Abstract
从神经变性疾病造成机车的缺陷可以是疾病的晚期发作症状，随后的几年亚临床变性的，因此目前的治疗策略是不能治愈。通过使用全基因组测序的，越来越多的基因已被确定，以在人类运动的作用。尽管确定这些基因中，它是不知道这些基因如何是至关重要的正常机车运作。因此，可靠的测定法，其利用模式生物以阐明，以便确定治疗性利益的新靶标，这些基因的作用，需要比以往更。我们设计了负趋地性测定在先允许对较温和的缺陷的检测，并具有随着时间的推移，以评估这些缺陷的能力的致敏版本。在玻璃进行测定量筒中，被密封与蜡阻挡膜。通过提高门槛的距离要攀升至17.5Ç米和增加实验的持续时间为2分钟，我们观察到在检测温和流动性功能障碍更大的灵敏度。该测定是成本有效的，不需要大量的训练，以获得高度可重复的结果。这使得它一个很好的技术来筛选候选药物在果蝇突变体运动缺陷。
Introduction
破坏性神经变性疾病如帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，和遗传性痉挛性截瘫日益认识到。不幸的是，大多数这些神经变性疾病的仍然没有治疗方法。的广泛临床应用的全基因组，无偏基因测试，如全基因组测序已导致了越来越多的基因受到牵连在人类运动障碍。尽管这样的进步，从早期到晚期的病理进展，仍然难以在这些疾病。 果蝇提供一个具有遗传工具来研究基因在需求控制的空间和时间的方式。此外， 果蝇已经证明在筛选药物对神经系统疾病，如帕金森氏1，阿尔茨海默2，智力障碍3,4-和癫痫5,6-等等是有用的。我们的目标是建立一个符合成本效益可靠的检测，将允许高通量分析，将仍然非常敏感，可以检测电机性能的微小变化。
有用于量化对果蝇攀登行为的基因突变和/或环境条件的影响几个实验。大多数的测定的利用苍蝇爬，称为负趋地性，或攀登测定的自然趋势。本泽7在1967年提出，用于趋光性的研究逆流装置也可以用来研究gravitaxis。自那时以来，Ganetsky 8和许多其他9 -12已经建立在初始测定。其原理是放置在小瓶中的苍蝇的已知数量和强烈挖掘小瓶在硬表面上，造成苍蝇下降到小瓶的底部。因为它是一个先天行为，苍蝇将试图攀爬到小瓶的顶部，相对的重力。该测定是定量的测量仪表水库有多少苍蝇在一个规定的时间段过去攀上小瓶标记。速度，而不是对苍蝇攀登总数的测量已成为一个可靠的参数和的情况下的苍蝇准则的数目并不显著13中所示的缺陷。
攀登测定在许多神经变性疾病，包括帕金森氏病14的研究证明是有益的。然而，我们注意到，机车的缺陷未必在时间被检测到，其中神经变性是已经看到在病理研究14。因此，使用传统的测定法的可能限制，研究疾病发病的早期阶段的能力。机车缺陷在以后的病理阶段的出现可能反映了其疾病进展是太先进完整的救援。
这就提出了与传统的攀登测定的灵敏度的潜在问题。的俗的电位不能tional爬坡法检测温和机车缺陷可以归因于向其中的苍蝇都需要攀登高度。传统的试验15,16措施蝇的数目，成功地翻越2至5厘米的高度在10至20秒。
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Protocol
研究果蝇在遵守阿尔伯塔省的研究准则大学。
1.收集飞行
- 收集20苍蝇使用CO 2（克）麻醉并置于含有食品25毫米×95毫米收集瓶中。
- 含蝇水平商店小瓶，以避免在那些在底部积聚小瓶任何液体捕集苍蝇。
- 在22℃在培养箱中孵育苍蝇为至少21小时，在45％的湿度下约15小时。以12小时光照设置孵化器：黑暗周期。
2.登山分析
- 第二天早上，转移20苍蝇从单一到小瓶250毫升的玻璃量筒。标记滚筒的位置，以保持它恒定日常生活。使用每个基因型一层玻璃圆筒，以防止基因型之间的交叉污染。在每个实验和RO的清洗结束基因型之间优化射孔他们。
- 进行中的环境光的实验（或红光是否有视力潜在缺陷）在温度和湿度为22℃和40％分别。为了避免昼夜节律惊慌失措，总是在每天的同一时间进行实验。
- 密封圆筒的顶部用阻挡膜（蜡膜），以防止任何苍蝇的逃逸（ 图2）。
- 设置在三脚架上的摄像机。在190毫升线的250毫升对焦摄像头量筒（17.5厘米）。
- 计数死蝇数在圆筒的底部，并在食品小瓶中。记录该号码作为死亡率。
- 很轻多次敲击对闭孔泡沫垫气缸以足够的力量以置换苍蝇的内底表面。轻按5 - 10倍，而用另一只手按在相机上记录。
- 按相机上的“录制”按钮。
- 启动VIDEO相机记录和挖掘缸六次在不同的非节奏模式。
- 进行每次试验用于从苍蝇最后抽头的时间2分钟，并记录蝇渡17.5厘米（190毫升）中选择每个时间点（量化每10秒）的高度的数量。注意：毫升标记在缸体会有所不同，从一个气缸模型到另一个视直径。为了避免错误，测量所用每个气缸的高度。
- 一旦审判已经结束，处理苍蝇在95％乙醇。
- 重复步骤2.1至2.9，直到所有的重复每次都过测试，新鲜苍蝇。
注：虽然5次重复可能足以与具有运动有很强的影响的突变，20蝇（200苍蝇）的10次生物学重复，建议检测更小的差异。 - 在实验完成后，洗气瓶在实验室洗碗机和干燥O / N被重新使用。
3.分析
- ANALY每个视频泽飞试验。每10秒，记录果蝇通过目标线的总数。
- 如果一只苍蝇爬上回落或下降，飞为-1和记录算下飞行越过目标线为相同数量的攀升是回落或下降飞。例如，如果在15 日飞落在目标线下方，下一飞越线（16 日飞）被认为是15 日飞，而不是16 个 。
- 从苍蝇（20）的总人数减去死亡获得苍蝇停留在试验的数量。在每个时间点，获得蝇目标线以上的分数。
- 绘制每个百分比在每个时间点（参见图3）。
- 在120秒的数据点进行分析的性能和执行学生t检验时2基团存在或ANOVA和一个检测后多重比较（和Bonferroni修改为计划和Tukey计划外协mparisons）。柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫测试17也进行确定正态性和方差相等，但也给突变组的分布比较控制。
- 呈现的数据过时效，画出蝇的百分比在120秒苍蝇不同年龄的攀爬（2天，1周，2周），以查看是否有一个渐进赤字（ 图4）。
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Representative Results
攀岩是一个强大的和可重复的行为。事实上，有一天老野生型果蝇达到目标的距离爬坡性能迅速（25 - 30秒）。突变果蝇呈现范围从轻微（或延迟）的性能来完成无力攀登到目标。我们说明这个这里有两个不同的突变等位基因。第一个是由一个完全缺失的spastin基因（温泉5.75）18的基因spastin的一个严重的等位基因。在这条线（5.75温泉与TM6b）一天的小苍蝇甚至2分钟后达不到WT爬坡性能。这种突变线介绍与使用小瓶方法（ 图1A，B），甚至当严重的缺陷。对于相同的基因，但与由同组（温泉17-7与TM3）18公布的不完全缺失研究的突变体，当这里提供的方法的优点变得更加明显。在这种情况下，性能达8天是正常的（ 图1C-F 图3）或遗传相互作用的结果。为了进一步证明，包括行为与表现型野生型蛋白的研究基因表达的救援。对于相互作用的研究，比较苍蝇是杂合的利息苍蝇，只有有兴趣一个突变的突变两种。该测定法还允许一个监视的攀登缺陷的进展随时间，在造型渐进运动障碍（ 图4）的一个重要方面。此外，2分钟允许更好地看到攀爬在严重的突变体的进展。
图不同攀登测定法1.比较。对于严重的突变不同程度的攀爬缺陷可使用各种方法，但更温和的突变可以看出可以不与某些测定法进行检测。为了证明这一点，我们使用了两种出版突变品系的基因spastin：spastin 5-75其中包含一个完整的缺失spastin基因和spastin 17-7包含spastin基因的部分缺失的（A）首先，攀登评估通过具有蝇攀登到一个空的食品小瓶的顶部。苍蝇在后18秒内的顶部的数目被记录下来。使用这种协议的显著缺陷被认为是在Spast 5-75 / TM6b相比野生型对照（N = 10，P <0.001）。（B）接着，爬坡性能是使用这里描述的方法进行评估。登山也是ð efective在同基因型Spast 5-75 / TM6b。在性能上的差异是非常显著（N = 5，P <0.001），但在性能上的间隙较大。为显示出具有较少影响的思想的突变（ 例如，Spast 17-7包含spastin基因的部分缺失），这里提出的气缸方法可以是更敏感。（℃）否显著缺陷与3天大spast 17-7观察与药瓶方法/ TM3（N = 5）。（D）的无显著缺陷观察与3天大spast 17-7 / TM3与缸方法（N = 5）。（E）的非统计趋势指出8日龄spast 17-7 / TM3蝇（N = 5）。（F）的但意义观察8天龄spast 17-7 / TM3与汽缸方法提出了重复的相同数量（N测试= 5，P <0.001）。rget =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
实验的图2的示意图设置。20苍蝇被插入在一个玻璃筒，然后用蜡阻挡膜封端。苍蝇，然后轻拍底部和苍蝇穿越用相机120秒记录中线的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。
攀登实验的图3代表性的结果。蝇的百分比已经通过阈值线表示每10秒在durati对测定的。在该实验中，3基因适当的对照（野生型，UAS 温泉 -RNAi / + ELAV-GAL4 / +）进行比较，以转基因果蝇含有UAS和Gal4的组分（ELAV-GAL4 / UAS 温泉 -RNAi）。该UAS SPAS-RNAi是从VDRC＃108739。这种表示允许攀登每个基因型率的评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.为老化轮廓代表图。由于许多机车的病症是渐进的，以描绘随时间演变是重要的。在该图中，WT苍蝇相比在2天（A）和8天后杂突变体（水疗/ WT）和反式-杂突变体（spast5-75 / spast17-7）（B）的（N = 10，P <0.001）。结果也示出在一段时间内的120秒。时间点（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
果蝇已经被证明是在帕金森氏病14和其他神经变性病症1,2-极好模型。除了 在果蝇中可用的遗传工具，其基因组中是高度保守的对参与神经障碍19基因。全基因组基因筛查方法（包括全外显子组测序）的出现很可能继续提供与人类运动障碍相关的候选基因较大名单。的治疗这些疾病的发展将需要的动物模型，以增加我们涉及神经变性的早期阶段的病理学的理解。使用果蝇和负趋地性测定提供了一种廉价和可靠的方法来鉴定参与机车缺陷基因，并随后筛选表型救援候选药物。这增加了分子，电，和成像样张吨帽也可以在相同的动物模型中获得。使用登山法，其他人复制成功在果蝇突变电机缺陷的基因破坏人类运动。然而，先前的研究已经表明，病理变化可以通过数天14先于机车的缺陷的检测。这种现象也观察到在我们讲的亚临床改变人类的神经退行性疾病。我们相信，通过了解并处理这些变化的亚临床，疾病的修改将大大提高。
我们在座的一种模式，允许轻微运动的缺陷，可能有助于理解从“症状前对症”利用果蝇模型的神经退行性病变的通道检测功能。许多团体已经使用了一个短距离爬坡（5-10厘米），但是，我们增加了距离17.5 CM AS在帕拉迪诺等人。20。但这种差异之间攀登高度似乎很小，增加的高度的目的是要增加该测定的难度，从而有助于在相对较小的攀登缺陷的识别。此外，一些方法选择照亮与光纤灯圆筒的顶部，采取成年果蝇的phototaxic响应的优点。然而，光源可引起气缸内的光反射;因此，漫开销荧光光源来代替。另外，突变涉及神经变性的基因可能会影响眼睛的功能，因此偏压的结果。从10至20的苍蝇在样品量的增加提高了每次试验的统计功效。最初，我们增加了该编号，以高达30苍蝇，但后来为了尽量减少苍蝇之间拥挤和相互作用效果降低。样品被丢弃在单次使用后，而不是被运行每个样品4重复试验中，以消除在possibility学习或疲劳。由于苍蝇与爬坡性能极差，这是适得其反记录越过目标线所需苍蝇的50％的时候，它可能需要相当长的时间，这个标准来实现。相反，苍蝇分别给予2分钟的持续时间跨越所述目标线。记录蝇越线的数目和分级在10秒的增量，将所得值用百分数表示。
这些条件是创造一个成年果蝇的爬坡能力，更灵敏的评估。同时测定的其他设计仍然是有用的，这种模式可能会在初期有轻度缺陷的调查情况进行审议。另外，该测定可帮助检测在药物试验的背景下更小的变化。
一个重要的问题是，负趋地性行为基于苍蝇被窃听到缸的底部。这是theref矿石重要评估其它形式运动的，如在一个平面上或飞行。其他方面，如动机和社会交往需要被视为潜在的变乱。另一个需要注意的是，提出的分析只允许一个评估成蝇的运动。这限制了获得神经病理相关因素为所观察到的行为是在理解疾病的发病机理非常重要的能力。事实上，大多数神经影像学工作已经完成，在幼虫神经肌肉接头处至今在果蝇 。在获得运动幼虫的行为可能是为了吸引行为和病理变化之间的直接关系的重要一步。
这是非常重要的是控制温度和湿度，在该飞虫被升高和测试。除了上飞发展的影响，这些因素对提出并存储在非理想条件的苍蝇的爬坡能力具有重要的影响。在p增加静电或湿度resence，苍蝇没有达到最佳性能。这种效果是不相等的，所有的基因型，突变果蝇通常被更受这些因素比对照组。此外，气缸需要被清洗和各实验之间适当干燥。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
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