestidos com anticorpos anti-CD63 e as moléculas de anexina V, respectivamente. (C) CD63 + EVs parecer maior do PS + EVs em condições experimentais utilizadas neste estudo (p <0,0001, n = 124 e 203, o teste t de Student). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. A jusante do transcriptoma e ensaios de ELISA (A). Bioanalyzer dados que mostram as intensidades (eixo y, em unidades arbitrárias) e tamanho (eixo-x, em nucleótidos (nt)) distribuições de ARN total fluorescentemente marcado extraídos do VE capturados em anti-CD63 por anticorpos ou anexina V-revestidos papéis de filtro. O pico que migrava a ~ 25 representa nt um padrão interno. (B) de valores cinzentos alterações produzidas pela reacção enzimática da peroxidase de rábano (HRP) no ensaio P-ELISA para dispositivos de papel aplicada com amostras de 10 ul de PBS, 50% de soro (diluído com PBS) e amostras de 100% de soro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. vesículas extracelulares (SVE) em amostras de humor aquoso pode ser capturado em papel de filtro funcionalizado sem amostra pooling. MEV de isolado CD63 + EVs em amostras de humor aquoso de pacientes com (A) degeneração macular relacionada com a idade, (B) macular diabético edema, e (C) vasculopatia coroidal polipoidal, respectivamente.carga / 52722 / "target =" _ 52722fig5highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

método de isolamento molécula de captura soro vol. (L) RNA média extraída (ng) média extraído RNA / soro
(Pg / mL) 		proporção de média RNA / soro ref
Dispositivo de microfluidos CD63 anti-humano 400 4.14 10.4 20 20
dispositivo de papel CD63 anti-humano 72 1,49 ± 0,08 20.7 39 22
dispositivo de papel anexina V 72 0,99 ± 0,26 13.8 26 22
ultracentrifugação - 2.000 1,06 ± 0,64 0,53 1
soro - 72 1,23 ± 0,58 17 32 22

Tabela 1. O ARN total extraído de amostras de soro provenientes de voluntários saudáveis, com um Bioanalyzer analisados ​​(n = 4 para todas as condições).

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Discussion

Os passos mais críticos para o isolamento bem sucedido de subgrupos de vesículas extracelulares são: 1) uma boa escolha de papel; 2) uma cobertura estável e elevada de moléculas de captura na superfície das fibras de papel; 3) manuseio adequado de amostras; e 4) práticas de higiene geral de laboratório.

Os materiais porosos têm sido utilizados em muitos ensaios de baixo custo e sem equipamento. Eles podem ter o tamanho de poro sintonizável, funcionalidade versátil, baixo custo e alta relação superfície-volume permitindo a absorção passiva de fluidos. Nós escolhemos cromatografia de celulose de papel grau 1, principalmente, para o seu tamanho de poro adequada e baixa adsorção de proteínas. Comparado a outros materiais porosos comumente usados, de nitrocelulose, papel celulose tem adsorção muito menor inespecífica proteína 34. Nós também achamos pouco captura inespecífica de EVs neste estudo. Além disso, o nível de retenção de partículas, 11 mm, é maior do que o tamanho do VE 35, permitindo a captura específica emcontrastam ao aprisionamento físico de EVs. Aqui, vamos nos concentrar em EVs de um tamanho menor, passando amostras de soro através de um filtro de 0,8 mm, o que passo pode ser modificado quando EVs maiores estão a ser estudado.

Modificação química da superfície pode ser a chave para obter uma cobertura estável e elevada de moléculas de captura na superfície como um meio de melhorar a eficiência do isolamento EV. Modificações de superfície de celulose foram revistas 36,37. Há grandes números de hidroxilo (-OH) grupos na superfície de celulose e eles podem reagir com silano para dar químicas estáveis ​​ligações Si-OC depois de ter sido activado com plasma de oxigénio ou outro processo de condensação. O silano utilizado neste estudo é (3-mercaptopropil) trimetoxisilano, (MeO) 3Si- (CH2) 3-SH. O (-SH) de tiol pode reagir com GMBS para fornecer um braço curto espaço (0,73 nm) e um grupo de reticulação que casais com aminas primárias. Moléculas de captura com grupos amina pode ser conjugadopara GMBS directamente. Neste estudo, no entanto, que conjugado NeutrAvidin em vez de fornecer um esquema geral de conjugar várias moléculas de captura que são marcados com biotina. No entanto, o consenso sobre EV marcadores específicos de subtipo tem ainda de ser atingido 17. NeutrAvidin tem uma afinidade muito forte para a biotina e um ponto isoeléctrico próximo de neutro (pH 6,3), minimizando as interacções não específicas com objectos carregados negativamente, por exemplo, a superfície de veículos eléctricos. Em contraste, a avidina com um ponto isoeléctrico de 10,5 transporta cargas positivas a pH neutro. Uma concentração mais elevada de anticorpo anti-CD63 é utilizado do que em Chen et al. 20, principalmente devido ao pequeno volume e aplicadas a maior relação de superfície-para-volume do dispositivo de papel. No entanto, a quantidade e composições de proteínas adsorvidas sobre as fibras de papel não têm sido caracterizados, que pode ser dependente da amostra. Por isso, é preciso ter cuidado na interpretação dos resultados de análise de proteínas.

Bi Collectedological amostras devem ser manuseados com cuidado e processados ​​rapidamente para evitar artificialmente o aumento dos níveis de EV. Recomenda-se para remover células e plaquetas, se for o caso, antes do armazenamento a -80 ° C. A padronização atual de manipulação da amostra em pesquisa EV pode ser encontrado nesta revisão 17.

Práticas de higiene laboratório adequada deve ser empregada. Use sempre luvas e mudanças de luvas com freqüência para minimizar a introdução de partículas de poeira e ribonucleases. Isolamento de ARN a partir de VE em meio condicionado de cultura de células pode produzir mais de 70 vezes maiores concentrações de papel que utilizam dispositivos em comparação com o extraído VE concentrado usando o método de ultracentrífuga (não publicado).

O protocolo aqui descrito utiliza dispositivos de papel de celulose modificada quimicamente com moléculas de captura para isolar diferentes subgrupos de EVs. O método é simples, eficiente, e especialmente valioso quando o volume da amostra é limitada.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte pelo Conselho Nacional de Ciência Taiwan grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) e NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), e do Veterans General Hospitais e University System of Taiwan Programa Comum de Investigação (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

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References

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Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas
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Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

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