Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד שלפוחית ​​תאית (EVS), חלקיקים קרומיים קטנים שוחררו מהתאים, מ קטן כמו 10 דגימות סרום μl. גישה זו עוקפת את הצורך בultracentrifugation, דורשת רק כמה דקות של זמן assay, ומאפשרת בידוד של כלי רכב חשמלי מדגימות של כרכים מוגבלים.

Abstract

שלפוחית ​​תאית (EVS), חלקיקים קרומיים שוחררו מסוגים שונים של תאים, להחזיק פוטנציאל גדול עבור יישומים קליניים. הם מכילים מטען חומצת גרעין וחלבונים ומוכרים יותר ויותר כאמצעי לתקשורת בין תאית מנוצלת על ידי שני eukaryote ותאי פרוקריוטים. עם זאת, בשל גודלם הקטן, פרוטוקולים הנוכחיים לבידוד של כלי רכב חשמליים הם בדרך כלל זמן רב, מסורבל, ודורשים כמויות גדולות מדגם וציוד יקר, כגון ultracentrifuge. כדי לתת מענה למגבלות אלה, שפיתחנו פלטפורמת immunoaffinity מבוססת נייר להפרדה תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים שהיא קל, יעיל, ודורש כרכי מדגם נמוכים כמו 10 μl. ניתן pipetted דגימות ביולוגיות ישירות על אזורי מבחן נייר ששונו כימי עם מולקולות ללכוד שיש לי זיקה גבוהה לסמני משטח EV ספציפיים. immunosorben צמוד אנזים אנו לאמת את assay באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), המבוסס על ניירמבחני t (P-ELISA), וניתוח transcriptome. מכשירים מבוססי נייר אלה יאפשר המחקר של כלי רכב חשמליים במרפאת והגדרת המחקר כדי לעזור לקדם את ההבנה של פונקציות EV בבריאות ובחוליים שלנו.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תרשים כללי של נוהל המבצע מסופק באיור 1. שימוש בשיטות אתיות, אספנו דגימות דם מנבדקים בריאים, ואספתי דגימות הומור מימיות מחולים דרך טאיצ'ונג ותיקי בית החולים הכללי (TCVGH), טאיצ'ונג, טייוואן תחת IRB אושר פרוטוקולים ( IRB TCVGH מס 'CF11213-1).

1. ייצור של מכשירי נייר

  1. לחתוך נייר כרומטוגרפיה לחוגים של 5 מ"מ קוטר לספק את אותה הפריסה כצלחת microtiter 96-היטב. כריך חתיכות הנייר האלה עם שני גיליונות קלקר עם, ורבד הרשום דרך החורים.
  2. לשנות מכשירי נייר תוך שימוש בשיטת נטיה הכימית שמתוארת בשלבים הבאים 28.
    1. פנק את מכשירי נייר עם פלזמה חמצן (100 mW, חמצן 1%, 30 שניות) בתא פלזמה.
      זהירות: יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת עבודה עם trimethoxysilane 3-mercaptopropyl ו- maleimidobutyryloxy -γ succinimide Nאסתר (GMBS), מאחר שהם שתי הלחות רגישה ורעילה. ללבוש כפפות מגן ולהימנע משאיפה או מגע עם עור ועיניים. שמור את מניית הבקבוק סגור היטב ולאפשר לו לאזן לRT לפני הפתיחה כדי למנוע התעבות מים. לחלופין, לפתוח את מניית הבקבוק בתוך שקית כפפה מלא חנקן או תיבה. Aliquot לתוך צלוחיות קטנות כדי להימנע מפתיחה תכופה של מניית הבקבוק.
    2. מייד דגירה טופל מכשירי נייר בכ 4% (v / v) פתרון של trimethoxysilane 3-mercaptopropyl באתנול (200 הוכחה) למשך 30 דקות.
    3. יש לשטוף את מכשירי נייר עם אתנול דגירה אותם עם 0.01 μmol / GMBS מיליליטר באתנול במשך 15 דקות.
    4. לשטוף עם אתנול (200 הוכחה) ודגירת מכשירי נייר עם 10 מיקרוגרם פתרון / מיליליטר avidin בופר פוספט (PBS) במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. חנות ב 4 ° C במידת הצורך, ולהשתמש תוך 4 שבועות.
  3. להרטיב כל אזורי מבחן נייר עם 10 μl PBS המכיל 1% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) עבור 3 × 10 דקות לפני תצפית 10 μl biotinylated מולקולות ללכוד עבור 3 × 10 דקות. השתמש נגד CD63 נוגדן (20 מיקרוגרם / מיליליטר PBS המכיל 1% (w / v) BSA ושל 0.09% (w / v) אזיד הנתרן) או V Annexin (1:20, v / v במאגר מחייב V Annexin) כ מולקולות ללכוד.
  4. לשטוף את מולקולות נוגדן או V Annexin אנטי CD63 מאוגד באמצעות 10 μl מקביל PBS המכיל 1% (w / v) BSA או Annexin V מחייב פתרונות חיץ במשך 3 × 1 דקות, בהתאמה.

אוסף דוגמאות 2. סרום ומימי הומור ועיבוד

  1. אוסף סרום.
    1. לאסוף 10 מיליליטר של דם היקפי על ידי venipuncture בצינורות הפרדת סרום ובעדינות להפוך את הצינור חמש פעמים. הגדר את הצינור במצב אנכי ולחכות 30 דקות.
    2. צנטריפוגה ב× גרם 1,200 במשך 15 דקות. העבר את הסרום מהשכבה העליונה לצינור נקי, ו צנטריפוגות שוב ב 3000 × גרם במשך 30 דקות.
    3. להעביר את supernatant דרך fil 0.8 מיקרומטרter. שמור את המדגם ב -80 ° C עד שימוש.
  2. אוסף המימי הומור: לאסוף דגימות הומור מימיות מחולים שאובחנו על ידי רופא עיניים ישירות דרך פולשנית נהלים ודגימות חנות ב -80 ° C עד שימוש.

3. בידוד של שלפוחית ​​התאית

  1. דגימות ספוט על כל אזור מבחן נייר בשיעור של 5 μl / min.
  2. לשטוף את המכוניות חשמליות מאוגד עם 10 μl המקביל PBS המכיל 1% (w / v) BSA או Annexin V מחייב פתרונות חיץ דקות 3 × 1 עבור התקני נייר פונקציונליות עם מולקולות נוגדן או V Annexin אנטי CD63, בהתאמה. לבצע את מבחני במורד הזרם הבאים.

4. 1 Downstream Assay דוגמא: Electromicrographs סריקה

  1. לתקן כלי רכב חשמליים שנתפסו על אזור בדיקת נייר פונקציונליות באמצעות 10 μl 0.5 × המקבע של Karnovsky במשך 10 דקות.
  2. יש לשטוף את הדגימות עם PBS בשפע עבור 2 × 5 דקות.
  3. מייבש אתדוגמאות עם אתנול 35% לאחר 10 דקות, אתנול 50% עבור 2 × 10 דקות, אתנול 70% עבור 2 × 10 דקות, אתנול 95% עבור 2 × 10 דקות, ו 100% אתנול במשך 4 × 10 דקות.
  4. קריטי יבש וגמגום מעיל הדגימות עם פלדיום / זהב, ולבחון באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פעל במתח האצת אלקטרונים נמוך (~ 5 קילו וולט).

5. Assay דוגמא 2 Downstream: ELISA מבוסס נייר

  1. הוסף פתרון 5 μl מכיל נוגדן ראשוני אנטי-CD9 ב 1: 1,000 דילול בPBS לכל אזור ניסיון שמכיל כלי רכב חשמליים שנתפסו. חכה דק '1.
  2. יש לשטוף את הדגימות עם 30 מיליליטר PBS מזועזע ב 100 סל"ד במשך 30 שניות.
  3. הוסף peroxidase חזרת תמיסה המכילה 5 μl (HRP) -linked נוגדנים משני בשעה 1: 1,000 דילול ב PBS ולחכות 1 דקות.
  4. יש לשטוף את הדגימות עם 30 מיליליטר PBS מזועזע ב 100 סל"ד במשך 30 שניות.
  5. הוסף מצע colorimetric 5 μl המכיל 1: יחס נפח 1 של מי חמצן3,3 ד ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) ולסרוק באמצעות סורק שולחני.

6. דוגמא Downstream Assay 3: בידוד RNA

  1. לטבול את הדגימות ב -35 μl סיוע בידוד RNA מבוסס polyvinylpyrrolidone וμl 265 של תמוגה / חיץ מחייב לlyse כלי רכב חשמלי שנתפסו. מערבולת במרץ.
  2. הוסף 30 homogenate μl המסופק בערכת הבידוד לlysate. וורטקס במרץ ולשים על קרח למשך 10 דקות.
  3. חלץ את RNA באמצעות הפרדת פנול, כלורופורם חומצה מתוארת בשלבים הבאים.
    1. קח 330 μl של פנול, כלורופורם מהשכבה התחתונה של הבקבוק ולהוסיף לhomogenate / lysate. מערבולת במרץ.
    2. צנטריפוגה XG ב 10,000 במשך 5 דקות. מעביר את השלב המימי (העליון) לצינור נקי ולב נפח סיר.
  4. לזרז את הרנ"א המוחלט עם אתנול 100% מההיקף שהוא 1.25 פעמים הנפח של השלב מימי הוסר בשלב הקודם ושיתוףllect RNA בפתרון elution שחומם מראש ל 95 מעלות צלזיוס.
  5. להתרכז ועוד לטהר RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA על פי הפרוטוקול של הייצור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

היכולת של מכשיר נייר לבודד את תת-קבוצות של כלי רכב חשמלי ביעילות מסתמכת על ההכרה שלה רגישה וספציפית של סמני משטח EV. השינוי היציב של סיבי נייר עם מולקולות ללכוד מושגת באמצעות הכימיה avidin ביוטין כפי שתואר במקומות אחרים 28-30. היעילות של נטיה הכימית ושל שיטת physisorption נבחנת באמצעות קריאות הקרינה מבוססת. אזורי מבחן נייר הוכנו לאחר צעד הפרוטוקול 1) פרט למולקולת הלכידה מוחלף במולקולות fluorophore 20 מיקרוגרם / מיליליטר R-Phycoerythrin מצומדות- ביוטין (PE-ביוטין) בשלב 1.3. אז אזורי מבחן נייר הם שטופים עם PBS להסיר מולקולות PE-יוטין מאוגד. בניגוד לכך, 10 μl 20 מיקרוגרם PE-יוטין / מיליליטר PBS המכיל 1% (w / v) BSA ושל 0.09% (w / v) אזיד הנתרן הוא הבחין ישירות על אזור בדיקת נייר למשך 3 × 10 דקות, ואחריו PBS לשטוף לביצוע physisorption של מולקולות צבע PE-ביוטין. כימימכשירי נייר שונה ("נייר + crosslinker + צבע"), יחד עם מכשירי נייר לא מעובדים ("נייר"), מכשירי נייר שונה עם אותו הפרוטוקול ללא היישום של מולקולות PE-ביוטין ("נייר + crosslinker") והתקני נייר עם physisorbed PE-יוטין מולקולות ("physisorbed-צבע") נסרקים באמצעות מערכת תמונה-שיא שנקבעה לעירור 540-560 ננומטר, פליטת 575 nm-ארוך לעבור, והנתונים נשמר בצורה של קבצים של 16 סיביות ונותח באמצעות תוכנת ImageJ. כפי שניתן לראות באיור 2 א, עוצמת הקרינה של אזורי מבחן שהוכנו על ידי שיטת נטיה הכימית היא גבוהה באופן משמעותי, בהשוואה לאזורי מבחן נייר מצופה פיזי (p-value <0.0005, n = 5, מבחן t). לכידה של כלי רכב חשמלי היא גם ספציפית כפי שהודגם באיור 2, C, שבו כמה מכוניות חשמליות נשמרות במכשיר הנייר כאשר המולקולות הלכידה יוחלפו על ידי פתרון PBS.

כלי רכב חשמליים הם הטרוגנית בsizes, תכנים ספציפיים, ומסלולים biogenesis. כדי לאגד אותם, מכשירי נייר מצופים בשתי מולקולות שונות ללכוד EV, נוגדנים נגד CD63 וV Annexin, הוכנו. CD63, חבר של משפחת tetraspanin (הכולל מולקולות CD9, CD63, CD81 וCD82) מועשר בקרום EV 31, ויש לו V Annexin זיקה חזקה לphosphatidylserine (PS) 32,33. הוא מצא כי כלי רכב חשמליים משתחררים constitutively במהלך אפופטוזיס מוקדם או בתנאי לחץ, שבו הא-סימטריה תא נורמלית תהליך פוספוליפידים הולכות לאיבוד, שהובילה לחשיפה מוגברת של PS בעלון החיצוני של קרום EV. ניתוח של תמונות SEM מראה כי הפצות הגודל של CD63 + כלי רכב חשמליים וPS + מכוניות חשמליות שונות, בקטרים ​​ממוצעים של 80 ו- 43 ננומטר, בהתאמה (איור 3) .the מבחן t שני זנב משמש לקביעת p-הערך הסטטיסטי (P-value <0.0001). באופן מפתיע, CD63 + כלי רכב חשמליים מופיעים עגול וגדול יותר מPS + כלי רכב חשמליים בממוצע, אשר ביולוגי משמעות עדיין לא הובהרה.

RNA מכלי הרכב חשמלי שנתפסו במכשיר הנייר ניתן לחלץ. ניתוח עם bioanalyzer הראה פרופילים הכלליים דומים לRNAs הכולל המופק מCD63 + וPS + כלי הרכב חשמלי (איור 4 א). בהשוואה לסכומים של RNA הופקו באמצעות טכניקות microfluidic וultracentrifugation, בהתאמה בערך פעמיים ו -39 פעמים יותר RNAs ליחידת נפח של מדגם סרום הוצאו ניצול מכשיר נייר, אם כי קטן יותר באמצעות נפח דגימה (טבלת 1). יכול להתבצע P-ELISA לזיהוי של כלי רכב חשמלי. נוגדן ראשוני אנטי-CD9 ונוגדנים משני HRP-מצומדות משמשים במחקר זה. איור 4 מציג את שינויי ערך אפורים המיוצרים על ידי התגובה האנזימטית של HRP למכשירי נייר מיושמים עם 10 μl PBS, בסרום% 50 (בדילול עם PBS), או 100 סרום%, בהתאמה. הערך האפור מגדיל באופן ליניארי בטווח של דגימות סרום נבדק.

> מכשירי נייר הם יתרון במיוחד כאשר סכום המדגם מוגבל כגון במקרה של הומור המימי, כאשר רק <200 μl / עין יכולה להיות שנאספו. דוגמאות רבות לעתים קרובות יש צורך ואספו יחד אם שיטות בידוד אחרות, למשל, ultracentrifugation, הם לשימוש. כלי רכב חשמליים מדגימות הומור מימיות מטופל מבודד עם התקני נייר מצופים בנוגדנים נגד CD63 שניתן לראות בתמונות SEM כהראו באיור 5.

איור 1
נייר איור 1. הליך הייצור ותפעול של מבחני המבוסס על נייר במטרה בידוד ואפיון של שלפוחית ​​תאית. () סינון הוא חתך לתוך הצורה הרצויה ולמינציה. (ב) המשטח של הנייר שונה עם טיפול קצר של פלזמה חמצן והגיב בtrimethoxysilane 3-mercaptopropyl, N </ Em> -γ-maleimidobutyryloxy אסתר succinimide, וNeutrAvidin, על מנת ש. מולקולות ללכוד biotinylated, למשל, נוגדנים, אז יכולים להיות משותקות באמצעות הזיקה החזקה בין ביוטין ומולקולות NeutrAvidin. (C) Biosamples יכול להיות פיפטה על מכשיר נייר פונקציונליות. יכולה להיות מבודדת שלפוחית ​​תאית. (ד) מבחני במורד הזרם, כגון SEM, transcriptome, וELISA (עולם), יכול להתבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שלפוחית ​​תאית (EVS) יכול לנפול בפח בהתקני נייר פונקציונליות עם סגוליות טובות ורגישות. () מולקולות ביוטין שכותרתו fluorescently הם משותקים מאוד על הניירמכשיר באמצעות תהליך כימי נטיה ("נייר + crosslinker + צבע") בניגוד לספיחה פיזית ("physisorbed-צבע"). נייר לא מעובד ("נייר") ומולקולות נטיה ("נייר + crosslinker") תורמים מעט לעוצמת הקרינה. תמונה מייצגת SEM מראה כמה כלי רכב חשמליים (ארוחת בוקר) שנתפס על מכשיר נייר שאינו במיוחד כאשר המולקולות ללכוד הוא הוחלף על ידי PBS המכיל 1% (w / v) BSA. כלי רכב חשמליים רבים (C) נשמרים במכשירי נייר מצופים בנוגדנים נגד CD63. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3-mercaptopropyl
3. תת-קבוצות איור של שלפוחית ​​תאית (EVS) יכולה להיות הפצות גודל שונות. ()ו- (ב) הם תמונות SEM נציג של כלי רכב חשמליים שנתפסו על מכשירי נייר מצופים בנוגדנים נגד CD63 ומולקולות V Annexin, בהתאמה. CD63 (C) + רכב חשמלי להיראות גדול יותר מאשר PS + כלי רכב חשמליים בתנאי ניסוי נעשה שימוש במחקר זה (p-value <0.0001, n = 124 ו -203, מבחן t). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
מבחני איור 4. transcriptome Downstream וELISA. (א) נתונים Bioanalyzer מראים את העוצמות (ציר y, ביחידות שרירותיות) וגודל (ציר x, בנוקלאוטידים (NT)) הפצות של רנ"א הכל fluorescently שכותרתו שחולצו מכלי רכב חשמליים שנתפסו על אנטי-CD63 antibody- או Annexin V מצופה ניירות לסנן. השיא הנודד ב ~ 25 NT מייצג סטנדרטי. פנימי (ב) שינויים בשווי גריי המיוצרים על ידי התגובה האנזימטית של peroxidase חזרת (HRP) בassay P-ELISA למכשירי נייר מיושם עם 10 דגימות μl של PBS, בסרום של 50% (בדילול מלא עם PBS) ו -100 דגימות סרום%. אנא לחץ על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. שלפוחית ​​תאית (EVS) בדגימות הומור מימיות יכולה להיות שנתפסה על נייר סינון פונקציונליות מבלי איגום מדגם. SEM תמונות של CD63 המבודד + כלי רכב חשמליים בדגימות הומור מימיות מחולים עם () ניוון מקולרים הקשור לגיל, קולרי סוכרת (B) בצקת, ו- (ג) vasculopathy choroidal polypoidal, בהתאמה.עומס / 52,722 52722fig5highres.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שיטת בידוד מולקולת לכידה כרך סרום. (Μl) RNA הממוצע חילוץ (ng) RNA / סרום שחולץ ממוצע
(Pg / μl)
יחס של RNA / סרום ממוצע נ"צ
מכשיר microfluidic CD63 אנטי אנושי 400 4.14 10.4 20 20
מכשיר נייר CD63 אנטי אנושי 72 1.49 ± 0.08 20.7 39 22
מכשיר נייר V Annexin 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
ultracentrifugation - 2,000 1.06 ± 0.64 0.53 1
סרום - 72 1.23 ± 0.58 17 32 22

1. RNA סה"כ השולחן שחולץ מן דגימות סרום ממתנדבים בריאים ניתח עם bioanalyzer (n = 4 לכל התנאים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השלבים הקריטיים ביותר לבידוד מוצלח של תת-קבוצות של שלפוחית ​​תאית הם: 1) בחירה טובה של נייר; 2) כיסוי יציב וגבוה של מולקולות ללכוד על פני השטח של סיבי נייר; טיפול נכון של דגימות 3); ו 4) תרגול היגיינה מעבדה כללית.

חומרים נקבוביים כבר נוצלו בהרבה מבחני זולים וחינמי ציוד. אולי יש להם גודל נקבובית מתכונן, פונקציונלי רב-תכליתי, עלות נמוכה ויחס קרקע-נפח גבוה מאפשר פתילה פסיבית של נוזלים. בחרנו כיתה נייר תאית כרומטוגרפיה 1 בעיקר לגודלו הראוי הנקבובית וספיחת חלבון נמוכה. בהשוואה לעוד חומרים נקבוביים נפוצים, nitrocellulose, יש נייר תאית ספיחה נמוכה בהרבה ספציפי חלבון 34. אנו מוצאים גם לכידה ספציפיות קטנה של כלי רכב חשמליים במחקר זה. בנוסף, רמתו שמירת חלקיקים, 11 מיקרומטר, היא גדולה יותר מהגודל של 35 כלי רכב חשמלי, המאפשר ללכידה המבוקש בבניגוד להשמנה פיזית של כלי רכב חשמלי. כאן, אנו מתמקדים בכלי רכב חשמליים של גודל קטן יותר על ידי העברת דגימות סרום באמצעות 0.8 מיקרומטר מסנן, שצעד עשוי להיות שונה כאשר כלי רכב חשמליים גדולים יותר הם כדי להיחקר.

שינוי פני השטח כימי יכול להיות מפתח להשגת כיסוי יציב וגבוה של מולקולות ללכוד על פני השטח כאמצעי לשיפור היעילות של בידוד EV. שינויי פני השטח של תאית נבדקו 36,37. יש מספרים גבוהים של הידרוקסיל (אה) קבוצות על פני השטח של תאית והם יכולים להגיב עם silane לתת אג"ח Si-OC כימי יציב לאחר שהופעל עם פלזמה חמצן או תהליך עיבוי אחר. Silane שימש במחקר זה הוא trimethoxysilane (3-mercaptopropyl), (מיאו) 3 Si- (CH 2) -SH 3. תיאול קבוצה (-SH) יכולה להגיב עם GMBS לספק זרוע קצרה חלל (0.73 ננומטר) וקבוצת crosslinking שזוגות עם אמינים ראשוניים. ניתן מצומדות מולקולות לכידה עם קבוצות האמיניםלGMBS ישירות. במחקר זה, עם זאת, אנו מצומדות NeutrAvidin במקום לספק תכנית כללית ללהטות מולקולות לכידה שונות שכותרתו ביוטין. עם זאת, עדיין לא הגיעה להסכמה על סמנים תת ספציפי EV 17. יש NeutrAvidin זיקה חזקה מאוד לביוטין ונקודה קרובה ניטראלית isoelectric (pH 6.3), מזעור אינטראקציות ספציפיות עם אובייקטים טעונים שלילי, לדוגמא את פני השטח של כלי רכב חשמלי. בניגוד לכך, avidin עם נקודה של 10.5 isoelectric נושא מטענים חיוביים ב- pH הניטרלי. ריכוז גבוה יותר של נוגדנים נגד CD63 משמש מזה בחן et al. 20, בעיקר בשל הנפח הקטן שיושם ויחס קרקע-נפח הגדול יותר של מכשיר נייר. עם זאת, כמות ויצירות של חלבונים נספחו אל סיבי נייר לא היו מאופיינות, אשר עשוי להיות מדגם תלוי. לפיכך, יש להקפיד כאשר לפרש את התוצאות של ניתוח חלבון.

דו נאסףדגימות ological צריכים להיות מטופלים בעדינות ומעובד במהירות כדי למנוע רמות EV מוגברים artifactually. מומלץ להסיר את התאים וטסיות דם, אם בכלל, לפני האחסון ב -80 ° C. ניתן למצוא תקינה נוכחית של טיפול מדגם במחקר EV בסקירה זו 17.

תרגול היגיינה מעבדה נכון צריך להיות מועסק. תמיד ללבוש כפפות וכפפות שינוי לעתים קרובות כדי למזער את ההקדמה של חלקיקי אבק וribonucleases. בידוד של RNA מכלי רכב חשמלי בתקשורת ממוזגת תרבית תאים יכול להניב ריכוזים יותר מ -70 פעמים יותר באמצעות מכשירי נייר בהשוואה לזו שחולצה מכלי הרכב חשמלי מרוכזים בשיטת ultracentrifuge (לא פורסם).

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במכשירי נייר תאית שינוי כימי עם מולקולות ללכוד לבודד תת-קבוצות שונות של כלי רכב חשמליים. השיטה היא פשוטה, יעילה, וחשובה במיוחד כאשר נפח הדגימה מוגבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המועצה הלאומית למדע טייוואן grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) והמועצה לביטחון לאומי 101-2,628-E-007-011-MY3 (CMC), ויוצאי הצבא הכללי בתי חולים ומערכת אוניברסיטת טייוואן משותף תכנית המחקר (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter