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Bioengineering

Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur extrazellulären Vesikeln (EVs), kleine membranöse Teilchen aus Zellen freigesetzt zu isolieren, von so wenig wie 10 ul Serumproben. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit von Ultrazentrifugation, nur wenige Minuten von Testzeit erfordert und ermöglicht die Isolation von Elektrofahrzeugen aus Proben von begrenzten Mengen.

Abstract

Extrazellulären Vesikeln (EVs), membranartige Partikel aus verschiedenen Arten von Zellen freigesetzt, halten ein großes Potenzial für die klinische Anwendung. Sie enthalten von Nukleinsäuren und Proteinen Ladung und werden zunehmend als Mittel zur interzellulären Kommunikation sowohl eukaryote und prokaryote Zellen verwendet erfasst. Aufgrund ihrer geringen Größe, aktuelle Protokolle zur Isolierung von Elektrofahrzeugen sind oft zeitaufwendig, umständlich und erfordert große Probenvolumina und teure Ausrüstung, wie zum Beispiel einer Ultrazentrifuge. Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir eine papierbasierte Immunaffinitäts Plattform zur Trennung von Untergruppen von Elektrofahrzeugen, die einfach, effizient ist und erfordert Probenvolumen von nur 10 & mgr; l. Biologische Proben können direkt auf Papier Testzonen, die chemisch mit Fängermolekülen, die eine hohe Affinität zu bestimmten EV Oberflächenmarker haben die modifiziert wurden, pipettiert werden. Wir bestätigen die Assays unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), auf Papierbasis enzymgebundenen immunosorbent-Tests (P-ELISA) und Transkriptom-Analyse. Diese Papier-basierte Geräte ermöglichen das Studium von Elektrofahrzeugen in der Klinik und der Forschung Einstellung zu helfen unser Verständnis von EV-Funktionen in Gesundheit und Krankheit.

Protocol

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Ein allgemeines Diagramm des Betriebs ist in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. Mit ethischen Praktiken, sammelten wir Blutproben von gesunden Probanden und erhalten Kammerwasser-Proben von Patienten durch die Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan unter IRB zugelassen Protokolle ( IRB TCVGH Nr CF11213-1).

1. Herstellung von Papier Material

  1. Geschnitten Chromatographiepapier in Kreise von 5 mm im Durchmesser, um das gleiche Layout wie einer 96-Well-Mikrotiterplatte ist. Sandwich diese Papierstücke mit zwei Polystyrolplatten mit einem Stammdurchgangslöchern, und Laminat.
  2. Ändern Papier Geräte mit dem in den folgenden Schritten 28 beschrieben chemische Konjugation Verfahren.
    1. Saures Papier Geräte mit Sauerstoffplasma (100 mW, 1% Sauerstoff, 30 sec) in einer Plasmakammer.
      ACHTUNG: Besondere Vorsicht ist bei der Arbeit mit 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan und N -γ-Maleimidobutyryloxy Succinimid genommen werden(GMBS), da sie sowohl feuchtigkeitsempfindlich und toxisch sind. Schutzhandschuhe und ein Einatmen zu vermeiden oder mit Haut und Augen zu kontaktieren. Halten Sie die Vorratsflasche fest verschlossen und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur vor dem Öffnen um eine Kondenswasserbildung zu vermeiden Gleichgewicht. Alternativ öffnen Sie die Vorratsflasche in einem mit Stickstoff gefüllten Handschuhbeutel oder Kasten. Aliquot in kleine Fläschchen häufiges Öffnen der Vorratsflasche zu vermeiden.
    2. Unmittelbar inkubieren behandelte Papier Vorrichtungen in einer 4% igen (v / v) Lösung von 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan in Ethanol (200 proof) für 30 min.
    3. Papier Geräte Spülen mit Ethanol und Inkubation sie mit 0,01 mmol / ml GMBS in Ethanol für 15 min.
    4. Spülen mit Ethanol (200 proof) und inkubieren Papier Vorrichtungen mit 10 ug / ml Avidin-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 1 h bei 4 ° C. Lagerung bei 4 ° C, wenn nötig, und innerhalb von 4 Wochen.
  3. Befeuchten jeder Papiertestzonen mit 10 ul PBS, enthaltend 1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) Für 3 x 10 min vor Spek 10 ul biotinylierten Fängermoleküle für 3 x 10 min. Verwenden anti CD63-Antikörper (20 ug / ml in PBS, das 1% (w / v) BSA und 0,09% (w / v) Natriumazid) oder Annexin V (1:20, v / v in Annexin V-Bindungspuffer), wie Fängermoleküle.
  4. Abspülen ungebundenen anti-CD63-Antikörper oder Annexin V-Moleküle unter Verwendung von 10 & mgr; l entspricht, PBS, das 1% (w / v) BSA oder Annexin V-Bindungspuffer Lösungen für 3 × 1 min auf.

2. Serum und Kammerwasser Probenerhebung und Datenverarbeitung

  1. Serumgewinnung.
    1. Sammeln Sie 10 ml peripheren Blut durch Venenpunktion in Serumtrennröhrchen und sanft das Röhrchen fünfmal. Stellen Sie die Röhre in einer vertikalen Position und für weitere 30 min.
    2. Zentrifuge bei 1200 × g für 15 min. Das Serum von der oberen Schicht in ein sauberes Röhrchen, und erneut zentrifugieren bei 3.000 × g für 30 min.
    3. Übergeben Sie den Überstand durch ein 0,8 um filter. Halten Sie die Probe bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Kammerwasser Kollektion: sammeln Kammerwasser-Proben von Patienten durch einen Augenarzt direkt durch invasive Verfahren und Lagerung von Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung diagnostiziert.

3. Isolierung der extrazellulären Vesikeln

  1. Stichproben auf jeder Papiertestzone mit einer Geschwindigkeit von 5 ul / min.
  2. Abspülen ungebundenen EVs mit 10 ul entsprechenden PBS, das 1% (w / v) BSA oder Annexin V-Bindungspuffer Lösungen für 3 × 1 min für die Papiervorrichtungen funktionalisiert mit Anti-CD63-Antikörper oder Annexin V-Moleküle sind. Führen Sie die folgenden Downstream-Assays.

4. Downstream Testbeispiel 1: Scanning Electromicrographs

  1. Fix EVs auf funktionalisierten Papiertestzone mit 10 ul 0,5 x Karnovsky Fixativ für 10 Minuten eingefangen.
  2. Spülen Sie die Proben mit ausreichend PBS für 2 x 5 min.
  3. Entwässern derProben mit anschließender 35% Ethanol für 10 min, 50% Ethanol für 2 × 10 min, 70% Ethanol für 2 x 10 min, 95% Ethanol für 2 × 10 min und 100% Ethanol für 4 x 10 min.
  4. Critical trocken und Sputter-Beschichtung der Proben mit Palladium / Gold und untersuchen mit einem Rasterelektronenmikroskop bei geringer Elektronenbeschleunigungsspannung betrieben (~ 5 kV).

5. Downstream Testbeispiel 2: Papier-basierten ELISA

  1. Fügen Sie ein 5 ul-Lösung, die Anti-CD9 primären Antikörper bei 1: 1000 Verdünnung in PBS zu jeder Testzone, die gefangen genommen EVs. Warten Sie 1 Minute.
  2. Mit 30 Spülen Sie die Proben ml PBS bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden geschüttelt.
  3. Hinzufügen einer 5 & mgr; l Lösung, die Meerrettich-Peroxidase (HRP) -verknüpften-sekundären Antikörper bei 1: 1000 Verdünnung in PBS und 1 min warten.
  4. Mit 30 Spülen Sie die Proben ml PBS bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden geschüttelt.
  5. Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats 5 ul, das 1: 1-Volumenverhältnis von Wasserstoffperoxid eind 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und scannen Sie mit einem Desktop-Scanner.

6. Nachgeschaltete Testbeispiel 3: RNA-Isolierung

  1. Tauchen Sie die Proben in 35 ul von Polyvinylpyrrolidon-basierte RNA-Isolierung Hilfe und 265 ul Lyse / Bindungspuffer auf EVs erfasst lysieren. Vortex kräftig.
  2. In 30 ul Homogenat bei der Isolation Kit zum Lysat zur Verfügung gestellt. Vortex kräftig und auf Eis für 10 Minuten gestellt.
  3. Extrahieren der RNA unter Verwendung von Säure in den folgenden Schritten beschrieben, mit Phenol-Chloroform-Trennung.
    1. Nehmen 330 ul Phenol-Chloroform von der Bodenschicht der Flasche und in den Homogenats / Lysat. Vortex kräftig.
    2. Zentrifugieren bei 10000 × g für 5 min. Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase in ein sauberes Röhrchen und das Volumen entfernt.
  4. Fällt die Gesamt-RNA mit 100% Ethanol das Volumen, das 1,25-fache des Volumens der wäßrigen Phase in der vorhergehenden Stufe und co entfernt istllect die RNA in der Elutionslösung auf 95 ° C vorgewärmt.
  5. Eine Konzentration und weiteren Reinigung der RNA unter Verwendung eines RNA-Cleanup Kit nach dem Protokoll des Herstellers.

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Representative Results

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Die Fähigkeit des Papiers Gerät Gruppen von EVs isolieren stützt effizient auf seine empfindliche und spezifische Erkennung von EV-Oberflächenmarker. Die stabile Modifikation von Papierfasern mit Fängermolekülen wird durch die Verwendung von Avidin-Biotin-Chemie als anderswo 28-30 beschrieben ist. Die Wirksamkeit der chemischen Konjugation, und dass der Physisorption Verfahren unter Anwendung der fluoreszenzbasierten Auslesungen beurteilt. Die Papier Prüfzonen folgenden Protokoll Schritt 1) ​​mit Ausnahme der Fangmolekül wird mit 20 ug / ml Fluorophor R-Phycoerythrin-konjugierten Biotinmolekülen (PE-Biotin) in Schritt 1.3 ersetzt wurde. Die Papiertestzonen werden dann mit PBS gespült, um ungebundene PE-Biotin-Moleküle zu entfernen. Im Gegensatz dazu 10 ul 20 ug / ml PE-Biotin in PBS, das 1% (w / v) BSA und 0,09% (w / v) Natriumazid wird direkt auf das Papier der Testzone für 3 x 10 min gesichtet, gefolgt von PBS Spülen für die Durchführung der Physisorption von PE-Biotin-Farbstoffmoleküle. Chemischmodifizierten Papier-Geräte ("paper + Vernetzer + Farbstoff") zusammen mit unverarbeiteten Papier Geräte ("Papier"), Papier-Geräte mit dem gleichen Protokoll ohne die Anwendung von PE-Biotin-Moleküle ("paper + Vernetzer") und Papier Geräte mit physisorbierte geändert PE-Biotin-Moleküle ("physisorbierte-dye") werden mit einer Bildaufzeichnungssystem, um 540 bis 560 nm Anregung gesetzt gescannt, 575 nm-Langpass Emission, und die Daten werden in Form von 16-Bit-Dateien gespeichert und analysiert mit ImageJ Software. Wie in 2A gezeigt, ist die Fluoreszenzintensität des Testzonen durch die chemische Konjugationsverfahren hergestellt wesentlich höher im Vergleich zu physikalisch beschichteten Papiertestzonen (p-Wert <0,0005, n = 5, t-Test). Die Erfassung von Elektrofahrzeugen ist auch spezifisch wie in 2B, C, wo nur wenige Elektrofahrzeuge sind auf dem Papier-Gerät erhalten, wenn die Fängermoleküle durch PBS-Lösung ersetzt, veranschaulicht.

EVs sind heterogen in sizes, bestimmte Inhalte und Biogenese Routen. Um sie zu binden, Papier-Geräte mit zwei verschiedenen EV Fängermoleküle, Anti-CD63-Antikörper und Annexin V beschichtet, hergestellt. CD63, ein Mitglied der Familie Tetraspanin (das CD9, CD63, CD81 und CD82-Moleküle enthält) auf EV Membran 31 angereichert und Annexin V hat eine starke Affinität für Phosphatidylserin (PS) 32,33. Es wird festgestellt, dass EVs konstitutiv in der frühen Apoptose oder unter Stressbedingungen freigesetzt wird, in welchem ​​Verfahren die normale Zell-Asymmetrie ist verloren, was zu einer erhöhten Exposition von PS auf dem äußeren Blatt der EV Membran. Die Analyse der REM-Aufnahmen zeigen, dass die Größenverteilungen der CD63 + EVs und PS + EVs sind unterschiedlich, mit mittleren Durchmessern von 80 und 43 nm (Abbildung 3) .Die zweiseitigen Student-t-Test wird verwendet, um die statistische p-Wert zu bestimmen (p-Wert <0,0001). Überraschenderweise scheint CD63 + EVs runder und größer als PS + EVs im Durchschnitt, die biologischenBedeutung ist noch nicht geklärt.

RNA von EVs auf der Papiervorrichtung erfasst extrahiert werden können. Analysen mit einem Bioanalyzer zeigten ähnliche Gesamtprofile für Gesamt-RNAs aus CD63 + und PS + EVs (4A) extrahiert. Im Vergleich zu den Mengen an RNA extrahiert unter Verwendung der mikrofluidischen und Ultrazentrifugation Techniken jeweils etwa doppelt bis 39-mal mehr RNA pro Volumeneinheit der Serumprobe wurden extrahiert unter Verwendung der Papiervorrichtung, wenn auch mit einer kleineren Probenvolumen (Tabelle 1). P-ELISA kann für den Nachweis von EVs erfolgen. Anti-CD9 primärer Antikörper und HRP-konjugiertem Sekundärantikörper sind in dieser Studie 100 verwendet. 4B zeigt graue durch die enzymatische Reaktion der HRP für Papier Vorrichtungen mit 10 ul PBS, 50% Serum angewendet hergestellten Wertänderungen (verdünnt mit PBS), oder % Serum auf. Der Grauwert linear zunimmt im Bereich von Serumproben getestet.

Isolationsverfahren, beispielsweise Ultrazentrifugation verwendet werden sollen. EVs von Patient Kammerproben mit Papier Geräte mit anti-CD63-Antikörper können in REM-Aufnahmen zu sehen ist beschichtet isoliert, wie in Figur 5 gezeigt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Herstellung und der Betrieb Verfahren der Papier-basierten Assays bei Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln ab. (A) Filterpapier wird in die gewünschte Form geschnitten und laminiert. (B) Die Oberfläche des Papiers mit einer kurzen Behandlung von Sauerstoffplasma modifiziert und umgesetzt mit 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan, N </ Em> -γ-Maleimidobutyryloxy succinimidester und NeutrAvidin, in dieser Reihenfolge. Biotinyliert Einfangmoleküle, zB Antikörper, können dann über die starke Affinität zwischen Biotin und NeutrAvidin Moleküle immobilisiert werden. (C) Bioproben können Pipette auf dem funktionalisierten Papier-Gerät sein. Extrazelluläre Vesikel isoliert werden. (D) Downstream-Assays, wie SEM, Transkriptom und ELISA (dargestellt), durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die extrazelluläre Vesikel (EVs) auf funktionalisierten Papier Geräte mit guter Spezifität und Empfindlichkeit erfasst werden. (A) Fluoreszenz-markierte Biotin-Moleküle sind stark auf das Papier immobilisiertGerät über chemische Konjugation Prozess ("paper + Vernetzer + Farbstoff") im Gegensatz zur physikalischen Adsorption ("physisorbierte-dye"). Unverarbeitete Papier ("Papier") und Konjugation Moleküle ("paper + Vernetzer") tragen wenig zu der Fluoreszenzintensität. (B) Eine repräsentative SEM-Bild zeigt einige EVs sind auf der Papiervorrichtung unspezifisch erfasst, wenn die Fängermoleküle durch PBS, enthaltend 1% (w / v) BSA ersetzt. (C) Viele Elektrofahrzeuge sind auf dem Papier-Geräte mit Anti-CD63-Antikörpern beschichtet erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 3-Mercaptopropyl
Abbildung 3. Untergruppen der extrazellulären Vesikeln (EVs) können unterschiedliche Größenverteilungen haben. (A)und (B) sind repräsentative SEM-Bilder von EVs auf Papier Geräte mit anti-CD63-Antikörper und Annexin V-Moleküle zu beschichtenden erfasst. (C) CD63 + EVs größer als PS + EVs unter in dieser Studie verwendeten experimentellen Bedingungen erscheinen (p-Wert <0,0001, n = 124 und 203, t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Downstream Transkriptom und ELISA-Assays. (A) Bioanalyzer Daten, die die Intensitäten (y-Achse, in willkürlichen Einheiten) und Größe (x-Achse, die in den Nukleotiden (nt)) Verteilungen von fluoreszenzmarkierten Gesamt-RNA aus EVs extrahiert erfasst auf anti-CD63 Antikörper-oder Annexin V-beschichtet Filterpapiere. Die Migration von Peak bei ~ 25 nt repräsentiert ein interner Standard. (B) Grau durch die enzymatische Reaktion der Meerrettich-Peroxidase (HRP) in der P-ELISA-Assay für die Papiergeräte mit 10-ul-Proben von PBS, 50% Serum (verdünnt mit PBS) und 100% Serumproben aufgebracht hergestellt Wert ändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Die extrazelluläre Vesikel (EVs) in Kammerwasser kann mit Hilfe von funktionalisierten Filterpapier ohne Proben Pooling von Patienten mit (A) der altersbedingten Makuladegeneration, (B) diabetischen Makula erfasst werden. REM-Aufnahmen von isolierten CD63 + EVs in Kammerwasser Proben Ödem, und (C) polypoidal choroidalen Vaskulopathie sind.Last / 52.722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Isolierungsverfahren Fängermolekül Serum vol. (Ul) durchschnittliche RNA extrahiert (ng) durchschnittliche extrahierten RNA / Serum
(Pg / ul)
Verhältnis der durchschnittlichen RNA / Serum ref
Mikrofluidikvorrichtung Anti-Mensch-CD63 400 4.14 10.4 20 20
Papier-Gerät Anti-Mensch-CD63 72 1,49 ± 0,08 20,7 39 22
Papier-Gerät Annexin V 72 0,99 ± 0,26 13,8 26 22
Ultrazentrifugation - 2000 1,06 ± 0,64 0.53 1
Serum - 72 1,23 ± 0,58 17 32 22

Tabelle 1 Gesamt-RNA aus Seren von gesunden Freiwilligen extrahiert analysiert mit einem Bioanalyzer (n = 4 für alle Bedingungen).

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Discussion

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Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Isolierung von Untergruppen von extrazellulären Vesikeln sind: 1) eine gute Wahl des Papiers; 2) stabile und hohe Abdeckung der Fängermoleküle auf der Oberfläche der Papierfasern; 3) die richtige Handhabung der Proben; und 4) allgemeine Laborhygienemaßnahmen.

Poröse Materialien haben sich in vielen preiswerten und Ausrüstung freien Tests genutzt. Sie haben abstimmbare Porengrße, vielseitige Funktionalität, niedrige Kosten und hohe Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis ermöglicht passive Saugen von Flüssigkeiten. Wir haben uns für Chromatographie Zellulosepapier Grad 1 vor allem für seine richtige Porengröße und niedrige Proteinadsorption. Im Vergleich zu anderen häufig verwendeten porösen Materialien, Nitrozellulosepapier ist viel niedriger unspezifischer Proteinadsorption 34. Wir finden auch kleine unspezifische Erfassung von Elektrofahrzeugen in dieser Studie. Darüber hinaus ist seine Partikelretentionsausmaß, 11 & mgr; m, größer als die Größe des EVs 35, so dass für bestimmte Erfassungs inIm Gegensatz zu physikalischen Einfangen von Elektrofahrzeugen. Hier konzentrieren wir uns auf EVs einer kleineren Größe, indem Serumproben durch ein 0,8 um-Filter, der Schritt modifiziert werden können, wenn größere EVs untersucht werden sollen.

Chemische Oberflächenmodifizierung kann eine Taste, um eine stabile und hohe Abdeckung der Fängermoleküle auf der Oberfläche als ein Mittel zur Verbesserung der Effizienz der EV Isolation erzielen. Oberflächenmodifikationen von Cellulose überprüft wurden 36,37. Es gibt eine hohe Anzahl von Hydroxylgruppen (-OH) auf der Oberfläche der Cellulose, und sie mit Silan reagieren können, um stabile chemische Si-OC-Bindungen, nachdem es mit Sauerstoff-Plasma oder anderen Kondensationsprozess aktiviert geben. Das in dieser Studie verwendete Silan (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilan, (MeO) 3 Si- (CH 2) 3 -SH. Das Thiol (-SH) gruppe mit GMBS reagieren, um einen kurzen Arm (0,73 nm) und ein Vernetzungsgruppe, die Paare mit primären Aminen werden. Fängermoleküle mit Amingruppen konjugiert werdendirekt GMBS. In dieser Studie ist jedoch konjugiert wir NeutrAvidin stattdessen ein allgemeines Schema verschiedene Fängermoleküle, die Biotin-markierte konjugierte bereitzustellen. Allerdings hat Konsens über EV-Subtyp-spezifischer Marker noch nicht erreicht 17 werden. NeutrAvidin hat eine sehr starke Affinität zu Biotin und einen fast neutralen isoelektrischen Punkt (pH 6,3), die Minimierung unspezifische Wechselwirkungen mit negativ geladenen Gegenständen, wie zB die Oberfläche von Elektrofahrzeugen. Demgegenüber Avidin mit einem isoelektrischen Punkt von 10,5 führt positiven Ladungen bei neutralem pH. Eine höhere Konzentration von Anti-CD63-Antikörper als die in Chen et al. 20 verwendet wird, vor allem aufgrund des geringen Volumens aufgetragen und die größere Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis der Papiervorrichtung. Jedoch ist die Menge und Zusammensetzung von Proteinen auf den Papierfasern adsorbiert wurden nicht charakterisiert worden, die Probe-abhängig sein kann. Daher ist darauf zu achten bei der Interpretation der Ergebnisse der Protein-Analyse entnommen werden.

Gesammelte bibiologischen Proben sollten vorsichtig gehandhabt und verarbeitet schnell auf artifactually erhöht EV Stufen zu verhindern. Es wird empfohlen, um Zellen und Thrombozyten bei -80 ° C zu entfernen, falls vorhanden, vor der Lagerung. Eine aktuelle Standardisierung der Probenhandhabung in EV Forschung in diesem Bericht 17 zu finden.

Proper Laborhygienepraxis sollten eingesetzt werden. Tragen Sie immer Handschuhe und Handschuhe wechseln häufig, um die Einführung von Staubpartikeln und Ribonukleasen zu minimieren. Isolierung von RNA aus EVs in Zellkultur konditionierte Medium kann mehr als 70-mal höhere Konzentrationen mittels Papier Geräte im Vergleich zu dem extrahierten von EVs mit der Ultrazentrifugenmethode (unveröffentlicht) konzentriert zu ergeben.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet Zellulosepapier Geräte chemisch modifiziert mit Fängermolekülen auf verschiedenen Untergruppen von Elektrofahrzeugen zu isolieren. Das Verfahren ist einfach, effizient und besonders wertvoll, wenn das Probenvolumen begrenzt.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Council Taiwan-Beihilfen NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) und NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), und der Veterans General unterstützt Krankenhäuser und Universitätssystem von Taiwan Joint Research Programme (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

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References

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Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel
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Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

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