Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

Abstract

Locomotiva defeitos resultantes de doenças neurodegenerativas pode ser um início dos sintomas da doença de tarde, após anos de degeneração subclínica, e, assim, estratégias atuais de tratamento terapêutico não são curativos. Através da utilização de sequenciação exome conjunto, um número cada vez maior de genes foram identificados a desempenhar um papel na locomoção humana. Apesar de identificar estes genes, não se sabe como esses genes são cruciais para o funcionamento normal locomotiva. Por conseguinte, um ensaio de confiança, que utiliza organismos modelo para elucidar o papel destes genes, a fim de identificar novos alvos de interesse terapêutico, é necessário mais do que nunca. Nós preparámos uma versão sensibilizado do ensaio geotaxis negativos que permite a detecção de defeitos leves anterior e tem a capacidade de avaliar esses defeitos ao longo do tempo. O ensaio é realizado em um cilindro de vidro graduado, que é selada com uma película de barreira de cera. Ao aumentar a distância patamar de ser escalado para 17,5 cm e aumentando a duração da experiência para 2 min temos observado uma maior sensibilidade na detecção de disfunções de mobilidade suaves. O ensaio é rentável e não requer a formação extensa para obter resultados altamente reprodutíveis. Isso o torna uma excelente técnica para o rastreio de drogas candidatas em mutantes de Drosophila com defeitos de locomoção.

Introduction

Doenças neurodegenerativas tais como a doença devastadora de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, e paraplegia espástica hereditária são cada vez mais reconhecidas. Infelizmente, a maioria desses distúrbios neurodegenerativos são ainda sem tratamentos. O uso clínico generalizado de testes genéticos, imparciais de todo o genoma, tais como sequenciação de toda exome levou a um aumento do número de genes implicados em distúrbios locomotiva humanos. Apesar deste progresso, a progressão patológica desde cedo a fases tardias, permanece indefinida nesses transtornos. Drosophila fornece um com as ferramentas genéticas para estudar exigência gene de uma forma temporal e espacial controlada. Além disso, Drosophila tem se mostrado útil na triagem de drogas para doenças neurológicas como Parkinson ^1, a doença de Alzheimer ^2, deficiência mental e epilepsia ^{3,4 5,6} entre outros. O nosso objectivo foi desenvolver um custo eficaze ensaio de confiança que permita a análise de alto rendimento que ainda seria suficientemente sensível para detectar pequenas mudanças no desempenho do motor.

Existem vários ensaios utilizados para quantificar os efeitos da mutação genética e / ou condições ambientais sobre o comportamento de escalada de Drosophila. A maioria dos ensaios capitalizar a tendência natural das moscas para escalar, conhecidos como geotaxis negativos, ou o ensaio de escalada. Benzer ⁷ em 1967 sugeriram que o aparelho em contracorrente utilizada para o estudo de fototaxia também poderia ser usado para estudar gravitaxis. Desde então, Ganetsky ⁸ e muitos outros ^{9 -12} construíram no ensaio inicial. O princípio é o de colocar um número conhecido de moscas em um frasco e o frasco toque fortemente contra uma superfície dura, fazendo com que as moscas a cair para o fundo do frasco. Como se trata de um comportamento inato, as moscas vai tentar subir para a parte superior do frasco, em oposição à gravidade. Este ensaio é quantitativa e measures quantas moscas subiram passado um marcador no frasco durante um período de tempo estipulado. Medição da velocidade, em vez do número total de moscas escalada tornou-se um parâmetro fiável e mostrado defeitos nos casos em que o número de parâmetros de moscas não foi significativa ^13.

O ensaio de escalada provou ser útil no estudo de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson ^14. No entanto, observou-se que os defeitos locomotiva pode não ser detectável no momento em que a neurodegeneração já é visto em estudos patológicos ^14. Assim, a utilização do ensaio tradicional pode limitar a capacidade para estudar os estágios iniciais da patogénese da doença. O aparecimento de defeitos locomotiva durante fases posteriores da patologia pode refletir uma doença cuja progressão é muito avançado para resgate completo.

Isto levanta um problema potencial com a sensibilidade do ensaio escalada tradicional. A incapacidade potencial do tradicional subir ensaio para detectar defeitos leves locomotiva pode ser atribuído à altura a que as moscas são obrigados a subir. Os tradicionais ^15,16 ensaio mede o número de moscas para escalar com sucesso através de uma altura de 2 a 5 cm em 10 a 20 seg.

Protocol

Pesquisa sobre Drosophila melanogaster estava em conformidade com a Universidade de diretrizes de pesquisa de Alberta.

1. Fly Colecção

1. Coletar 20 moscas usando CO _{2 (g)} anestesiados e coloque em um frasco de recolha 25 milímetros x 95 milímetros contendo alimentos.
2. Frascos contendo loja moscas horizontalmente para evitar a captura de moscas em quaisquer líquidos que podem se acumular no fundo do frasco.
3. Incubar moscas durante pelo menos 21 horas a 22 ° C em 45% de humidade num incubador durante aproximadamente durante 15 h. Defina a incubadora com uma luz de 12 horas: ciclo escuro.

2. Escalada Assay

1. Na manhã seguinte, a transferência de 20 moscas a partir de um único frasco num copo de 250 ml cilindro graduado. Marque a posição do cilindro para mantê-lo todos os dias constante. Usar um cilindro de vidro por genótipo para evitar a contaminação cruzada entre os genótipos. Lavar-se ao fim de cada experiência e rolitar-los entre os genótipos.
   1. Conduzir as experiências em luz ambiente (ou luz vermelha se houver um defeito potencial na visão) a temperatura e humidade de 22 ° C e 40% respectivamente. Para evitar circadiano confundem ritmo, sempre realizar experimentos na mesma hora do dia.
2. Selar o topo do cilindro com uma película de barreira (filme de cera) para impedir a fuga de quaisquer moscas (Figura 2).
3. Configure a câmera de vídeo em um tripé. Câmera com foco na linha 190 ml dos 250 ml cilindro graduado (17.5 cm).
4. Contar o número de moscas mortas na parte inferior do cilindro e nos frascos de alimentos. Grave este número como a mortalidade.
5. Muito bata levemente contra o cilindro de uma almofada de espuma de células fechadas, repetidamente, com força suficiente para deslocar as moscas para a superfície de fundo interna. Toque 5-10 vezes enquanto com a outra mão para pressionar registro na câmera.
6. Pressione o botão "Record" na câmara.
7. Comece o vidEO gravação e câmera toque no cilindro de seis vezes em um padrão não-rítmica distinta.
8. Realizar cada julgamento por 2 min do tempo as moscas estão último aproveitado e registrar o número de moscas que atravessam a altura de 17,5 centímetros (190 ml) em cada ponto de tempo escolhido (quantificar a cada 10 segundos). Nota: A marcação no cilindro ml irá variar de um modelo para outro cilindro, dependendo do diâmetro. Para evitar erros, medir a altura de cada cilindro usado.
9. Uma vez que o julgamento terminou, dispor de moscas em 95% de etanol.
10. Repita os passos 2.1 a 2.9 até que todos os replicados foram testados com moscas fresco de cada vez.
    Nota: Embora cinco repetições pode ser suficiente, com uma mutação ter um forte efeito na locomoção, 10 réplicas biológicas de 20 moscas, moscas (200) é recomendado para detectar diferenças menores.
11. Após a conclusão da experiência, os cilindros de lavagem na máquina de lavar de laboratório e seca O / N para ser re-utilizado.

3. Análise

1. Analyvídeos ze de cada voar julgamento. Cada 10 segundos, anotar o número total de moscas que passam a linha de meta.
   1. Se uma mosca sobe de volta para baixo ou cai, registro que voam como -1 e contar a próxima mosca para cruzar a linha de meta como o mesmo número que a mosca que subiu de volta para baixo ou caiu. Por exemplo, se o ^15º mosca cai abaixo da linha de meta, a próxima mosca para cruzar a linha (16 ^th voar) é considerado o ^15º mosca e não o ^16º.
2. Subtrair a mortalidade a partir do número total de moscas (20) para se obter o número de moscas que permanecem no ensaio. Em cada ponto de tempo, obter a fracção de moscas acima da linha de destino.
3. Traçar cada porcentagem em cada ponto de tempo (ver Figura 3).
4. Analisar o desempenho no ponto de dados 120 segundos e realizar teste t de Student quando dois grupos se encontrem presentes ou análise de variância e um pós-teste para comparações múltiplas (com modificação Bonferroni para planejado e Tukey para co não planejadamparisons). O teste de Kolmogorov-Smirnov testa ¹⁷ também é realizada para verificar a normalidade e variância igual, mas também para comparar as distribuições do grupo mutante para o controlo.
5. Para apresentar os dados sobre o envelhecimento, plotar a porcentagem de moscas subir a 120 segundos com moscas de diferentes idades (2 dias, uma semana, duas semanas) para ver se há um déficit progressivo (Figura 4).

Representative Results

Escalada é um comportamento forte e reprodutível. Na verdade, um dia velhos moscas do tipo selvagem alcançar o desempenho escalada distância do alvo rapidamente (25-30 seg). Moscas mutantes apresentam uma série de desempenho de leve (ou retardada) para completar a incapacidade de subir ao alvo. Nós ilustramos esta aqui com dois alelos mutantes diferentes. O primeiro é um alelo grave do Spastin gene causada por uma deleção completa do gene Spastin spas ^{(5,75) 18.} Nesta linha ^(5,75 spas com TM6b) um dia moscas velhas não alcançam desempenho escalada WT mesmo depois de 2 min. Esta linha mutante apresenta defeitos graves, mesmo quando usando o método do frasco (Figura 1A, B). A vantagem do método aqui apresentado torna-se mais evidente quando se estuda um mutante para o mesmo gene, mas com uma eliminação incompleta publicado pelo mesmo grupo (spas ^17-7 com TM3) ^18. Nesse caso, o desempenho de até 8 dias é normal (Figura 1C F- (Figura 3) ou interacção genética. Por outras provas, incluem salvamento do fenótipo comportamental com a expressão de uma proteína de tipo selvagem para o gene estudado. Para estudos de interacção, compare as moscas que são heterozigotos para ambas as mutações de interesse com moscas que só têm uma mutação de interesse. O ensaio também permite monitorizar a progressão do defeito escalada ao longo do tempo, um aspecto importante na modelagem de distúrbios locomotores progressivas (Figura 4). Além disso, 2 min para permitir ver melhor a progressão de escalada em mutantes graves.

Figura 1. Comparação de diferentes ensaios de escalada. Para mutações graves diferentes graus de defeito de escalada podem ser vistos usando vários métodos, mas mais leves mutações não podem ser detectados com alguns ensaios. Para demonstrar isto foi utilizado duas linhas mutantes publicadas para o gene: Spastin. Spastin ^5-75 que contém uma deleção completa do gene Spastin Spastin e ^17-7, que contém uma deleção parcial do gene Spastin (A) Em primeiro lugar, a escalada é avaliada por ter moscas subir até o topo de um frasco vazio de alimentos. O número de moscas na parte superior depois de 18 seg está gravado. Usando este protocolo um defeito significativa é visto em Spast ^5-75 / TM6b quando comparados com os controlos do tipo selvagem (n = 10, p <0,001). (B) Em seguida, subir desempenho é avaliada utilizando o método descrito aqui. Escalada também é d efective no mesmo genótipo Spast ^5-75 / TM6b. A diferença de desempenho é altamente significativa (n = 5, p <0,001), mas a diferença no desempenho é maior. Por mutações mostradas ter menor efeito pensamento (por exemplo, Spast ^17-7 contém uma deleção parcial do gene Spastin), o método do cilindro aqui apresentados podem ser mais sensíveis. (C) no defeito significativo é observado com 3 dias de idade ^17-7 spast / TM3 com o método do frasco (N = 5). (D) no defeito significativo é observado com 3 dias de idade spast ^17-7 / TM3 com o método do cilindro (N = 5). (E) uma tendência não estatística é anotado com 8 dias de idade spast ^17-7 / TM3 moscas (N = 5). (F) Mas uma significância é observada durante 8 dias de idade spast ^17-7 / TM3 testados com o método do cilindro apresentada para o mesmo número de repetições (n = 5, p <0,001).rPegue = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Representação esquemática da montagem experimental. 20 moscas são inseridas em um cilindro de vidro e, em seguida cobertas com uma película de barreira de cera. As moscas são, em seguida, bateu para o fundo e o número de moscas que atravessam a linha média é gravada utilizando uma câmera para 120 segundos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Os resultados representativos de uma experiência de escalada. A percentagem de moscas ter passado a linha de limiar é representada a cada 10 segundos durante os duratino do ensaio. Nesta experiência, três controlos geneticamente adequados (de tipo selvagem, spas UAS -RNAi / +, elav-GAL4 / +) são comparadas com as moscas transgénicas contendo ambos os componentes e UAS de Gal4 (spas elav-GAL4 / UAS -RNAi). A UAS spas-RNAi é de VDRC # 108739. Esta representação permite a avaliação da taxa de escalar para cada genótipo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Gráfico Representante para o perfil de envelhecimento. Uma vez que muitos distúrbios locomotivas são progressivas, é importante para retratar a evolução ao longo do tempo. Neste gráfico, moscas WT são comparados com os mutantes heterozigóticos (spas / WT) e mutantes trans-heterozigóticos (spast5-75 / spast17-7) em 2 dias (A) e 8 dias (B)(N = 10, p <0,001). Os resultados também estão representados ao longo do tempo para a 120 seg. ponto de tempo (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Drosophila já provou ser um excelente modelo de doença ¹⁴ e outras condições neurodegenerativas ^1,2 de Parkinson. Além das ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila, o seu genoma é altamente conservada em genes envolvidos em desordens neurológicas ^19. O advento da largura métodos de rastreio genético do genoma (incluindo exome sequenciamento completo) é provável que continue a fornecer uma lista maior de genes candidatos associados com distúrbios do movimento humano. O desenvolvimento de tratamentos para estas condições exigirá modelos animais para aumentar a nossa compreensão da patologia envolvida nas fases iniciais de neurodegeneração. O uso de Drosophila e o ensaio geotaxis negativa fornece um método barato e fiável para identificar genes envolvidos em defeitos da locomotiva e, subsequentemente, rastrear drogas candidatas para o salvamento do fenótipo. Isso adiciona ao molecular, eletrofisiológico, e provas de imagem tchapéu pode também ser obtido no mesmo modelo animal. Utilizando o ensaio escalada, outros têm reproduzido com sucesso defeitos motores em moscas mutantes para os genes interrompendo a locomoção humana. No entanto, estudos anteriores mostraram que as alterações patológicas poderia preceder a detecção de defeitos de locomotivas por vários dias ^14. Este fenômeno também é observado em doenças neurodegenerativas humanas, onde falamos de alterações subclínicas. Acreditamos que através da compreensão e, em seguida, o tratamento destas alterações subclínicas, modificação doença seria melhorado muito.

Nós apresentamos aqui um modelo que permite a detecção de defeitos de locomoção leves que podem ajudar com a compreensão da passagem de "pré-sintomático para sintomático" de patologia neurodegenerativa usando um modelo de Drosophila. Muitos grupos têm usado a uma distância de escalada curta (5-10 cm), mas, aumentamos a distância até 17,5 centímetros como em Palladino et al. ^20. Embora esta diferençaentre escalar alturas pode parecer menor, o aumento da altura foi destina-se a aumentar a dificuldade de ensaio, auxiliando assim na identificação dos defeitos comparativamente menores de escalada. Além disso, alguns métodos escolheu para iluminar a parte superior do cilindro com uma lâmpada de fibra óptica, para tirar vantagem da resposta phototaxic de adulto de Drosophila. No entanto, a fonte de luz pode causar a reflexão da luz no interior do cilindro; assim, uma fonte de luz fluorescente sobrecarga difusa é usado em vez disso. Além disso, a mutação nos genes envolvidos na neurodegeneração podem afectar a função do olho e, portanto, influenciar os resultados obtidos. O aumento do tamanho da amostra de 10 a 20 moscas aumenta o poder estatístico de cada ensaio. Inicialmente, aumentou esse número para tão alto quanto 30 moscas, mas foi posteriormente reduzida a fim de minimizar superlotação e interação efeitos entre moscas. As amostras são descartados após uma única utilização, em vez de ser executado durante quatro ensaios de repetição por exemplo, para eliminar a possibility de aprendizagem ou fadiga. Devido às moscas com extremamente pobre desempenho de escalada, era contraproducente para registrar o tempo necessário para que 50% das moscas para cruzar a linha de meta para que pudesse levar uma quantidade considerável de tempo para este critério para ser cumprida. Em vez disso, as moscas foram agraciados com uma duração de 2 minutos para cruzar a linha de meta. O número de moscas para atravessar a linha foi gravado e finalmente resolvido em incrementos de 10 segundos, e o valor resultante expressa como uma percentagem.

Estas condições criam são uma avaliação mais sensível das capacidades de escalada de uma mosca adulta. Enquanto outros projetos do ensaio ainda são úteis, este paradigma pode ser considerada nos casos em que os defeitos precoces leves são investigados. Além disso, este ensaio pode ajudar a detectar alterações menores no contexto de ensaios clínicos.

Um aspecto importante é que o comportamento geotaxis negativa baseia-se as moscas a ser virado para o fundo do cilindro. Ele é Therefminério importante para avaliar outras formas de locomoção, como sobre uma superfície plana ou voo. Outros aspectos como a motivação e interação social precisam ser considerados como potenciais confundem. Outra limitação é que o ensaio apresentado apenas permite avaliar a locomoção em moscas adultas. Isto limita a capacidade de obter correlatos neuropatológicos para o comportamento observado é que muito importante para a compreensão da patogénese de uma doença. Na verdade, a maioria dos trabalhos neuroimagens foi feito na junção neuromuscular larva medida em Drosophila. Obtenção de comportamento locomoção em larva pode ser um passo importante no sentido de chamar a correlação direta entre comportamento e alterações patológicas.

É muito importante para controlar a temperatura e humidade em que as moscas são criados e testados. Além do efeito sobre o desenvolvimento da mosca, estes factores teve um efeito importante na capacidade de subida de moscas levantadas e armazenados em condições não ideais. Na pRESENÇA de aumento da eletricidade estática ou umidade, as moscas não executar de forma otimizada. Este efeito não foi igual para todos os genótipos, mutante moscas geralmente sendo mais afetada por fatores que os controles. Além disso, os cilindros devem ser lavadas e secas adequadamente entre cada experiência.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila stocks			The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.
Video camera			Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.
Graduated cylinder	Kimble	20028W	Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.
Computer			Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point.