Kvantitativ analys av Klättring Defekter i en Drosophila modell av neurodegenerativa sjukdomar

Abstract

Locomotive defekter till följd av neurodegenerativa sjukdomar kan vara en sen debut symptom på sjukdomen, efter år av subklinisk degeneration, och därmed nuvarande terapeutiska behandlingsstrategier är inte botande. Genom att använda hela exome sekvensering, har ett ökande antal gener har identifierats att spela en roll i mänsklig förflyttning. Trots att identifiera dessa gener, är det inte känt hur dessa gener är avgörande för normal lok funktion. Därför är en tillförlitlig analys, som utnyttjar modellorganismer för att klargöra vilken roll dessa gener i syfte att identifiera nya mål av terapeutiskt intresse, behövs mer än någonsin. Vi har utformat en aktiverad version av negativa geotaxis analys som gör det möjligt att upptäcka mildare defekter tidigare och har förmågan att utvärdera dessa brister över tid. Analysen utförs i en glas graderad cylinder, som är tillsluten med ett vax barriärfilm. Genom att öka den tröskeldistans som ska klättrade till 17,5 cm och öka experiment varaktighet till 2 min vi har observerat en större känslighet för att upptäcka milda rörlighet dysfunktioner. Analysen är kostnadseffektivt och inte kräver omfattande utbildning för att erhålla höggradigt reproducerbara resultat. Detta gör den till en utmärkt teknik för screening läkemedelskandidater i Drosophila mutanter med locomotion defekter.

Introduction

Förödande neurodegenerativa störningar såsom Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros, och ärftlig spastisk paraplegi är allt mer uppenbart. Tyvärr har de flesta av dessa neurodegenerativa störningar är fortfarande utan behandlingar. Den utbredda kliniska användningen av genomet hela, objektiva genetiska tester såsom hela exome sekvense har lett till ett ökat antal gener som inblandad i humana lok sjukdomar. Trots dessa framsteg, den patologiska utvecklingen från början till sena stadier, är fortfarande instabil i dessa sjukdomar. Drosophila ger en med de genetiska verktyg för att studera gen krav på ett kontrollerat rumsliga och tidsmässiga sätt. Dessutom har Drosophila visat sig användbar vid screening läkemedel för neurologiska sjukdomar såsom Parkinsons ^1, Alzheimers ^2, utvecklingsstörning ^3,4 och epilepsi ^5,6 bl. Vårt mål var att utveckla en kostnadseffektivoch tillförlitlig analys som skulle tillåta hög genomströmning analys som fortfarande skulle vara tillräckligt känslig för att upptäcka små förändringar i motorisk prestation.

Det finns flera analyser som används för att kvantifiera effekterna av genetisk mutation och / eller miljöförhållanden på Drosophila klättringsbeteende. De flesta av analyserna kapitalisera på den naturliga tendensen hos flugor att klättra, så kallade negativa geotaxis, eller klättring analysen. Benzer ⁷ föreslog 1967 att motströms apparat som används för att studera phototaxis också skulle kunna användas för att studera gravitaxis. Sedan dess har Ganetsky ⁸ och många andra ^{9 -12} bygger på den ursprungliga analysen. Principen är att placera ett känt antal flugor i en flaska och knacka flaskan kraftigt mot en hård yta, vilket gör att flugorna att falla till botten av flaskan. Eftersom det är en medfödd beteende, kommer flugorna försöker att klättra till toppen av flaskan, till skillnad från gravitationen. Denna analys är kvantitativ och measures hur många flugor har klättrat förbi en markör på flaskan under en tilldelad tidsperiod. Hastighetsmätning i stället för det totala antalet flugor klättring har blivit en pålitlig parameter och visat brister i de fall där antalet flugor kriterier var inte signifikant ^13.

Klättrings analysen har visat sig användbar i studien av många neurodegenerativa störningar inklusive Parkinsons sjukdom ^14. Men noterade vi att lokomotiv bristerna inte vara detekterbar vid tiden där neurodegeneration ses redan i patologiska undersökningar ^14. Således kan användningen av den traditionella analysen begränsar förmågan att studera de tidiga stadierna av sjukdomen patogenes. Utseendet på lok defekter under senare skeden av patologi kan återspegla en sjukdom vars utveckling är för avancerat för fullständig räddning.

Detta väcker ett potentiellt problem med känsligheten hos traditionella klättring analysen. Den potentiella oförmåga traditionella klättring analys för att detektera milda lokomotivdefekter kan tillskrivas den höjd till vilken flugorna måste klättra. De traditionella analysen ^15,16 mäter antalet flugor att framgångsrikt klättra över en höjd av 2 till 5 cm i 10 till 20 sekunder.

Protocol

Forskning om Drosophila melanogaster var i överensstämmelse med University of Alberta forsknings riktlinjer.

1. Fly Collection

1. Samla 20 flugor med hjälp av _{CO2 (g)} bedövning och plats i en 25 mm x 95 mm uppsamlingskärl innehållande mat.
2. Förvara flaskor innehållande flugor horisontellt för att undvika att fånga flugor i vätskor som kan ansamlas i botten av flaskan.
3. Inkubera flugor under minst 21 h vid 22 ° C vid 45% fuktighet i en inkubator under ca 15 h. Ställ inkubator med en 12 timmars ljus: mörker-cykel.

2. Klättring Analys

1. Följande morgon, överföra 20 flugor från en injektionsflaska i en 250 ml glas mätglas. Markera positionen för cylindern för att hålla den konstant varje dag. Använd en glascylinder per genotyp för att förhindra korskontaminering mellan de genotyper. Tvätta huden efter varje försök och rolätta dem mellan genotyper.
   1. Genomför experimenten i omgivande ljus (eller rött ljus, om det finns en potentiell defekt i syn) vid temperatur och fuktighet av 22 ° C och 40% respektive. För att undvika dygnsrytm FÖRBRYLLA, alltid utföra experiment vid samma tid på dagen.
2. Försegla toppen av cylindern med en barriärfilm (vax film) för att förhindra utsläpp av några flugor (Figur 2).
3. Ställ in videokameran på ett stativ. Fokus kamera på 190 ml raden i 250 ml mätcylinder (17,5 cm).
4. Räkna antalet döda flugor i botten av cylindern och i livsmedels ampuller. Spela detta nummer som dödligheten.
5. Mycket lätt knacka cylindern mot en stängd cellskumdyna upprepade gånger med tillräcklig kraft för att förskjuta flugorna till den inre bottenytan. Tryck 5 - 10 gånger medan du använder den andra handen för att trycka rekord på kameran.
6. Tryck på "Record" -knappen på kameran.
7. Starta VIDeo kamerainspelning och knacka cylindern sex gånger i en distinkt icke-rytmiska mönster.
8. Genomföra varje försök under 2 minuter från det att flugor senast knackade och registrera antalet flugor som korsar höjd på 17,5 cm (190 ml) vid varje tidpunkt valda (kvantifiera varje 10 sek). Obs: ml markeringen på cylindern kommer att variera från en cylindermodell till en annan beroende på diametern. För att undvika fel, mäta höjden på varje cylinder som används.
9. När prov har avslutats, att förfoga över flugor i 95% etanol.
10. Upprepa steg 2,1-2,9 tills alla replik har testats med färska flugor varje gång.
    Obs! Även om fem replikat kan vara tillräckligt med en mutation har en stark effekt på rörelse är 10 biologiska replikat av 20 flugor (200 flugor) rekommenderas för att upptäcka mindre skillnader.
11. Vid fullbordande av försöket, tvätta cylindrarna i labbet diskmaskin och torr O / N för att återanvändas.

3. Analys

1. Analyze videor av varje flyga rättegång. Varje 10 sekunder, registrera det totala antalet flugor som passerar mållinjen.
   1. Om en fluga klättrar ner och faller, rekord som flyger som -1 och räkna nästa fluga att passera mållinjen som har samma antal som i farten som klättrade tillbaka eller föll. Till exempel, om den ^{15: e} farten faller under mållinjen, nästa fluga att passera linjen ^{(16: e} flyga) anses vara den ^{15: e} farten och inte ^{16: e.}
2. Subtrahera dödligheten från det totala antalet flugor (20) för erhållande av antalet flugor som finns kvar i studien. Vid varje tidpunkt genom att hämta den fraktion av flugor ovanför mållinjen.
3. Rita varje procentenhet vid varje tidpunkt (se figur 3).
4. Analysera prestanda på 120 sek datapunkten och utföra elev t-test när 2 grupper är närvarande eller ANOVA och post-test för multipla jämförelser (med Bonferroni modifikation planerat och Tukey för oplanerade samarbetemparisons). Den Kolmogorov-Smirnov-test ¹⁷ ​​utförs också för att fastställa normalitet och lika varians men också för att jämföra fördelningarna av den mutanta grupp med kontrollen.
5. Att presentera data över åldrandet, rita andelen flugor klättring på 120 sek med flugor i olika åldrar (2 dagar, 1 vecka, 2 veckor) för att se om det finns en progressiv underskott (Figur 4).

Representative Results

Klättring är en stark och reproducerbar beteende. Faktum är att en dag gamla vild typ flugor nå målet avstånd klättring prestanda snabbt (25-30 sek). Mutant flugor presentera en rad prestanda från mild (eller fördröjd) för att slutföra oförmåga att klättra till målet. Vi illustrerar detta här med två olika muterade alleler. Den första är en allvarlig allel av genen spastin orsakas av en fullständig deletion av spastin genen (spa ^{5,75) 18.} I denna linje (spa ^5.75 med TM6b) en dag gamla flugor inte når WT klättring prestanda även efter 2 min. Denna mutantlinjen uppvisar allvarliga defekter även vid användning av ampullen metoden (figur 1 A, B). Fördelen med metoden som presenteras här blir tydligare när man studerar en mutant för samma gen, men med en ofullständig radering publicerad av samma grupp (spa ^17-7 med TM3) ^18. I så fall prestanda på upp till 8 dagar är normalt (Figur 1C-F (fig 3) eller genetisk interaktion. För ytterligare bevis, inkluderar räddning av beteende fenotypen med uttrycket av ett vildtypsprotein för genen studerades. För interaktionsstudier, jämför flugor som är heterozygot för både mutationer av intresse med flugor som bara har en mutation av intresse. Analysen ger också en att övervaka utvecklingen av klättring fel över tiden, en viktig aspekt i modellering progressiva störningar i rörelseapparaten (Figur 4). Dessutom, 2 min låt bättre se utvecklingen av klättring i svåra mutanter.

Figur 1. Jämförelse av olika klättring analyser. Vid svåra mutationer olika grader av klättring defekt kan ses med olika metoder, men mildare mutationer kan inte upptäckas med vissa analyser. För att demonstrera detta har vi använt två publicerade mutanta linjer för genen spastin:. Spastin ^5-75, som innehåller en fullständig deletion av spastin genen och spastin ^17-7, som innehåller en partiell deletion av spastin genen (A) det första är klättring bedömas genom att ha flugor klättra till toppen av en tom mat flaskan. Antalet flugor på toppen efter 18 sek registreras. Med hjälp av detta protokoll ett betydande fel ses i Spast ^5-75 / TM6b jämfört med vild-typ kontroller (N = 10, p <0,001). (B) Därefter klättrar prestanda bedöms med hjälp av den metod som beskrivs här. Klättring är också d efective i samma genotyp Spast ^5-75 / TM6b. Skillnaden i prestanda är mycket signifikant (N = 5, p <0,001), men skillnaden i prestanda är större. För mutationer visat sig ha mindre effekt tänkande (t.ex. Spast ^17-7 innehåller en partiell deletion av spastin gen), kan metoden cylinder presenteras här vara mer känsliga. (C) Ingen signifikant defekt observeras med 3 dagar gammal spast ^17-7 / TM3 med ampullen metoden (N = 5). (D) Ingen signifikant defekt observeras med 3 dagar gammal spast ^17-7 / TM3 med cylinder metoden (N = 5) (E). En icke-statistisk trend noteras med 8 dagar gammal spast ^17-7 / TM3 flugor (N = 5). (F) Men en betydelse observeras för 8 dagar gammal spast ^17-7 / TM3 testats med metoden cylindern presenterades för samma antal replikat (N = 5, p <0,001).rget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Schematisk representation av den experimentella upplägg. 20 flugor är införda i en glascylinder och därefter med ett vax barriärfilm. Flugorna sedan knackade till botten och antalet flugor som korsar mittlinjen registreras med hjälp av en kamera för 120 sek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Representativa resultat av klättrings experimentet. Andelen flugor som har passerat tröskellinjen representeras varje 10 sekund under de duratiom den analysen. I detta experiment, tre genetiskt lämpliga kontroller (vildtyp, UAS spa -RNAi / +, elav-GAL4 / +) jämförs med transgena flugor innehållande både UAS och Gal4 komponenter (Elav-GAL4 / UAS spa -RNAi). Yrkeshögskolan spa-RNAi är från VDRC # 108.739. Denna representation gör det möjligt att bedöma graden av klättring för varje genotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Representant graf för den åldrande profil. Eftersom många lok sjukdomar är progressiva, är det viktigt att beskriva utvecklingen över tid. I detta diagram är WT flugor jämfört med heterozygot mutanter (spa / WT) och trans-heterozygota mutanter (spast5-75 / spast17-7) på 2 dagar (a) och 8 dagar (B)(N = 10, p <0,001). Resultaten visas också över tiden för 120 sek. tidpunkt (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Drosophila har redan visat sig vara en utmärkt modell i Parkinsons sjukdom ¹⁴ och andra neurodegenerativa sjukdomar ^1,2. Förutom de genetiska verktyg som finns i Drosophila, är dess genom högkonserverad för gener som är involverade i neurologiska störningar ^19. Tillkomsten av genomet breda genetiska screeningmetoder (inklusive hela exome sekvense) kommer sannolikt att fortsätta att tillhandahålla en större lista över kandidatgener som är förknippade med de mänskliga rörelsestörningar. Utvecklingen av behandlingar för dessa tillstånd kommer att kräva djurmodeller för att öka vår förståelse av patologi involverade i de tidiga stadierna av neurodegeneration. Användningen av Drosophila och negativa geotaxis analysen ger en billig och pålitlig metod för att identifiera gener som är involverade i lok defekter och därefter screena läkemedelskandidater för fenotyp räddning. Detta bidrar till den molekylära, elektrofysiologiska och avbildnings bevis thatt kan också erhållas i samma djurmodell. Med hjälp av klättring analysen, har andra lyckats åter motoriska defekter i flugor mutant för gener som stör människors förflyttning. Ändå har tidigare forskning visat att patologiska förändringar kan föregå detektion av lokomotiv defekter med flera dagar ^14. Detta fenomen har också observerats i humana neurodegenerativa tillstånd där vi talar om subkliniska förändringar. Vi tror att genom att förstå och sedan behandla dessa subkliniska förändringar, skulle ändring sjukdom förbättras avsevärt.

Vi presenterar här en modell som gör det möjligt att upptäcka milda locomotion defekter som kan hjälpa till med att förstå övergången från "presymptomatisk till symtomatisk" av neurodegenerativa patologi med hjälp av en Drosophila modell. Många grupper har använt en kort klättring avstånd (5-10 cm), men vi ökade avståndet till 17,5 cm som i Palladino et al. ^20. Även om denna skillnadmellan klättring höjder kan tyckas liten, var ökningen i höjd syftar till att öka analys svårigheter, och därmed hjälpa till att identifiera de jämförelsevis mindre klättring defekter. En del metoder valde att belysa toppen av cylindern med en fiberoptisk lampa, för att dra fördel av den phototaxic svaret hos vuxna Drosophila. Emellertid kan ljuskällan orsaka reflexer i cylindern; Således är en diffus overhead fluorescerande ljuskälla som används i stället. Dessutom kan mutationer i gener inblandade i neurodegeneration påverka ögonfunktionen och därför förspänna resultaten. Ökningen av provstorleken från 10 till 20 flugor ökar den statistiska kraften i varje försök. Inledningsvis ökade vi antalet till så högt som 30 flugor, men det sänktes senare för att minimera trängsel och interaktionseffekter mellan flugor. Proverna kastas efter en enda användning, i stället för att köra för fyra upprepade försök per prov, för att eliminera den possibility av lärande eller trötthet. På grund av flugor med extremt dålig klättring prestanda, var det kontraproduktivt att registrera den tid som krävs för 50% av flugorna att korsa mållinjen för det kan ta en avsevärd tid för detta kriterier som ska uppfyllas. Snarare var flugor ges en löptid på 2 minuter för att korsa mållinjen. Antalet flugor passera linjen registrerades och arkiveras i steg om 10s, och det resulterande värdet uttrycks i procent.

Dessa villkor skapar är en känsligare bedömning av en vuxen flugans klättringsförmåga. Medan andra utformningar av analysen är fortfarande användbar, kan detta paradigm övervägas i de fall där milda tidiga defekter undersöks. Dessutom kan denna analys bidra till att upptäcka mindre förändringar i samband med läkemedelsprövningar.

En viktig fråga är att den negativa geotaxis beteende är baserad på flugorna att utnyttjas till botten av cylindern. Det är therefmalm viktigt att utvärdera andra former av förflyttning, till exempel på en plan yta eller flykt. Andra aspekter såsom motivation och social interaktion måste betraktas som potentiella FÖRBRYLLA. En annan varning är att analysen presenteras bara tillåter en att bedöma förflyttning hos vuxna flugor. Detta begränsar möjligheten att få neuropatologiska korrelat för beteendet observeras som är mycket viktiga för att förstå patogenesen av en sjukdom. I själva verket har de flesta neuroradiologiska arbete gjorts på larven neuromuskulära förbindelsen hittills i Drosophila. Skaffa rörelsebeteende i larv kan vara ett viktigt steg för att dra direkt samband mellan beteende och sjukliga förändringar.

Det är mycket viktigt att styra temperaturen och fuktigheten vid vilken flugorna höjs och testas. Förutom effekten på farten utveckling, dessa faktorer hade en viktig effekt på klättringsförmåga flugor upp och lagras i icke-ideala förhållanden. I presence ökad statisk elektricitet eller fukt, gjorde flugor inte prestera optimalt. Denna effekt var inte lika för alla genotyper, flugor mutant oftast mer påverkas av sådana faktorer än kontroller som. Dessutom cylindrar måste tvättas och torkas ordentligt mellan varje försök.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila stocks			The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.
Video camera			Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.
Graduated cylinder	Kimble	20028W	Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.
Computer			Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point.