Abstract
Locomotive défauts résultant de maladies neurodégénératives peut être un symptôme d'apparition tardive de la maladie, après des années de dégénérescence infraclinique, et des stratégies ainsi actuels de traitement thérapeutique ne sont pas curatifs. Grâce à l'utilisation de séquençage d'exome ensemble, un nombre croissant de gènes ont été identifiés à jouer un rôle dans la locomotion humaine. Malgré l'identification de ces gènes, on ne sait pas comment ces gènes sont essentiels pour le fonctionnement de la locomotive normale. Par conséquent, un test fiable, qui utilise des organismes modèles pour élucider le rôle de ces gènes afin d'identifier de nouvelles cibles d'intérêt thérapeutique, est plus que jamais nécessaire. Nous avons conçu une version sensibilisée de l'essai de géotaxie négatifs qui permet la détection de défauts plus douces antérieure et a la capacité d'évaluer ces défauts au cours du temps. Le dosage est réalisé dans un cylindre gradué de verre, qui est scellée avec un film de barrière cire. En augmentant la distance de seuil pour être grimpé à 17,5 cm et en augmentant la durée de l'expérience à 2 min, nous avons observé une plus grande sensibilité dans la détection des dysfonctionnements de mobilité douces. Le dosage est rentable et ne nécessite pas une formation approfondie pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Cela en fait une excellente technique pour le criblage de médicaments candidats dans des mutants de drosophile avec des défauts de locomotion.
Introduction
Maladies neurodégénératives dévastatrices telles que la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, et paraplégie spastique familiale sont de plus en plus reconnus. Malheureusement, la plupart de ces maladies neurodégénératives sont encore sans traitements. L'utilisation clinique généralisée de tests génétiques impartiales pangénomiques comme le séquençage de l'exome ensemble a conduit à un nombre croissant de gènes étant impliqué dans les troubles locomoteurs humaines. Malgré ces progrès, la progression pathologique du début à la fin des étapes, reste insaisissable dans ces troubles. Drosophila fournit un avec les outils génétiques pour étudier exigence de gènes d'une manière spatio-temporelle contrôlée. En outre, la drosophile est avéré utile pour le criblage de médicaments pour les troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson 1, la maladie d'Alzheimer 2, déficience intellectuelle et l'épilepsie 3,4 5,6 entre autres. Notre objectif était de développer une solution rentableet le dosage fiable qui permettrait analyse à haut débit qui serait encore assez sensible pour détecter de petits changements dans les performances du moteur.
Il existe plusieurs tests utilisés pour quantifier les effets de la mutation génétique et / ou de l'état de l'environnement sur le comportement d'escalade drosophile. La plupart des essais capitaliser sur la tendance naturelle de mouches à grimper, connus sous le nom géotaxie négative, ou le dosage de l'escalade. 7 Benzer suggéré en 1967 que l'appareil à contre-courant utilisé pour l'étude de phototaxie pourrait également être utilisé pour étudier gravitaxis. Depuis lors, Ganetsky 8 et beaucoup d'autres 9 -12 ont construit sur le dosage initial. Le principe est de placer un nombre connu de mouches dans un flacon et appuyez sur le flacon fermement contre une surface dure, provoquant les mouches tombent au fond du flacon. Comme il est un comportement inné, vol tenteront de grimper au sommet de la fiole, par opposition à la gravité. Cet essai est quantitative et mesures combien de mouches ont grimpé passé un marqueur sur le flacon pendant une période de temps allouée. Mesure de la vitesse à la place du nombre total de mouches escalade est devenue un paramètre fiable et montré des défauts dans les cas où le nombre de critères de mouches était non significatif 13.
Le test d'escalade se sont révélées utiles dans l'étude de nombreux troubles neurodégénératifs, y compris la maladie de Parkinson 14. Cependant, nous avons constaté que les défauts de locomotive peuvent ne pas être détectable au moment où la neurodégénérescence est déjà considérée dans les études pathologiques 14. Ainsi, l'utilisation du dosage traditionnel peut limiter la capacité d'étudier les stades précoces de la pathogenèse de la maladie. L'apparition de défauts de locomotives durant les derniers stades de la pathologie peut refléter une maladie dont la progression est trop avancé pour le sauvetage complète.
Cela soulève un problème potentiel avec la sensibilité de l'essai d'escalade traditionnelle. L'incapacité potentielle de la traditiontional escalade test pour détecter les défauts de locomotives doux peut être attribuée à la hauteur à laquelle les mouches sont tenus de grimper. Les traditionnels dosage 15,16 mesures le nombre de mouches à monter avec succès sur une hauteur de 2 à 5 cm dans 10 à 20 sec.
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Protocol
Recherche sur Drosophila melanogaster était en conformité avec l'Université des lignes directrices de recherche de l'Alberta.
1. Fly Collection
- Recueillir 20 mouches utilisant le CO 2 (g) l'anesthésie et le placer dans un flacon de collection 25 mm x 95 mm contenant de la nourriture.
- Entreposer les flacons contenant des mouches horizontalement pour éviter le piégeage des mouches dans les liquides qui peuvent accumuler dans le fond du flacon.
- Incuber mouches pendant au moins 21 heures à 22 ° C à 45% d'humidité dans un incubateur pendant environ pendant 15 heures. Régler l'incubateur avec une lumière de 12 h: cycle d'obscurité.
2. Escalade Assay
- Le lendemain matin, transférer 20 mouches d'un seul flacon en verre de 250 ml graduée. Marquer la position du cylindre pour le maintenir constant de tous les jours. Utilisez un cylindre de verre par génotype pour éviter la contamination croisée entre les génotypes. Laver à la fin de chaque expérience et roliter eux entre les génotypes.
- Mener des expériences à la lumière ambiante (ou la lumière rouge si il ya un défaut potentiel de la vision) à la température et l'humidité de 22 ° C et 40% respectivement. Pour éviter rythme circadien confondre, toujours effectuer des expériences dans le même temps de la journée.
- Sceller la partie supérieure du cylindre avec un film barrière (film de cire) pour empêcher la fuite de tout vol (figure 2).
- Mettre en place la caméra vidéo sur un trépied. appareil photo Focus sur la ligne 190 ml de 250 ml graduée (17,5 cm).
- Compter le nombre de mouches mortes au fond du cylindre et dans les flacons de produits alimentaires. Inscrire ce numéro que le taux de mortalité.
- Très tapoter légèrement le cylindre contre un coussin en mousse à cellules fermées à plusieurs reprises avec une force suffisante pour déplacer les mouches à la surface inférieure intérieure. Appuyez sur 5 - 10 fois tout en utilisant l'autre main pour appuyer dossier sur l'appareil photo.
- Appuyez sur le bouton "Enregistrer" sur la caméra.
- Lancer la video enregistrement de la caméra et tapez sur le cylindre à six reprises dans un modèle non-rythmique distincte.
- Mener chaque essai pendant 2 min à partir du moment les mouches sont exploitées dernière et enregistrer le nombre de mouches qui traversent la hauteur de 17,5 cm (190 ml) à chaque point de temps choisi (de quantifier toutes les 10 secondes). Remarque: Le marquage sur le cylindre ml variera d'un modèle de cylindre à l'autre en fonction du diamètre. Pour éviter toute erreur, mesurer la hauteur sur chaque bouteille utilisée.
- Une fois le procès terminé, disposer de mouches dans 95% d'éthanol.
- Répétez les étapes 2.1 à 2.9 jusqu'à ce que toutes les répétitions ont été testés avec des mouches frais à chaque fois.
Note: Bien que 5 répétitions peuvent être assez avec une mutation ayant un effet important sur la locomotion, 10 répétitions biologiques de 20 200 mouches (mouches) est recommandée pour détecter des différences plus petites. - À la fin de l'expérience, se laver les cylindres dans le lave-vaisselle de laboratoire et O sec / N pour être réutilisé.
3. Analyse
- Analyze vidéos de chaque volent procès. Chaque 10 secondes, enregistrer le nombre total de mouches qui passent la ligne de cible.
- Si une mouche redescend ou tombe, fiche qui volent comme -1 et compter la prochaine volée de franchir la ligne de cible que le même numéro que la mouche qui est remonté vers le bas ou est tombé. Par exemple, si le 15 ème mouche tombe en dessous de la ligne de cible, la prochaine volée à franchir la ligne (16 e volent) est considéré comme le 15 ème volée et non pas le 16 ème.
- Soustraire la mortalité à partir du nombre total de mouches (20) pour obtenir le nombre de mouches qui restent dans le procès. A chaque point de temps, obtenir la fraction de mouches au-dessus de la ligne de cible.
- Complot chaque pourcentage à chaque point de temps (voir Figure 3).
- Analyser la performance au point de données 120 sec et effectuer test t de Student lorsque 2 groupes sont présents ou ANOVA et un post-test pour les comparaisons multiples (avec modification de Bonferroni pour planifiées et non planifiées Tukey pour comparisons). Le Kolmogorov-Smirnov teste 17 est également effectuée pour vérifier la normalité et variance égale, mais aussi de comparer les distributions du groupe mutant à la commande.
- Pour présenter les données sur le vieillissement, tracer le pourcentage de mouches grimper à 120 sec avec des mouches de différents âges (2 jours, 1 semaine, 2 semaines) pour voir si il ya un déficit progressif (Figure 4).
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Representative Results
Escalade est un comportement solide et reproductible. En effet, un jour de vieilles mouches de type sauvage atteindre la performance d'escalade de distance de la cible rapidement (25 - 30 sec). Mouches mutantes présentent une gamme de performances de légère (ou retardée) pour compléter l'incapacité de monter à la cible. Nous illustrons cette ici avec deux allèles mutants différents. Le premier est un allèle sévère de la spastin génique provoquée par une deletion complète du gène de spas spastin (5,75) 18. Dans cette ligne (spas 5,75 avec TM6b) Une journée vieilles mouches ne parviennent pas à la performance d'escalade WT même après 2 min. Cette lignée mutante présente des défauts graves, même en utilisant la méthode du flacon (figure 1A, B). L'avantage de la méthode présentée ici devient plus évident lorsque l'on étudie un mutant pour le même gène mais avec une suppression incomplète publié par le même groupe (17-7 spas à TM3) 18. Dans ce cas les performances de jusqu'à 8 jours est normal (figure 1C-F (figure 3) ou de l'interaction génétique. Pour preuve supplémentaire, y inclure le sauvetage du phénotype comportemental avec l'expression d'une protéine de type sauvage pour le gène étudié. Pour les études d'interaction, comparer les mouches qui sont hétérozygotes pour les deux mutations d'intérêt avec des mouches qui ont une seule mutation d'intérêt. Le test permet également de suivre l'évolution de la défectuosité de l'escalade au fil du temps, un aspect important dans la modélisation de troubles locomoteurs progressistes (Figure 4). En outre, 2 min permettent de mieux voir la progression de l'escalade dans les mutants graves.
Figure 1. Comparaison des différents dosages d'escalade. Pour mutations sévères différents degrés de défaut escalade peuvent être vus en utilisant diverses méthodes, mais des mutations plus douces ne peut être détectée avec certains dosages. Pour démontrer cela, nous avons utilisé deux lignées mutantes publiées pour le spastin génique:. Spastin 5-75 qui contient une délétion complète du gène spastin et spastin 17-7 qui contient une délétion partielle du gène spastin (A) d'abord, l'escalade est évalué en ayant mouches grimper au sommet d'un flacon vide alimentaire. Le nombre de mouches au sommet après 18 secondes est enregistré. En utilisant ce protocole un défaut important est vu dans spast 5-75 / TM6b par rapport aux témoins de type sauvage (N = 10, p <0,001). (B) Ensuite, escalade performance est évaluée en utilisant la méthode décrite ici. Escalade est également D efective dans le même génotype spast 5-75 / TM6b. La différence de performance est hautement significatif (N = 5, p <0,001), mais l'écart est plus grand dans la performance. Pour mutations montrées avoir moindre pensée d'effet (par exemple, spast 17-7 contient une délétion partielle du gène spastin), la méthode du cylindre présenté ici peut être plus sensible. (C) Aucun défaut significatif est observé avec 3 jours d'âge spast 17-7 / TM3 avec la méthode du flacon (N = 5). (D) Pas de défaut significatif est observé avec vieux 3 jours spast 17-7 / TM3 avec la méthode de cylindre (N = 5). (E) Une tendance non statistique est noté avec le vieux huit jours spast 17-7 / TM3 vole (N = 5). (F) Mais une signification est observée pour les anciens huit jours spast 17-7 / TM3 testé avec la méthode du cylindre présenté pour le même nombre de répétitions (N = 5, p <0,001).rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentation schématique du dispositif expérimental mis en place. Vol 20 sont insérés dans un cylindre en verre et ensuite coiffés avec un film barrière de cire. Les mouches sont ensuite exploitées pour le fond et le nombre de mouches qui franchissent la ligne médiane est enregistrée à l'aide d'une caméra pendant 120 secondes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs de l'expérience de l'escalade. Le pourcentage de mouches ayant passé la ligne de seuil est représenté toutes les 10 secondes au cours des duratisur du dosage. Dans cette expérience, 3 contrôles génétiquement appropriées (type sauvage, spas SAMU -RNAi / +, Elav-GAL4 / +) sont comparées à des mouches transgéniques contenant à la fois SAMU et des composants Gal4 (ZPS Elav-GAL4 / UAS -RNAi). Le SAMU spas ARNi est de VDRC # 108739. Cette représentation permet pour l'évaluation du taux d'escalade pour chaque génotype. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. graphique représentant pour le profil de vieillissement. Depuis de nombreux troubles locomoteurs sont progressifs, il est important de décrire l'évolution au fil du temps. Dans ce graphique, WT mouches sont comparés à des mutants hétérozygotes (spas / WT) et des mutants trans-hétérozygotes (spast5-75 / spast17-7) à 2 jours (A) et 8 jours (B)(N = 10, p <0,001). Les résultats sont également représentés dans le temps pour le 120 sec. point de temps (C). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Drosophila a déjà prouvé être un excellent modèle dans la maladie 14 et d'autres conditions neurodégénératives de 1,2 de Parkinson. En plus des outils génétiques disponibles chez la drosophile, son génome est hautement conservé de gènes impliqués dans des troubles neurologiques 19. L'avènement des méthodes de dépistage génétique larges génome (y compris le séquençage de l'exome ensemble) est susceptible de continuer à fournir une plus grande liste de gènes candidats associés à des troubles du mouvement humain. Le développement de traitements pour ces conditions, il faudra des modèles animaux pour accroître notre compréhension de la pathologie en cause dans les premiers stades de la neurodégénérescence. L'utilisation de Drosophila et le dosage de géotaxie négative fournit une méthode peu coûteuse et fiable pour identifier les gènes impliqués dans les défauts de locomotive et ensuite cribler des médicaments candidats pour le phénotype sauvetage. Cela ajoute à l'échelle moléculaire, électrophysiologie, et des épreuves d'imagerie tchapeau peuvent également être obtenus dans le même modèle animal. En utilisant le test d'escalade, d'autres ont réussi à reproduire les défauts de moteur en vol pour mutant gènes qui perturbent la locomotion humaine. Néanmoins, des recherches antérieures ont montré que des changements pathologiques pourraient précéder la détection de défauts de locomotive par plusieurs jours 14. Ce phénomène est également observé dans des conditions neurodégénératives humaines où nous parlons des changements subcliniques. Nous croyons que par la compréhension et le traitement de ces changements subcliniques, modification de la maladie serait grandement améliorée.
Nous présentons ici un modèle qui permet la détection de défauts bénins de locomotion qui peuvent aider à comprendre le passage de «présymptomatique ou symptomatique" de la pathologie neurodégénérative en utilisant un modèle de drosophile. Beaucoup de groupes ont utilisé une courte distance de l'escalade (5-10 cm), mais, nous avons augmenté la distance à 17,5 cm comme dans Palladino et coll. 20. Bien que cette différenceentre escalade hauteurs peuvent sembler mineures, l'augmentation de la hauteur a été conçu pour augmenter la difficulté de dosage, ce qui aide à l'identification des défauts d'escalade relativement mineures. En outre, certains procédés ont choisi pour éclairer la partie supérieure du cylindre avec une lampe à fibre optique, pour profiter de la réaction de phototaxic adultes de Drosophila. Cependant, la source de lumière peut provoquer la réflexion lumineuse à l'intérieur du cylindre; ainsi, une source diffuse de la lumière fluorescente au plafond, est utilisé à la place. En outre, la mutation des gènes impliqués dans la neurodégénérescence peut affecter la fonction oeil et donc biaiser les résultats. L'augmentation de la taille de l'échantillon de 10 à 20 vol augmente la puissance statistique de chaque essai. Initialement, nous avons augmenté ce nombre à aussi haut que 30 mouches, mais il a ensuite été réduite afin de minimiser les effets de la surpopulation et l'interaction entre les mouches. Les échantillons sont jetés après un usage unique, plutôt que d'être une durée de quatre essais répétés par échantillon, pour éliminer le possibilité de l'apprentissage ou de la fatigue. En raison de mouches avec les performances de montée extrêmement pauvre, il était contre-productif pour enregistrer le temps nécessaire pour 50% des mouches à franchir la ligne de cible pour qu'il pourrait prendre une quantité considérable de temps pour ces critères à remplir. Plutôt, les mouches ont été donnés une durée de 2 min à franchir la ligne de cible. Le nombre de mouches à franchir la ligne a été enregistré et mis en cellule par incréments de 10s, et la valeur résultante exprimée en pourcentage.
Ces conditions créent sont une évaluation plus sensible des capacités d'escalade d'une mouche adulte. Alors que d'autres conceptions de l'essai sont toujours utiles, ce paradigme peut être envisagée dans les cas où les premiers défauts bénins sont étudiés. En outre, ce test peut aider à détecter les plus petits changements dans le contexte des essais de médicaments.
Une question importante est que le comportement négatif de géotaxie est basée sur les mouches étant exploitées au fond du cylindre. Il est therefminerai important d'évaluer d'autres formes de locomotion, comme sur une surface plane ou vol. D'autres aspects tels que la motivation et l'interaction sociale doivent être considérés comme confondre potentiel. Un autre inconvénient est que le test présenté ne permet d'évaluer la locomotion chez les mouches adultes. Cela limite la possibilité d'obtenir des corrélats neuropathologiques pour le comportement observé qui est très important dans la compréhension de la pathogenèse d'une maladie. En effet, la plupart des travaux de neuro-imagerie a été fait à la larve de la jonction neuromusculaire jusqu'à présent chez la drosophile. Obtention comportement de locomotion larve peut être une étape importante afin d'en tirer corrélation directe entre le comportement et les changements pathologiques.
Il est très important de contrôler la température et l'humidité au cours de laquelle les mouches sont élevées et testés. En plus de l'effet sur le développement de la mouche, ces facteurs ont eu un effet important sur la capacité d'escalade de mouches soulevées et stockées dans des conditions non idéales. Dans le presence de l'augmentation de l'électricité statique ou de l'humidité, les mouches ne pas fonctionner de manière optimale. Cet effet était pas égal pour tous les génotypes, mouches mutantes étant habituellement plus affectée par des facteurs tels que les témoins. En outre, les bouteilles doivent être lavés et séchés correctement entre chaque expérience.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).
