Summary
このプロトコルは、わずか10μlの血清サンプルから、細胞外ベシクル（電気自動車）、細胞から放出された小さな膜状粒子を単離する方法を詳しく説明します。このアプローチは、超遠心分離の必要性を回避するアッセイ時間の数分しか必要とし、限られた容積のサンプルからのEVの単離を可能にする。
Abstract
細胞外ベシクル（電気自動車）、細胞の様々なタイプから放出された膜状の粒子は、臨床応用のための大きな可能性を保持する。これらは、核酸およびタンパク質貨物を含む、ますます真核生物および原核生物細胞の両方によって利用される細胞間コミュニケーションの手段として認識されている。しかしながら、それらのサイズが小さいため、電気自動車の単離のための現在のプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、面倒であり、そのような超遠心分離機のような大量の試料で高価な装置を必要とする。これらの制限に対処するために、我々は、簡単で効率的であり、そして10μlの程度の低いサンプルボリュームを必要とする電気自動車のサブグループを分離するための紙ベースの免疫親和性プラットフォームを開発した。生物学的サンプルは、化学的に特定EV表面マーカーに対して高い親和性を有する捕捉分子で変性された紙テストゾーン上に直接ピペッティングすることができる。我々は、走査電子顕微鏡（SEM）を用いてアッセイを確認、紙ベースの酵素結合immunosorbenトンアッセイ（P-ELISA）、およびトランスクリプトーム解析。これらの紙ベースのデバイスは、健康および疾患におけるEV機能の私達の理解を進める支援する診療所での電気自動車の研究と研究の設定を有効にします。
Protocol
操作手順の概略図を図1に提供されている。倫理的な慣行を使用して、我々は、（健康な被験者から血液サンプルを採取し、IRBのプロトコルを承認し、台湾の下台退役軍人総合病院（TCVGH）、台中を通して患者からの房水のサンプルを得IRB TCVGH号CF11213-1）。
ペーパーデバイスの1の作製
- 96ウェルマイクロタイタープレートと同じレイアウトを提供するために、直径5mmの円形にクロマトグラフィー紙を切る。登録された貫通孔、及び、積層体二つのポリスチレンシートをこれらの紙片を挟む。
- 以下に記載の化学コンジュゲーション法を用いて紙のデバイスを変更する28ステップ 。
- プラズマチャンバ内で酸素プラズマ（100ミリワット、1％の酸素、30秒）で紙装置を扱う。
注意：3-メルカプトプロピルトリメトキシシランとN-γ-マレイミドスクシンイミドで作業する場合には、特別な注意が取られなければならないエステル（GMBS）、彼らは両方の水分が敏感と有毒であるため。保護手袋を着用し、吸入または皮膚や眼との接触を避ける。密閉株式ボトルを維持し、それが水の凝縮を避けるために開く前に室温に平衡することができます。また、窒素充填グローブバッグまたはボックス内の株式ボトルを開きます。株式ボトルの頻繁な開口部を避けるために小さなバイアル中にアリコート。 - 直ちに30分間、エタノール中の3-メルカプトプロピルトリメトキシシランの4％（v / v）の溶液（200プルーフ）で処理された紙デバイスをインキュベートする。
- エタノールで紙のデバイスをすすぎ、15分間、エタノール中で0.01マイクロモル/ mlのGMBSでそれらを培養する。
- エタノール（200プルーフ）でリンスし、そして4℃で1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中10μg/ mlのアビジン溶液で紙デバイスをインキュベートする。 4℃で保存する必要に応じて、4週間以内に使用します。
- プラズマチャンバ内で酸素プラズマ（100ミリワット、1％の酸素、30秒）で紙装置を扱う。
- 10μlのPBS 1％を含む（w / v）のウシ血清アルブミン（BSAを用いたウェット各紙テストゾーン）3×10分間、3×10分間10μlのビオチン化捕捉分子をスポッティングする前に。 （（）w / vの1％を含有するPBS中に20μg/ mlのBSAおよび0.09％（w / v）のアジ化ナトリウム）、抗CD63抗体を使用するとして、またはアネキシンV（アネキシンV結合緩衝液で1:20、v / v）の捕捉分子。
- それぞれ、3×1分間の緩衝液を結合BSAまたはアネキシンV（w / v）の1％を含むPBSを対応する10μlのを使用して、未結合抗CD63抗体またはアネキシンV分子を洗い流してください。
2.血清房水サンプル収集と処理
- 血清コレクション。
- 血清分離チューブに静脈穿刺により末梢血の10ミリリットルを収集し、静かにチューブを5回転倒。垂直位置にチューブをセットし、30分間待ちます。
- 15分間1200×gで遠心分離する。 30分間3000×gで再びきれいなチューブに最上層から血清を移し、遠心分離機。
- 0.8μmのFILを通じて上清を渡すTER。使用するまで-80℃でサンプルを保管してください。
- 房水コレクション：使用するまで-80℃で直接侵襲的手技や店舗のサンプルを通じて眼科医によって診断された患者からの房水のサンプルを収集。
細胞外ベシクルの3.絶縁
- 5μL/分の速度でそれぞれ紙テストゾーンの上にスポットサンプル。
- 10μlをそれぞれ、抗CD63抗体またはアネキシンVの分子で官能紙装置3×1分間、緩衝液を結合BSAまたはアネキシンV（w / v）の1％含有PBSを、対応して結合していない電気自動車を洗い流す。次の下流のアッセイを行う。
4.ダウンストリームアッセイ例1：スキャンElectromicrographs
- 10分間10μlの0.5×カルノフスキーの固定液を使用して官能基化紙テストゾーン上に捕獲EVのを修正。
- 2×5分間の十分なPBSでサンプルを洗浄します。
- 脱水する10分間続く35％エタノール、2×10分間、2×10分間、2×10分間、95％エタノール、および4×10分間、100％エタノール、70％エタノール、50％エタノールで試料。
- ドライ臨界コートをパラジウム/金を有するサンプルをスパッタし、低電子加速電圧（〜5kVの）で操作を走査型電子顕微鏡を用いて調べる。
5.ダウンストリームアッセイ実施例2：紙ベースのELISA
- 捕獲電気自動車を含む各試験ゾーンにPBSで千希釈：1の抗CD9一次抗体を含む5μlの溶液を加える。 1分待ってください。
- 30秒間100 rpmで振とう30ミリリットルPBSでサンプルを洗浄します。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を含む5μlの溶液を1で二次抗体を結合型追加：PBS中千希釈し、1分待ちます。
- 30秒間100 rpmで振とう30ミリリットルPBSでサンプルを洗浄します。
- 過酸化水素ANの1の体積比：1を含む5μlの発色基質を追加します。dは3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）およびデスクトップスキャナを使用してスキャン。
6.ダウンストリームアッセイ例3：RNAの単離
- 捕獲電気自動車を溶解するために結合バッファー/ポリビニルピロリドンベースのRNA単離援助35μlのと溶解の265μlのサンプルを浸し。ボルテックス精力的に。
- 溶解液に分離キットで提供30μlのホモジネートを追加します。激しく混和し、10分間氷上に置いた。
- 次の手順で説明する酸フェノール - クロロホルム分離を用いてRNAを抽出します。
- ボトルの底層からのフェノール - クロロホルム330μLを取り、ホモジネート/溶解液に加える。ボルテックス精力的に。
- 5分間万×gで遠心分離する。きれいなチューブに水（上）相を移し、削除音量に注意してください。
- 前のステップと共同で除去水相の1.25倍の体積である体積の100％エタノールでトータルRNAを沈殿させ95℃に予熱した溶出液中のRNA llect。
- 濃縮し、さらに、製造業者のプロトコルに従ってRNAクリーンアップキットを用いてRNAを精製する。
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Representative Results
EVのサブグループを単離するための紙装置の能力を効率的にEV表面マーカーの高感度かつ特異的な認識に依存する。捕捉分子と紙繊維の安定した修飾は、他の場所28-30に記載のように、アビジン-ビオチン化学を使用することによって達成される。化学結合および物理吸着法の有効性は、蛍光ベースの読み取り値を使用して評価される。紙試験ゾーンは、捕捉分子は、ステップ1.3で20μg/ mlの蛍光体R-フィコエリトリン結合ビオチン分子（PEビオチン）で置換されている以外は）プロトコル手順1に従って製造される。紙試験ゾーンは、その後、未結合のPEビオチン分子を除去するためにPBSですすぐ。対照的に、1％を含有するPBS中で、10μlの20μg/ mlのPEビオチン（w / v）のBSAおよび0.09％（w / v）のアジ化ナトリウムを直接PBS、続いて3×10分間、紙テストゾーン、上にスポットPEビオチン色素分子の物理吸着を行うためのリンス。化学的に物理吸着と変更された未処理の紙デバイス（「紙」）と一緒に紙デバイス（「紙+架橋剤+染料」）、PE-ビオチン分子（「紙+架橋剤」）の適用せずに、同じプロトコルで修飾された紙装置や紙デバイスPE-ビオチン分子（「物理吸着色素」）540〜560 nmの励起に設定した画像記録システムを使用してスキャンされ、575 nmのロングパス放出、およびデータは、16ビットのファイル形式で保存され、分析されるImageJソフトウェアを使用して。 図2Aに示すように、物理的にコーティングされた紙の試験ゾーンと比較して、化学的結合法により調製された試験ゾーンの蛍光強度（p値<0.0005のn = 5、スチューデントのt検定）、実質的に高い。捕捉分子は、PBS溶液によって置換されている場合、いくつかの電気自動車は、紙装置上に保持されている図2B、Cに例示されるように電気自動車の取り込みも特異的である。
電気自動車は、Siに不均質であるZES、具体的な内容、及び生物発生ルート。それらを結合するために、二つの異なるEV捕捉分子、抗CD63抗体およびアネキシンVでコーティングされた紙装置は、調製した。 CD63、テトラスパニンファミリーのメンバー（CD9、CD63、CD81およびCD82分子を含む）EV膜31上に濃縮され、そしてアネキシンVは、ホスファチジルセリン（PS）32,33に対して強い親和性を有している。これは、電気自動車にするプロセスの正常細胞のリン脂質の非対称性は、EV膜の外側リーフレット上のPSの増加した曝露をもたらす失われ、初期アポトーシス中またはストレス条件下で構成的に放出されることが見出されている。 SEM画像の分析は、CD63 + EVやPS + EVのサイズ分布（ 図3）.theの両側スチューデントt検定を統計的p値を決定するために使用される、それぞれ、80および43以下の平均直径を有する、異なることを示している（p値<0.0001）。驚くべきことに、CD63 +の電気自動車は、丸くし、平均でPS +電気自動車よりも大きく、生物学的な表示されます重要性は、まだ解明されていない。
紙装置上に捕捉電気自動車からRNAを抽出することができる。バイオアナライザーとの分析は、CD63 +およびPS +電気自動車（ 図4A）から抽出した全RNAをための同様の全体的なプロファイルを示した。 RNAの量と比較して、血清試料の単位体積あたり、それぞれ約二倍と39倍以上のRNAが小さな試料体積（ 表1）を用いてもかかわらず、紙のデバイスを利用して抽出した、マイクロ流体及び超遠心分離技術を用いて抽出した。 P-ELISAは、電気自動車を検出するために行うことができる。抗CD9一次抗体およびHRP結合二次抗体をこの研究で使用されている。 図4Bは、（PBSで希釈）10μlのPBS、50％血清を適用した紙装置のためのHRPの酵素反応によって生成されるグレー値の変化を表示する、または100それぞれ％血清、。グレー値は、試験した血清サンプルの範囲内で直線的に増加する。
例えば、超遠心分離は、使用される。 図5に示したように、抗CD63抗体でコーティングされた紙装置を用いて単離した患者房水試料からの電気自動車は、SEM画像で見ることができる。
図1の単離および細胞外小胞の特徴付けを目的とした紙ベースのアッセイの製造および操作手順（A）フィルター紙を所望の形状に切断して積層されている。 （B）紙の表面を酸素プラズマの短時間の処理で変更され、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、N <と反応させて/ em>の-γマレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、およびニュートラ、そのためである。ビオチン化された捕捉分子、 例えば、抗体は、その後、ビオチンおよびニュートラアビジン分子との間の強い親和性を介して固定化することができる。 （C）生体試料は、官能紙装置にピペットであってもよい。細胞外小胞を単離することができる。 （D）など、SEM、トランスクリプトーム、およびELISA（図示）のような下流アッセイ、行うことができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.細胞外小胞（電気自動車）が良好な特異性及び感度で官能化された紙装置に取り込むことができる。（A）蛍光標識されたビオチン分子が非常に紙の上に固定されている化学的結合法、物理吸着とは対照的に（「紙+架橋剤+染料」）（「物理吸着色素」）を介してデバイス。未処理紙（「紙」）および結合分子（「紙+架橋剤」）は、蛍光強度にはほとんど貢献しています。捕捉分子は、PBS、1％（w / v）のBSAを含有する置換された場合（B）、いくつかの電気自動車を示す代表的なSEM像を非特異的に紙装置上に捕捉される。 （C）多くの電気自動車は、抗CD63抗体でコーティングされた紙のデバイス上に保持されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細胞外小胞（電気自動車）の3サブグループは異なるサイズ分布を有することができる。図。（A）及び（B）はそれぞれ抗CD63抗体およびアネキシンVの分子、で被覆された紙のデバイス上に捕捉された電気自動車の代表的なSEM像である。 （C）CD63 +電気自動車が。本研究で用いた実験条件下でPS +電気自動車よりも大きく表示されます（p値<0.0001、N = 124と203、スチューデントのt検定） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4下流トランスクリプトームおよびELISAアッセイが含まれる。（A）電気自動車から抽出された蛍光標識されたトータルRNAの分布をキャプチャヌクレオチド（nt）（x軸）の強度を（任意単位でy軸）とサイズを示すバイオアナライザーデータ抗CD63抗体またはアネキシンV-コーティングされたろ紙上。 〜25で移動するピークはNT表し内部標準。 （B）に10μl（PBSで希釈）、PBS、50％血清のサンプルは100％の血清サンプルを塗布紙装置のためのP-ELISAアッセイにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の酵素反応によって生成されるグレー値の変更。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
房水試料中の図5の細胞外小胞（電気自動車）は、試料プーリングなしで官能化された濾紙上に捕捉することができる。患者からの房水の試料中の単離されたCD63 + EVのSEM像（A）、加齢性黄斑変性症、（B）糖尿病性黄斑それぞれ浮腫、および（C）ポリープ状脈絡膜血管症、。ロード/ 52722 / 52722fig5highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 単離法 | 捕捉分子 | 血清巻。 （μL） | 抽出された平均RNA（NG） | 平均抽出したRNA /血清 （PG /μL） | 平均RNA /血清の比率 | 参照 |
| マイクロ流体素子 | 抗ヒトCD63 | 400 | 4.14 | 10.4 | 20 | 20 |
| 紙デバイス | 抗ヒトCD63 | 72 | 1.49±0.08 | 20.7 | 39 | 22 |
| 紙デバイス | アネキシンV | 72 | 0.99±0.26 | 13.8 | 26 | 22 |
| 超遠心分離法 | - | 2000 | 1.06±0.64 | 0.53 | 1 | |
| 血清 | - | 72 | 1.23±0.58 | 17 | 32 | 22 |
健常ボランティアからの血清サンプルから抽出表1.総RNAバイオアナライザー（すべての条件のためにはn = 4）で分析した。
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Discussion
細胞外ベシクルのサブグループの成功を単離するための最も重要な手順は次のとおりです。紙の1）良い選択。紙の繊維の表面上の捕捉分子の2）安定した高いカバレッジ; 3）サンプルの適切な取扱い。 4）一般的な実験室の衛生の実施を徹底する。
多孔質材料は、多くの安価機器フリーアッセイにおいて利用されている。これらは、調整可能な細孔サイズ、多目的機能、低コスト、流体の受動的なウィッキングを可能にする高い表面対体積比を有することができる。私たちは、主に、その適切な細孔サイズおよび低いタンパク質吸着クロマトグラフィーセルロース紙等級1を選んだ。別の一般的に使用される多孔性材料、ニトロセルロースと比較して、セルロース紙は、非常に低い非特異的タンパク質吸着34を有している。また、本研究におけるEVの少ない非特異的捕捉を見つける。加えて、その粒子の保持レベル、11ミクロン、で特異的な捕捉を可能にする、電気自動車35のサイズよりも大きいEVの物理的なトラップとは対照的。ここでは、より大きな電気自動車を研究する場合に修正することができるステップを0.8μmフィルターを介して血清試料を通過させることによって、より小さいサイズの電気自動車に焦点を当てる。
化学的表面改質は、EV分離の効率を向上させる手段として表面上の捕捉分子の安定した高いカバレッジを達成するための鍵であることができる。セルロースの表面修飾は、36,37を検討されている。そこに高いヒドロキシル（-OH）の数字のグループは、セルロースの表面であり、それらは、酸素プラズマまたは他の凝縮過程で活性化された後、安定した化学のSi-OC結合を与えるために、シランと反応することができる。この研究で使用されるシランは、（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（のMeO）3 Si-で（CH 2）3 -SH。チオール（-SH）基は、短いスペースアーム（0.73 nm）であり、第一級アミンと結合する架橋基を提供するために、GMBSと反応することができる。アミン基を有する捕捉分子をコンジュゲートすることができる直接GMBSする。本研究では、しかし、我々は、ビオチン標識され、様々な捕捉分子を結合するための一般的なスキームを提供する代わりにニュートラアビジンをコンジュゲート。しかし、EVのサブタイプ特異的マーカー上のコンセンサスが17に達したことがまだあります。ニュートラアビジンは、負に帯電したオブジェクト、 例えば電気自動車の表面との非特異的相互作用を最小限にする、ビオチンに対して非常に強い親和性とほぼ中性の等電点（pHは6.3）を有している。対照的に、10.5の等電点を有するアビジン、中性pHで正電荷を運ぶ。抗CD63抗体のより高い濃度は、主に適用され、小容量と紙装置のより大きな表面積対体積比は、Chen ら 20のそれよりも使用される。しかし、紙繊維に吸着したタンパク質の量および組成物は、サンプルに依存していてもよく、特徴付けられていない。タンパク質分析の結果を解釈するため、注意が必要です。
収集された双方向学的サンプルは優しく扱われ、人為的に増加したEVレベルを防止するために、迅速に処理されるべきである。これは、-80℃で保存する前に、もしあれば、細胞や血小板を除去することをお勧めします。 EVの研究にサンプル処理の現在の標準化がこのレビュー17に記載されています。
適切な実験室の衛生慣行を採用する必要があります。常に手袋を着用し、粉塵粒子とリボヌクレアーゼの導入を最小限にするために頻繁に手袋を変更します。細胞培養馴化培地中でのEVからのRNAの単離は、電気自動車から抽出されたものと比較して、紙装置を使用して70倍以上高い濃度を得ることができる（未発表）超遠心分離法を用いて濃縮した。
ここに説明されたプロトコルは、EVの異なるサブグループを分離するために捕捉分子と化学的に修飾されたセルロース紙のデバイスを使用しています。サンプル量が限られている場合の方法は、単純、効率的、かつ特に価値がある。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
Acknowledgments
この作品は、台湾国家科学委員会grants- NSC 99から2320-B-007から005-MY2（CC）とNSC 101から2628-E-007から011-MY3（CMC）、および退役軍人将軍によって部分的にサポートされていました病院や台湾の共同研究プログラムの大学システム（CC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatography Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Grade 1 cellulose paper |
| (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane | Sigma Aldrich | 175617 | This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absolute, 200 Proof, molecular biology grade |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Often referred to as Cohn fraction V. |
| N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin |
| Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| biotinylated annexin V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS) |
| Primary anti-CD9 and secondary antibody | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated |
| Serum separation tubes | BD Biosciences | 367991 | Clot activator and gel for serum separation |
| Annexin V binding buffer | BD Biosciences | 556454 | 10x; dilute to 1x prior to use. |
| TMB substrate reagent set | BD Biosciences | 555214 | The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA isolation kit | Life Technologies | AM1560 | MirVana RNA isolation kit |
| Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid | Life Technologies | AM9690 | Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides. |
| RNA cleanup kit | Qiagen Inc. | 74004 | MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA. |
| Plasma chamber | March Instruments | PX-250 | |
| Scanning electron microscope | Hitachi Ltd. | S-4300 | |
| Desktop scanner | Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used. |
| Image-record system | J&H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used. |
References
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