Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

Этот протокол детализирует метод, чтобы изолировать внеклеточные пузырьки (EVS), небольшие мембранные частиц, выпущенных из клеток, от всего лишь 10 мкл образцов сыворотки. Такой подход позволяет обойти необходимость ультрацентрифугированием, требуется только несколько минут времени для анализа и делает возможным выделение электромобилей из образцов ограниченных объемах.

Abstract

Внеклеточные пузырьки (EVS), мембранные частиц, выпущенных из различных типов клеток, провести большой потенциал для клинического применения. Они содержат кислоты и белка груз нуклеиновой и получают все большее признание в качестве средства межклеточной коммуникации, используемой как эукариот и прокариот клеток. Тем не менее, из-за их малого размера, текущие протоколы для выделения электромобилей часто занимает много времени, громоздка и требует больших объемов образцов и дорогое оборудование, например, ультрацентрифуге. Для устранения этих недостатков мы разработали на основе бумаги иммуноафинную платформу для разделения подгруппы электромобилей, который легко, эффективно, и требует выборки объемов столь же низко как 10 мкл. Биологические образцы могут быть пипеткой непосредственно на индикаторной бумаги зон, которые были химически модифицированы с молекулами захвата, которые имеют высокое сродство к определенным Е. поверхностных маркеров. Мы проверки анализа с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), на бумажной основе фермента-сшитый immunosorbenт анализы (P-ELISA), анализ транскриптом. Эти бумажные устройства позволит изучение электромобилей в клинике и условий исследования, чтобы помочь продвинуть наше понимание EV функций в норме и патологии.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Общая схема процедуры работы приводится на рис 1. Использование этических норм, мы собрали образцы крови у здоровых субъектов, и полученный водный образцы юмора у пациентов через ветеранов больницы Тайчжун (TCVGH), Тайчжун, Тайвань под IRB утвержденным протоколов ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Изготовление бумаги устройств

  1. Вырезать хроматографии бумагу в кругах 5 мм в диаметре, чтобы обеспечить тот же макет, как микротитрационном 96-луночного планшета. Бутерброд эти кусочки бумаги с двумя Листы из полистирола с зарегистрированным сквозных отверстий и ламината.
  2. Изменить бумаги устройств, использующих метод химического сопряжения, описанную в следующих шагов 28.
    1. Лечить бумаги устройства с кислородной плазмы (100 мВт, 1% кислорода, 30 сек) в плазменной камере.
      ВНИМАНИЕ: Особая осторожность следует проявлять при работе с 3-меркаптопропилтриметоксисилана и N -γ-maleimidobutyryloxy сукцинимидаэфир (GMBS), так как они оба чувствительных к влаге и токсичными. Носите защитные перчатки и избегать вдыхания или контакта с кожей и глазами. Держите на фондовом бутылку, плотно закрытыми и позволить ему уравновесить до комнатной температуры перед открытием, чтобы избежать конденсации влаги. Кроме того, открыть фондовый бутылки внутрь заполненную азотом перчаточном боксе или коробку. Алиготе в небольших пробирках, чтобы избежать частого открытия фондовой бутылки.
    2. Сразу инкубировать обработанной бумаги устройств в 4% (объем / объем) раствора 3-меркаптопропилтриметоксисилана в этаноле (200 доказательства) в течение 30 мин.
    3. Промыть бумаги устройства с этанолом и инкубировать их с 0,01 мкмоль / мл GMBS в этаноле в течение 15 мин.
    4. Промывают этанолом (200 доказательства) и инкубируют бумаги устройств с 10 мкг / мл раствора авидин в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 1 ч при 4 ° С. Хранить при 4 ° С, если это необходимо, и использовать в течение 4 недель.
  3. Влажный каждого теста бумагу зоны с 10 мкл PBS, содержащим 1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) В течение 3 × 10 мин до пятнистость 10 мкл биотинилированных молекул захвата для 3 × 10 мин. Использование анти-CD63 антитела (20 мкг / мл в PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА и 0,09% (вес / объем) азида натрия) или аннексина V (1:20, объем / объем в аннексина V буфера для связывания), как молекулы захвата.
  4. Смыв несвязанных анти-CD63 антитела или молекулы аннексина V с использованием 10 мкл соответствующего PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА или аннексина V связывания буферные растворы в течение 3 × 1 мин, соответственно.

2. Сыворотка и водных Юмор Отбор проб и обработка

  1. Сыворотка коллекция.
    1. Соберите 10 мл периферической крови из вены в пробирки разделения сыворотки и аккуратно переверните трубку пять раз. Установка трубки в вертикальном положении и ждать в течение 30 мин.
    2. Центрифуга при 1200 х г в течение 15 мин. Передача сыворотку из верхнего слоя в чистую пробирку и центрифугируют снова в 3000 х г в течение 30 мин.
    3. Пропустите супернатант через FIL 0,8 мкмтер. Хранить образца при -80 ° С до использования.
  2. Водные юмора сбора: Сбор водных образцов юмор от пациентов, диагностированных у офтальмолога непосредственно с помощью инвазивных процедур и хранить образцы при -80 ° С до использования.

3. Выделение внеклеточной пузырьков

  1. Точечные пробы на каждого испытуемого зоне бумаги в размере 5 мкл / мин.
  2. Смыв несвязанных электромобилей с 10 мкл соответствующих PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА или аннексина V связывания буферные растворы для 3 × 1 мин для бумажных устройств, функционализированных молекул анти-CD63 антитела или аннексина V, соответственно. Выполните следующие ниже по течению анализов.

4. Downstream Анализ Пример 1: Сканирование Electromicrographs

  1. Fix электромобилей, снятые на функционализованного индикаторная бумага зону с помощью 10 мкл 0,5 × фиксатор Карновскому в течение 10 мин.
  2. Промыть образцов с достаточно PBS для 2 × 5 мин.
  3. ДегидрироватьОбразцы с последующим 35% -ным этанолом в течение 10 мин, 50% этанола в течение 2 × 10 мин, 70% этанола в течение 2 × 10 мин, 95% этанола в течение 2 × 10 мин, и 100% -ного этанола в течение 4 × 10 мин.
  4. Критический сухой и распыляют пальто образцов с палладий / золото, и изучить с помощью сканирующего электронного микроскопа, работающего при низком напряжении ускорения электронов (~ 5 кВ).

5. Переработка Пример анализа 2: Бумага на основе ELISA

  1. Добавить 5 мкл раствора, содержащего анти-CD9 первичного антитела 1: 1000 разбавление в PBS в каждую тестовую зону, содержащую отснятые электромобилей. Подождите 1 мин.
  2. Промыть образцов с 30 мл PBS, встряхивали при 100 оборотах в минуту в течение 30 сек.
  3. Добавить 5 мкл раствора, содержащего пероксидазу хрена (HRP) -связанной вторичного антитела в 1: 1000 разбавления в ФБР и подождите 1 мин.
  4. Промыть образцов с 30 мл PBS, встряхивали при 100 оборотах в минуту в течение 30 сек.
  5. Добавить 5 мкл колориметрический субстрат, содержащий 1: 1 объемное соотношение перекиси водорода ANd 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (TMB) и сканировать с помощью настольного сканера.

6. На выходе Анализ Пример 3: Выделение РНК

  1. Погрузите образцы в 35 мкл поливинилпирролидон на основе помощи выделения РНК и 265 мкл лизис / буфера для связывания лизировать электромобилей в плен. Vortex энергично.
  2. Добавить 30 мкл гомогената, представленную в изоляции комплекта к лизата. Вихревой энергично и помещали на лед в течение 10 мин.
  3. Извлечение РНК с использованием кислоты разделение фенола-хлороформа, описанной в следующих шагов.
    1. Взять 330 мкл фенол-хлороформом в нижнем слое бутылки и добавить в гомогенате / лизата. Vortex энергично.
    2. Центрифуга при 10000 х г в течение 5 мин. Передача водный (верхний) фазы в чистую пробирку и отмечают объем удален.
  4. Осадок тотальную РНК с 100% -ным этанолом в объеме, который 1,25-кратный объем водной фазы удалена на предыдущей стадии, и соllect РНК в элюции раствора, предварительно нагретую до 95 ° C.
  5. Концентрат и дальнейшей очистки РНК с использованием набора для РНК очистки в соответствии с протоколом изготовления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Способность устройства бумаги, чтобы изолировать подгруппы электромобилей эффективно зависит от его высокой чувствительностью и специфичностью распознавания EV поверхностных маркеров. Стабильный модификация бумажных волокон с молекулами захвата достигается с помощью авидин-биотин химии, как описано в другом месте 28-30. Эффективность химической конъюгации и метода физической адсорбции оценивается с помощью флуоресценции на основе показаний. Индикаторной бумаги зоны получают в соответствии с шагом протокола 1), за исключением молекулы захвата заменен с 20 мкг / мл флуорофор R-фикоэритрин-конъюгированными молекул биотина (PE-биотин) в стадии 1,3. Тестовая бумага зоны, затем промывают PBS для удаления несвязанных PE-биотин молекул. В отличие от этого, 10 мкл 20 мкг / мл РЕ-биотин в PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА и 0,09% (вес / объем) азида натрия непосредственно наносили на индикаторной бумаги зоне в течение 3 × 10 мин, а затем PBS промыть для проведения физической адсорбции молекул красителя PE-биотин. Химическимодифицированные бумаги устройства ("бумага + сшивающий агент + краситель"), а также необработанных бумажных устройств ("бумага"), бумажные устройства модифицированные с тем же протоколом без применения ПЭ-биотин молекул ("бумага + сшивающего агента») и бумажных устройств с physisorbed PE-биотин молекул ("physisorbed-краситель") сканируются с использованием системы изображения рекорд установлен в возбуждении 540-560 нм, 575 нм длиной частот излучения, и данные сохраняются в виде 16-битных файлов и проанализированы с помощью ImageJ программного обеспечения. Как показано на фиг.2А, интенсивность флуоресценции тестовых зон, полученных методом химической конъюгации значительно выше, по сравнению с физическими покрытием индикаторная бумага зон (величина р <0,0005, N = 5, т-критерий Стьюдента). Захват электромобилей также конкретных примером на фиг.2В, C, где несколько электромобилей которые сохранены на устройстве бумаги, когда молекулы захвата заменены раствора PBS.

Электромобили являются гетерогенными в сиЗЭС, конкретное содержание и биогенеза маршруты. Чтобы связать их, бумажные устройства, покрытые двух различных молекул захвата EV, анти-CD63 антитела и аннексином V, были подготовлены. CD63, член семьи Тетраспанины (которая включает в себя CD9, CD63, CD81 и CD82 молекул) обогащается на EV мембраны 31, и аннексин V имеет сильное сродство к фосфатидилсерина (PS) 32,33. Установлено, что электромобилей освобождаются конститутивно в начале апоптоза или в условиях стресса, в котором процесс нормального клеточного фосфолипида асимметрии теряется, что приводит к увеличению экспозиции PS на наружной листке EV мембраны. Анализ SEM изображений показывают, что распределение по размерам CD63 + электромобилей и Ps + электромобилей различны, со средними диаметрами 80 и 43 нм, соответственно (фиг.3) .Отель двусторонний т-тест Стьюдента используется для определения статистической р-значение (р-значение <0,0001). Удивительно, CD63 + электромобилей появится универсал и больше, чем PS + электромобилей в среднем, что биологическаязначение еще предстоит выяснить.

РНК из электромобилей, захваченных на устройстве бумаги могут быть извлечены. Анализы с Bioanalyzer показали аналогичные общие профили для полных РНК, выделенных из CD63 + и Ps + EV (4А). По сравнению с количеством экстрагированных РНК с помощью микрожидкостных и ультрацентрифугирования методы, соответственно примерно в два раза и 39 раз больше РНК на единицу объема образца сыворотки были извлечены использованием устройства для бумаги, хотя и с использованием меньшего объема пробы (таблица 1). Р-ELISA может осуществляться для обнаружения электромобилей. Анти-CD9 первичное антитело, и HRP-конъюгированные вторичные антитела, используемые в этом исследовании. показаны изменения уровня яркости, полученные по реакции ферментативного HRP для бумаги устройств, применяемых с 10 мкл PBS, 50% сыворотки (разбавленные в PBS), или 100 % сыворотки, соответственно. Серое значение линейно возрастает в пределах от образцов сыворотки тестировали.

например, ультрацентрифугирование, должны быть использованы. Электромобили от пациента водных образцов юмора, изолированных с бумажными устройств, покрытых анти-CD63 антитела могут быть видны в СЭМ-изображения, как показано на рисунке 5.

Фигура 1
Рисунок 1. Процедура изготовление и эксплуатацию бумажных анализов, направленных на выделение и характеристика внеклеточных пузырьков. (А) фильтровальной бумаги нарезают в желаемую форму и ламинированы. (В) поверхность бумаги модифицирована с краткого лечения кислородной плазмы и подвергают взаимодействию с 3-меркаптопропилтриметоксисилана, N </ EM> -γ-maleimidobutyryloxy сукцинимид эфир и NeutrAvidin, в указанном порядке. Биотинилированные молекулы захвата, например, антитела, затем может быть иммобилизованы с помощью сильного сродства между биотином и молекул NeutrAvidin. (С) биообъектов может быть пипетки на функционализированного бумаги устройства. Внеклеточные везикулы могут быть выделены. (D) в направлении анализы, такие как SEM, транскриптома и ELISA (на фото), может быть выполнена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Внеклеточные везикулы (EVS) может быть захвачен на функционализованных бумажных устройств с хорошим специфичности и чувствительности. (A) флуоресцентно меченных молекул биотина высоко иммобилизованных на бумагеУстройство с помощью химического процесса сопряжения ("бумага + сшивающего + краситель"), в отличие от физической адсорбции ("physisorbed-красителя"). Необработанные бумага ("бумага") и молекулы сопряжения ("бумага + сшивающих") мало способствуют интенсивности флуоресценции. (Б) представитель СЭМ изображение, показывающее несколько электромобилей захватываются на устройстве бумаги неспецифически, когда молекулы захвата заменен PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА. (C) Многие электромобилей сохраняются на бумажных устройств, покрытых анти-CD63 антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3-меркаптопропил
Рисунок 3. Подгруппы внеклеточного пузырьков (EVS) может иметь разные дистрибутивы размер. (A)и (В) представлены типичные СЭМ изображения электромобилей захваченных на бумажных устройств, покрытых анти-CD63 антител и молекул аннексина V, соответственно. (C) CD63 + электромобилей казаться больше, чем PS + электромобилей в экспериментальных условиях, используемых в этом исследовании (р-значение <0,0001, N = 124 и 203, Т-критерий Стьюдента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Переработка транскриптом и ИФА. (A) данных Bioanalyzer, показывающие интенсивности (у-оси, в ​​произвольных единицах) и размер (X-оси, в ​​нуклеотидов (нт)) распределения флуоресцентной меченных общей РНК, выделенной из электромобилей, захваченных по борьбе с CD63 антитело или аннексин V-покрытием фильтровальной бумаги. Миграции пик при ~ 25 нт представляет внутренний стандарт. (Б) изменение Серые значению, получаемому путем ферментативной реакции с пероксидазой хрена (HRP) в анализе ELISA-Р для бумаги устройств, применяемых при 10 образцов мкл ФБР, 50% сыворотки (разбавленного PBS) и 100 образцов сыворотки%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Внеклеточные пузырьки (EVS) в водных образцах юмор может быть захвачен на функционализованного фильтровальной бумаги без образца объединения. СЭМ изображения изолированной CD63 + электромобилей в водных образцах юмора у пациентов с (A) возрастная макулярная дегенерация (B) диабетической макулярной отек, и (С) polypoidal хориоидеи васкулопатия, соответственно.нагрузка / 52722 / 52722fig5highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Метод изоляции молекула захвата сыворотка т. (Мкл) Средняя РНК, выделенная (нг) Средняя Извлеченные РНК / сыворотки
(Пг / мкл)
отношение средней РНК / сыворотке ссылка
Микрожидкостных устройство анти-человеческий CD63 400 4.14 10,4 20 20
бумага устройство анти-человеческий CD63 72 1.49 ± 0.08 20,7 39 22
бумага устройство аннексин V 72 0.99 ± 0.26 13,8 26 22
ультрацентрифугирование - 2000 1,06 ± 0,64 0,53 1
сыворотка - 72 1.23 ± 0.58 17 32 22

Таблица 1. Полную РНК экстрагировали из образцов сыворотки от здоровых добровольцев анализировали с Bioanalyzer (N = 4 для всех условий).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Наиболее важные шаги для успешного выделения подгрупп внеклеточных пузырьков являются: 1) хороший выбор бумаги; 2) стабильное и высокий уровень охвата молекул захвата на поверхности бумаги волокон; 3) правильное обращение с образцами; и 4) общая лаборатория гигиены практика.

Пористые материалы были использованы во многих недорогих и оборудования свободной анализов. Они могут иметь настраиваемый размер пор, универсальные возможности, низкая стоимость и высокое соотношение площади поверхности к объему, позволяющий пассивный затекание жидкости. Мы выбрали хроматографии целлюлозной бумаги 1-й класс в основном для его надлежащего размера пор и низкой адсорбции белка. По сравнению с другой обычно используемый пористых материалов, нитроцеллюлозы, целлюлозная бумага имеет гораздо ниже, неспецифический адсорбции белка 34. Мы также считаем, немного неспецифическую захват электромобилей в этом исследовании. Кроме того, его уровень удерживания частиц, мкм 11, больше, чем размер электромобилей 35, что позволяет конкретного захвата впротивопоставить физическому захвату электромобилей. Здесь мы сосредоточиться на электромобилей меньшего размера, передавая образцы сыворотки через фильтр 0,8 мкм, которые шаг может быть изменена, когда более крупные электромобилей должны быть изучены.

Химическая модификация поверхности может быть ключом к достижению стабильного и высокого охвата молекул захвата на поверхности в качестве средства повышения эффективности изоляции EV. Модификация поверхности целлюлозы были рассмотрены 36,37. Есть большое число гидроксильной (-ОН) группы на поверхности целлюлозы, и они могут вступать в реакцию с силаном с получением стабильно химические Si-OC связи после активации плазмой кислорода или другого процесса конденсации. Силан, используемый в этом исследовании, является (3-меркаптопропил) триметоксисилан, (MeO) 3 Si-(СН2) 3 -SH. Тиол (-SH) группы могут реагировать с GMBS, чтобы обеспечить короткое плечо (0,73 нм) и сшивающей группы, что пары с первичными аминами. Молекулы Захват с аминогруппами могут быть конъюгированыв GMBS напрямую. В этом исследовании, однако, мы конъюгированный NeutrAvidin вместо того, чтобы обеспечить общую схему сопряженных различные молекулы захвата, которые биотин-маркировки. Тем не менее, консенсус по EV подтипа конкретных маркеров до сих пор не достигли 17. NeutrAvidin имеет очень сильное сродство с биотином и почти нейтральный изоэлектрической точки (рН 6,3), минимизируя неспецифические взаимодействия с отрицательно заряженными объектами, например, поверхности электромобилей. В отличие от этого, авидин с изоэлектрической точкой 10,5 несет положительный заряд при нейтральном рН. Более высокая концентрация анти-CD63 антитела используется, чем в Chen и др. 20, в основном, из-за небольшого объема приложенной и увеличения отношения поверхности к объему бумаги устройства. Тем не менее, количество и композиции белки, адсорбированные на бумажных волокон не были охарактеризованы, которые могут быть выборки зависит. Таким образом, необходимо позаботиться при интерпретации результатов анализа белка.

Собранные бигические образцы должны быть обработаны аккуратно и быстро обрабатывается, чтобы предотвратить artifactually повышенные уровни EV. Рекомендуется, чтобы удалить клетки и тромбоциты, если таковые имеются, перед хранением при -80 ° С. Ток стандартизация обработки проб в исследовании Е.В. можно найти в этом обзоре 17.

Должны быть использованы правильной лабораторной практики гигиены. Всегда надевайте перчатки и меняйте перчатки часто, чтобы свести к минимуму введение частиц пыли и рибонуклеаз. Выделение РНК из электромобилей в культуральных средах с кондиционером клеток может привести к образованию более чем в 70 раз более высокие концентрации используется бумага устройств по сравнению с экстрагировали из электромобилей концентрировали с использованием метода Ультрацентрифуга (не опубликовано).

Протокол, описанный здесь использует целлюлозной бумаги устройства модифицированные химически с молекулами захвата, чтобы изолировать различные подгруппы электромобилей. Метод прост, эффективен, и особенно ценно, когда объем образца ограничен.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Тайваньского Национального научного совета grants- НСК 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) и НСК 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) и Генерального ветеранов Больницы и системы высшего образования Тайваня совместной программы исследований (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter