Abstract
神経変性疾患に起因する機関車の欠陥は、無症候性変性の年後に、疾患の遅発性の症状であることができ、したがって、現在の治療の治療戦略は治癒的ではありません。全体exomeシーケンスを使用することにより、遺伝子の増加は、ヒトの移動において役割を果たすことが同定されています。これらの遺伝子の同定にもかかわらず、これらの遺伝子は、正常な機関車の機能に重要であるかは知られていません。そのため、治療目的の新規標的を同定するために、これらの遺伝子の役割を解明するためのモデル生物を利用し信頼性の高いアッセイは、これまで以上に必要とされています。我々は以前より穏やかな欠陥の検出を可能にし、時間をかけてこれらの欠陥を評価する能力を有する負の走地性アッセイの感作されたバージョンを設計しました。ガラス中で行われるアッセイは、ワックスバリアフィルムで封止されているシリンダー、メス。閾値距離を増加させることによって、17.5℃に上昇させます私たちは穏やかなモビリティ機能障害を検出するのに高い感度を観察している2分の実験期間をMと増加。アッセイは、費用対効果がされており、再現性の高い結果を得るために広範囲の訓練を必要としません。これは、運動欠陥のショウジョウバエの変異体では、候補薬剤をスクリーニングするための優れた手法になります。
Introduction
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および遺伝性痙性対麻痺のような壊滅的な神経変性疾患は、ますます認識されています。残念ながら、これらの神経変性疾患のほとんどは、治療せずに残っています。このような全体exomeシーケンシングなどのゲノムワイドな、公平な遺伝子検査の広範な臨床使用は、ヒト機関車の障害に関与している遺伝子の数の増加につながっています。この進歩にもかかわらず、初期後期への病理学的進行は、これらの疾患でとらえどころのないままになります。 ショウジョウバエは、制御された空間及び時間的に遺伝子の要件を研究するための遺伝的ツールとのうちの1つを提供します。また、 ショウジョウバエは、パーキンソン1、アルツハイマー2、知的障害3,4およびとりわけてんかん5,6などの神経学的状態のための薬剤のスクリーニングに有用であることが証明されました。私たちの目的は、効果的なコストを開発することでしたまだモータ性能の小さな変化を検出するのに十分な感度であろう、高スループット分析を可能にする信頼性の高いアッセイ。
ショウジョウバエクライミング挙動に関する遺伝子変異及び/又は環境条件の影響を定量化するために使用されるいくつかのアッセイがあります。アッセイのほとんどは負の走地性、またはクライミングアッセイとして知られて登るハエの自然な傾向を生かします。 Benzer 7は走光性の研究のために使用されるカウンター現在の装置はまた、重力走性を研究するために使用することができることを1967年に提案しました。それ以来、Ganetsky 8および他の多くの9 -12は最初のアッセイ上に構築されてきました。原理は、バイアルにハエの既知の数を配置し、ハエがバイアルの底に落下させ、硬い表面に対して強くバイアルをタップすることです。それは生得的行動であるように、ハエは、重力に反対し、バイアルの上部に登るしようとします。このアッセイは、定量的およびmeasuです割り当てられた時間期間の間に、バイアル上のマーカーを越えて上昇しているどのように多くのハエのres。代わりにハエクライミングの総数の速度の測定は、信頼性の高いパラメータとなり、ハエの基準の数は13に有意ではなかった場合の欠陥を示しています。
クライミングアッセイは、パーキンソン病14を含む多くの神経変性疾患の研究に有用であることが証明されました。しかし、我々は、機関車の欠陥は、神経変性が既に病理学的研究14に見られる時に検出されない場合があることに留意しました。したがって、従来のアッセイの使用は、疾患の発症の初期段階を研究するための能力を制限することができます。病理学の後の段階の間に機関車の欠陥の外観は、その進行の完全な救済のためのあまりに高度である疾患を反映することができます。
これは、従来のクライミングアッセイの感度を持つ潜在的な問題を提起します。 tradiの潜在的なことができないこと軽度の機関車の欠陥を検出するため的なクライミングアッセイはハエを登るために必要とされた高さに帰することができます。正常に10〜20秒で2〜5センチメートルの高さを乗り越えるために、従来のアッセイ15,16対策ハエの数。
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Protocol
キイロショウジョウバエの研究は、アルバータ州の研究指針の大学を遵守していました。
1.フライコレクション
- 食品を含む25ミリメートルX 95ミリメートルの回収バイアル中のCO 2（g）の麻酔と場所を使用して、20ハエを収集します。
- 水平にハエを含むストアバイアルは、バイアル底に蓄積する可能性のある液体でハエをトラップ避けるために。
- 約15時間、インキュベーター中で45％の湿度で22℃で少なくとも21時間、ハエをインキュベートします。暗サイクル：12時間の明とインキュベーターを設定します。
2.クライミングアッセイ
- 翌朝は、メスシリンダー250mlのガラスに単一バイアルから20ハエを転送します。それを一定の日常を維持するために、シリンダの位置をマークします。遺伝子型間の交差汚染を防止するために、遺伝子型ごとにガラスシリンダーを使用してください。各実験及びROの最後に洗います遺伝子型との間でそれらをテート。
- 温度22℃、湿度40％であった（視覚の潜在的な欠陥がある場合、または赤色光）は、周囲の光の中で実験を行います。概日リズムの交絡を回避するために、常に一日の同じ時間に実験を行います。
- 任意のハエ（ 図2）の漏れを防止するためのバリア膜（ワックスフィルム）とシリンダーの上部をシール。
- 三脚にビデオカメラを設定します。 250ミリリットルの190ミリリットルライン上の焦点カメラは、シリンダ（17.5センチメートル）を卒業しました。
- シリンダーの底部に、食品バイアルに死んだハエの数をカウントします。死亡率としてこの番号を記録します。
- 非常に軽く内側底面にハエを変位させるように十分な力で繰り返しクローズドセルフォームパッドに対してシリンダーをタップします。カメラの記録を押すようにもう一方の手を使用しながら10回 - 5をタップします。
- カメラの「録音」ボタンを押してください。
- VIDを開始EOカメラ記録とは別個の非リズミカルなパターンでシリンダーを6回タップします。
- ハエが最後のタップされた時点から2分間各試験を実施し、選択した各時点で17.5センチメートル（190ミリリットル）（10秒ごとに定量化）の高さを横切るハエの数を記録します。注：シリンダーのマーキングミリリットルを直径に応じて、1気筒モデルから別のものに変化します。エラーを回避するには、使用される各気筒の高さを測定します。
- 裁判が終わった後、95％エタノールにハエを処分。
- すべての複製が新鮮なハエとするたびにテストされるまで繰り返して、2.9に2.1を繰り返します。
注：5の複製は、変異が運動に強い影響を持つ十分であるかもしれないが、20ハエ（200ハエ）の10の生物学的反復は、より小さな差を検出することをお勧めします。 - 実験の完了後、再使用する実験用食器洗い機、乾燥O / Nでのシリンダを洗浄します。
3.分析
- ANALY各フライ試験のZE動画。各10秒は、ターゲットラインを通過したハエの総数を記録します。
- フライバックダウン登っまたは低下した場合、-1のように飛ぶし、レコードはバックダウン登ったり下ったハエと同じ数として目標ラインと交差するように、次のフライを数えます。 15 番目のフライが目標ラインを下回った場合、（16 番目が飛ぶ）ラインを通過する次のハエは、15 番目、16番目を飛行していないと考えられています。
- 裁判に残るハエの数を得るために、ハエ（20）の合計数から死亡を引きます。各時点で、ターゲット·ラインの上のハエの画分を得ました。
- 各時点での各割合をプロットする（ 図3参照 ）。
- 120秒のデータポイントでパフォーマンスを分析し、2基が存在する場合、またはANOVAとボンフェローニ修正と多重比較のための事後テストは、（計画および計画外の共同のためのテューキーのためのスチューデントt検定を行いますmparisons）。コルモゴロフ-スミルノフ17はまた、正規と同等の分散を確認するために行われるだけでなく、コントロールに変異群の分布を比較するためにテストします。
- 、老化を介してデータを現在進行赤字（ 図4）があるかどうかを確認するために、異なる年齢のハエで120秒に（2日、1週間、2週間）を登るハエの割合をプロットします。
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Representative Results
登山は強く、再現可能な動作です。 （ - 30秒25）実際、1日齢の野生型ハエが急速に目標距離クライミング性能に達します。変異体ハエがターゲットに登ることができないことを完了するために、穏やかな（または遅延）からパフォーマンスの範囲を提示します。我々は2つの異なる突然変異対立遺伝子とここにこれを説明します。最初のものはspastin遺伝子（温泉5.75）18の完全な欠失によって引き起こされる遺伝子spastinの深刻な対立遺伝子です。この行で（TM6bと温泉5.75）1日齢のハエも、2分後に、WTクライミングのパフォーマンスに到達しません。この変異体のラインは、バイアル法（ 図1A、B）を使用していても重度の欠陥を呈します。同じ遺伝子のためのが、同じグループ（スパTM3と17-7）18によって公開不完全な欠失を有する変異体を研究する際に、ここで提示された方法の利点は、より明白になります。その場合、8日間の性能アップが正常（ 図1C-Fであります図3）、または遺伝的相互作用の結果であることが保証されます。さらに証拠のために、研究のための遺伝子野生型タンパク質の発現と行動表現型の救済があります。相互作用の研究のために、唯一の目的の一つの変異を持つハエと利益の両方の変異についてヘテロ接合でハエを比較します。アッセイはまた、一つの時間をかけて登山 欠陥の進行をモニターすることを可能にするプログレッシブ運動障害（ 図4）をモデル化する上で重要な側面。また、2分、より良い深刻な変異体では登山の進行状況を確認することができます。
別の登山アッセイの図1の比較。重度の変異のために欠陥を登るの異なる度合いは様々な方法を使用して見ることができますが、より穏やかな変異は、いくつかのアッセイで検出されないことがあります。 spastin遺伝子の部分欠失を含むspastin遺伝子とspastin 17-7の完全な削除を含むspastin 5-75（A）まず、登山が評価されています。これを実証するために、我々は、遺伝子spastinのための2つの公開された変異体のラインを使用していました。ハエを持っていることによって、空の食品バイアルの一番上に登ります。 18秒後に上部にハエの数が記録されています。重要な欠陥がSpast 5-75に見られるこのプロトコルを使用/ TM6b野生型対照と比較した場合（N = 10、p <0.001）。（B）次に、性能を登ることは、ここで説明した方法を用いて評価されます。クライミングもDであります同じ遺伝子型Spast 5-75 / TM6bでefective。性能の差は非常に有意である（N = 5、p <0.001）が、パフォーマンスのギャップが大きくなります。少ない効果思想（ 例えば、Spast 17-7は spastin遺伝子の部分欠失を含む）を有することが示さ変異については、ここで紹介するシリンダー方法がより敏感である可能性がある。（C）は有意な欠陥は3日齢spast 17-7で観察されませんバイアル方法と/ TM3（N = 5）。（D）有意な欠陥は、（N = 5）は、シリンダ方式で3日齢spast 17-7 / TM3で観察される。（E）は 、非統計的傾向が注目されます8日間古いspast 17-7 / TM3が飛ぶ（N = 5）。（F）でも有意性は、古いspast 17-7 / TM3は複製の同数（N =ために提示シリンダー法で試験し、8日間観察されます5、p <0.001）。目標確認= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
実験設定の図2模式図。20ハエがガラスシリンダー内に挿入した後、ワックスバリアフィルムで蓋をされています。ハエは、その後、底部にタップされており、正中線を横断するハエの数は、120秒間カメラを用いて記録されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
登山実験の図3.代表的な結果。ハエの割合が閾値ラインをdurati上で10秒ごとに表現され通過しましたアッセイの上。この実験では、3遺伝的に適切なコントロール（野生型、UASのスパ -RNAi / +、ELAV-GAL4 / +）はUASおよびGal4のコンポーネント（ELAV-GAL4 / UASのスパ -RNAi）の両方を含むトランスジェニックハエと比較されます。 UAS温泉-RNAiはVDRC位108739からです。この表現は、各遺伝子型のために登るの速度の評価が可能になる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
高齢化プロファイル図4.代表的なグラフ。多くの機関車の障害は、進行しているので、時間をかけて進化を表現することが重要です。このグラフでは、WTハエを2日間（A）および8日目（B）におけるヘテロ接合変異体（スパ/ WT）およびトランスヘテロ接合変異体（spast5-75 / spast17-7）と比較され（N = 10、p <0.001）。結果は、120秒間の時間をかけて描かれています。時点（C）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエはすでにパーキンソン病14および他の神経変性条件1,2に優れたモデルであることが証明されました。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールに加えて、そのゲノムは非常に神経疾患19に関与する遺伝子のために保存されています。 （全体exomeシーケンシングを含む）ゲノムワイド遺伝子スクリーニング法の出現は、人間の運動障害に関連する候補遺伝子の大きなリストを提供し続ける可能性が高いです。これらの条件のための治療法の開発は、神経変性の初期段階に関与する病理学の我々の理解を高めるために、動物モデルが必要になります。 ショウジョウバエの使用と負の走地性アッセイは、機関車の欠陥に関与する遺伝子を同定し、その後の表現型の救済のための候補薬剤をスクリーニングする、安価で信頼性の高い方法を提供します。これは、分子、電気生理学的に加算して、撮像証明T帽子は、同じ動物モデルで得ることができます。クライミングアッセイを使用して、他は正常人の運動を破壊遺伝子についてハエ突然変異体における運動欠陥を再現しています。それにもかかわらず、これまでの研究は、病理学的変化は、数日間14で機関車の欠陥の検出に先行することが示されています。この現象はまた、我々は無症状の変化を話す人の神経変性疾患において観察されます。我々は理解し、これらの無症状の変化を処理することにより、疾患修飾が大幅に改善されるだろうと考えています。
ここでは、ショウジョウバエモデルを用いて神経変性病状の「症候性の前駆症状」からの通路の理解を助けることができる軽度の運動欠陥の検出を可能にするモデルを提示します。多くのグループが短い登山距離（5〜10センチ）を使用しているが、我々はパラディーノらで17.5 cmの距離を増加させた。20。この違いが、高さはマイナー見えるかもしれませんが、登山の間に、高さの増加は、それによって、比較的マイナーな登山欠陥の識別を補助する、検定の難易度を高めることを意図していました。また、いくつかの方法は、大人のショウジョウバエのphototaxic応答を活用するために、光ファイバランプ付きシリンダーの上部を照らすことにしました。しかし、光源は、シリンダ内の光の反射を引き起こす可能性があります。従って、拡散オーバーヘッド蛍光光源が代わりに使用されます。また、神経変性に関与する遺伝子の変異は、目の機能に影響を与えるため、結果にバイアスをかけることができます。 10〜20ハエからサンプルサイズの増加は、各試験の統計的な電力を増加させます。最初に、我々は30ハエと高いこの数を増加させ、それはその後、ハエの間の過密との相互作用の影響を最小限にするために減少しました。サンプルは、pを除去するために、むしろサンプルごとに4つの反復試験のために実行されているよりも、一回の使用後に廃棄されています学習や疲労のossibility。非常に悪いクライミング性能を持つハエのために、それがこの基準が満たされるのをかなりの時間がかかる可能性があるため、ターゲットラインを通過するハエの50％に必要な時間を記録するために逆効果でした。むしろ、ハエは目標ラインと交差するように2分の時間を与えました。行を横断するハエの数を記録し、10秒単位でビン化し、得られた値を百分率で表しました。
これらの条件は、大人のハエの登山能力のより感度の高い評価をされている作成します。アッセイの他のデザインはまだ有用であるが、このパラダイムは軽度の初期の欠陥を調査する場合に考慮することができます。さらに、このアッセイは、薬物試験の状況において小さな変化を検出に役立ち得ます。
重要な問題は、負の走地性の動作をシリンダの底部にタップされているハエに基づいていることです。それはtherefですこのような平坦な表面や飛行上のような運動の他の形態を評価するための重要な鉱石。このような動機と社会的相互作用などの他の側面は、潜在的な交絡として考慮される必要があります。もう一つの注意点は提示アッセイは一方のみが成虫に運動を評価することを可能にするということです。これは、疾患の病因を理解する上で非常に重要である観察行動の神経病理学的な相関を得る能力を制限します。実際、ほとんどの神経画像の作品は、これまでにショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部で行われています。幼虫で歩行動作を取得することは行動と病理学的変化との間に直接的な相関関係を描くための重要なステップであってもよいです。
これは、温度およびハエが上昇して試験されるときの湿度を制御することが非常に重要です。ハエの発達に対する効果に加えて、これらの要因が発生し、非理想的な状態で保存されたハエの登坂能力に重要な影響を与えました。 P IN増加静電気や湿度のresenceは、ハエが最適に実行されませんでした。この効果は、変異ハエは、通常、複数のコントロールよりも、そのような要因に影響され、すべての遺伝子型のために等しくありませんでした。また、シリンダは各実験の間に適切に洗浄し、乾燥する必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
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