Abstract
Adfærd styres af nervesystemet. Calcium billeddannelse er en enkel metode i den transparente nematode Caenorhabditis elegans at måle aktiviteten af neuroner under forskellige adfærd. At korrelere neurale aktivitet med adfærd, bør dyret ikke immobiliseres, men bør være i stand til at bevæge sig. Mange adfærdsændringer opstår under lange tidsskalaer og kræver optagelsen over mange timer for adfærd. Det gør det også nødvendigt at kulturen ormene i tilstedeværelsen af føde. Hvordan kan orme dyrkes og deres neurale aktivitet afbildet over lange tidsskalaer? Agarose mikrokammer Imaging (AMI) er tidligere udviklet til kultur og observere små larver og er nu blevet tilpasset til at studere alle livsstadier fra begyndelsen L1 indtil den voksne etape af C. elegans. AMI kan udføres på forskellige stadier af C. elegans. Langsigtet calcium imaging opnås uden immobilisere dyrene ved hjælp af kort eksternt udløst eksponeringer comkombineret med en elektron multiplicere ladningskoblet anordning (EMCCD) kamera optagelse. Zoome ud eller scanning kan skalere op denne metode til at billedet op til 40 orme i parallel. Således er en fremgangsmåde beskrevet af billedet adfærd og neurale aktivitet over lange tidsskalaer i alle livsstadier af C. elegans.
Protocol
1. Instrumenter, Kultur Medier og fade
- Bruge et mikroskop, der er i stand til at holde prøven i fokus, og som er udstyret med en automatisk fase. Byg et skræddersyet låg varmer eller købe en kommerciel løsning. Oprette en LED-EMCCD kamera system, hvor eksponeringen af kameraets udløser LED belysning gennem en TTL signal ved hjælp producentens anvisninger.
Bemærk: Se Diskussion for detaljer. - Polydimethylsiloxan (PDMS) stempler:
- Fabrikere PDMS frimærker i en mikrovæskeanordning facilitet eller har PDMS stempler produceret af en kommerciel støberi. For at bruge en kommerciel støberi, Send en AutoCAD-fil til virksomheden og angiv dybde (15 um, for eksempel) af enheden. Efter levering fra støberiet, skære PDMS chip i sine 16 frimærker ved hjælp af en skalpel.
- Bond hver enkelt stempel til et objektglas under anvendelse af luft plasma. For limning, eksponere både PDMS stempel og objektglasset til luft plasma til enBout 1 min (ved hjælp af de højeste plasma-indstillingerne ved 0,5 mbar). Sørg for, at overflader til limning vende opad under plasma behandling. Derefter placere PDMS stemplet over objektglasset.
- Læs 3,5 cm bund skålen og skære en kvadratisk areal på 18 x 18 mm fra midten af bunden af skålen ved hjælp af en vertikal fræsemaskine og skarpe roterende skæreorganer. Bruge lav rotationshastighed af skæret og langsom fodring for at forhindre plast fra smeltende grund af varme produceret af friktion. Forbered flere retter på én gang.
Bemærk: Den nederste skål kan genbruges mange gange efter forsøget, hvis det rengøres efter iblødsætning i ren ethanol O / N. - Agarose:
- 3 g højt smeltepunkt agarose opløses i 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml kolesterol (5 mg / ml i ethanol), H 2 O til 1 L, der steriliseres ved autoklavering) ved kogning. Gør alikvoter af det opløste agarose i 2 ml Eppendorf-rør og opbevae. Også forberede en batch af lav-smeltepunkt agarose nøjagtig samme måde som den høje smeltepunkt agarose.
- Før anvendelse placere 3 portioner af høj smeltepunkt agarose på en varmeblok ved 95 til 98 ° C. Før anvendelse, placeres en alikvot af lav-smeltepunkt agarose på en varmeblok ved 95 til 98 ° C, indtil det er smeltet og derefter på en varmeblok niveauet 30 - 35 ° C.
2. Udvælgelse af dyr
- Dyrk orme ved en lav densitet på seedede NGM plader for at opnå rene dyr. Sørg for, at der er masser af mad, og kun få dyr på pladen.
- Til billeddannelse L1 larver, overføre omkring 30 æg indeholdende embryoner på kringle fase på en frisk podet NGM plade. Til overførsel senere larvestadier eller voksne C. elegans, overføre omkring 30 orme på en frisk podet NGM plade.
3. Forberedelse agarose Microchambers
- Forberedelse af skålen:
- Tag en plastik skål med en kvadratisk åbning på 18 x 18 mm ved bunden og placere den på hovedet med åbningen opad. Lukke åbningen ved at placere et stykke dobbeltklæbende tape på 20 x 20 mm på åbningen. Vend fadet rundt, så den tape er på bunden og placer fadet på en hård overflade. Skær åbningen fri ved hjælp af en skalpel.
- Ved hjælp af en pipette P1000, fyld 2 ml 3% høj-smeltepunkt agarose i S-Basal i fadet. Placer agarose på det område, som omgiver åbningen og lad størkne. Vent, indtil agarosen er solid.
- Vend rundt i skålen og træk den beskyttende film, der dækker dobbeltsidet tape, så den klæbende side vil forblive på fad og vil blive udsat for.
Bemærk: Som følge heraf vil en fin ring af tape omgiver ydersiden af åbningen. Agarosen tjener som et reservoir fugt, som senere vil omgive prøven.
- Støbning af microchambers:
- Expose the PDMS overflade til støbning med luft plasma til 20-60 sek.
Bemærk: Denne plasma behandling gør de PDMS overflade hydrofile, hvilket forhindrer indfangning af luftbobler og producerer skarpere udskrifter. - Konstruere to afstandsstykker af samme højde ved at stable 5 - 9 objektglas. Sted, sideløbende med deres lange sider, den første spacer stakken, så en enkelt objektglas, så igen en spacer stak. Anbring objektglas, der indeholder det PDMS stempel ortogonalt tværs afstandsstykkerne. Justere højden af afstandsstykkerne, således at der er et mellemrum på ca. 1,5 mm mellem støbeoverfladen af PDMS stempel og den indre glasplade.
- Placer en dråbe varm væske højt smeltepunkt agarose på enkelt glas slide nær PDMS stempel og hurtigt skub PDMS stemple lodret ind i flydende agarose. Lad agarose størkne. Kontroller, at det bliver et uigennemsigtigt udseende, hvilket normalt tager omkring 2 min. Træk stemplet lodret med et træk.
Bemærk: Det er praktisk til Glue afstandsstykket glider sammen med dobbeltsidet tape. Den lodrette bevægelse af stemplet forhindrer luftbobler i at blive fanget i agarose.
- Expose the PDMS overflade til støbning med luft plasma til 20-60 sek.
- Overfør æg eller orme sammen med OP50 bakterier på agarose med en fin platintråd pick. Fordel et æg eller en orm pr kammer sammen med mad ved hjælp af en øjenvippe. Position omkring 30 æg på en agarose pad.
- Skær agarose slab indeholder de fyldte microchambers i en firkant på ca. 15 x 15 mm, således at det passer fint ind i åbningen af skålen. Saml pladsen agarose plade med pincet og placere den på hovedet på et dækglas på 20 x 20 mm. Når faldet, ikke løfte det op igen eller skub det rundt, fordi det kan medføre bakterier og orme til at blive skubbet ud af deres kamre.
- Montering af skålen:
- Placer dækglas på åbningen af plast skålen. Tryk forsigtigt ned dækglas på ringen lavet af dobbeltsidet tape.Pas på ikke at bryde glasset.
- Vend skålen på hovedet og bruge en P1000 pipette til at udfylde hullet mellem agar plade indeholdende microchambers og agarose reservoir med flydende lav-smeltepunkt agarose afkøles til ca. 30 ° C. Vent indtil agarosen er størknet.
- Forsegl skålen med låg. For inverterede mikroskoper anvender en opvarmet låg. For opretstående mikroskoper bruge en normal låg og forsegle fad med Parafilm.
- Efter at have afsluttet fremstillingen af microchambers, tjek dem under et stereomikroskop. Den korrekte fyldning er afgørende. Se Diskussion for detaljer.
4. Calcium Imaging
- Anvende transgene stammer, der udtrykker genetisk indkodede calcium sensorer såsom HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27.
- Brug en sammensat mikroskop udstyret til wide-field epifluorescens. Tilslut TTL output af EMCCD kamera tilTTL input af LED, således at hver gang kameraet registrerer en ramme prøven vil blive belyst. Brug en eksponeringstid på omkring 5 msek. Brug EM forstærkning i området 50-300.
- Angiv en burst film kørende i 24 timer med hver orm, der afbildes hver 15-30 min første i 20 sek med DIC, så for 20 sek med GFP-fluorescens til at registrere GCaMP, og derefter træffe en endelig billede af mKate2 signalet taget til kontrol for ekspressionsniveauer. Brug en frame rate på 2 / sek i hver burst.
- Til visuel inspektion af data, skal du bruge en falsk farve kort for at øge synligheden af små ændringer i fluorescensintensitet. Plot fluorescerende data som bf / F, med F er den gennemsnitlige baseline værdien af fluorescens. Der findes en detaljeret beskrivelse af calcium dataanalyse i litteraturen 20.
5. Parallel AMI af Multiple Worms
- Anbring fadet indeholder microchambers på mikroskopet, fokus på prøven og engagere autofocus. Oprette en software-protokol, så kameraet får en byge af 40 billedrammer i 20 sek hver halve time i 24 timer, hvilket vil resultere i 1.920 billeder pr orm, en rimelig mængde data. Opsæt scanningen, så den besøger hver orm hjælp scenen. Til formål at filme omkring 30 orme i én køre.
- Billede af flere orme ved at zoome ud, dvs ved hjælp af en lavere forstørrelse. Brug en lavere forstørrelse til at dække flere microchambers med kameraet chip og filme flere tilstødende microchambers samtidigt. Efter afslutningen af billedet erhvervelse, adskille data for hver enkelt kammer ved at beskære et område af interesse, der dækker et dyr.
- Hvis du hurtigt vurdere mobilitet data, brug frame subtraktion 28-32.
6. Imaging forskellige livsfaser af C. elegans
- Brug agarose microchambers for alle livsstadier af C. elegans fra L1 til voksen og herunder dauers. Brug de relevante kammer dimensioner for difskellige livsstadier der er vist i tabel 1.
| Livsfase | Kammer størrelse | Kammer dybde | Typisk optagetid | Forstørrelse |
| L1 | 190 x 190 um | 10 - 15 um | æg - medio L2 | 400X |
| L2 | 370 x 370 um | 15 um | æg - L3 | 200X |
| Dauer larve | 370 x 370 um | 25 um | Fire dage | 200X |
| L3 | 700 x 700 um | 45 um | L2 - L4 | 200X |
| L4 | 700 x 700 um | 45 um | ung L4 - unge voksne | 100X |
| Unge voksne | 700 x 700 um | 45 um 12 - 24 timer | 100X |
Tabel 1. Afdeling størrelser til forskellige livsstadier. Vist er kammer dimensioner og forstørrelser, der er anvendelige til forskellige stadier optimeret til en 8 x 8 mm kamera chip.
Representative Results
Agarose microchambers kan anvendes på enhver livstrin C. elegans. Som det kan ses i figur 1A, kan observeres larveudviklingen og søvn adfærd under L1 lethargus. Vist er kammer størrelser, der er 190 x 190 um, 10 um dyb. Hvis længere tidsskalaer er nødvendige, kan større kamre anvendes. Som det kan ses i figur 1 B, ved anvendelse af et kammer med større dimensioner (370 x 370 um, 25 um dyb) tillader udviklingen af C. elegans fra æg til voksen. Figur 1C viser en analyse af langsigtede ændringer i adfærd ved hjælp af ramme subtraktion af en orm dyrkes i et kammer fra æg til voksen. Vist er middelværdier intensiteter efter ramme subtraktion for udvalgte udladninger under wake og lethargus. Jo lavere gennemsnitlige intensitet efter frame subtraktion værdier er, jo lavere mobiliteten af ormen. Vist er udvalgt burst spor fra én kølvandet tilstand og én lethargus tilstand pr larvestadiet. Denobserverede stigning i den gennemsnitlige intensitet under udvikling skyldes hovedsagelig øget kontrast og størrelse af dyret. Figur 1D viser en dauer larve, en alternativ livsfase, der er engageret under ugunstige miljøforhold 33. Kammer størrelse er 370 x 370 um, 15 um dyb. Bemærk at dauer larve blev anbragt i kammeret uden bakteriel mad, hvilket ville forårsage udgang fra dauer larvestadiet. Figur 1E viser en voksen orm, der allerede lagt mange æg i kammeret. Kammer dimensioner, der anvendes til den voksne var 700 x 700 um, 45 um dyb. Endelig Figur 1F viser en voksen hermafrodit og en mandlig parring inde en voksen kammer.
Calcium imaging i bevægelige orme er muligt med GCaMP calcium sensorer. Figurerne 2A, B viser calcium billeddannelse af kommandoen interneuron AVA for en L1 larve 27. Figurerne 2C, D viser calcium aktivitet for samig type neuron i et voksent dyr.
Opskalering langsigtede imaging er mulig ved scanning og ved at zoome ud. Figur 3A viser billedkvaliteten af samtidige billeddannelse af 30 orme på et kamera chip med et 5 megapixel kamera. Figur 3B viser billedkvaliteten af 4 orme calcium afbildet samtidigt.
Figur 1. Tilpasning af AMI til alle livsstadier af C. elegans. (A) Larva afbildet fra tidlig L1 indtil begyndelsen L2 fase i 190 x 190 um kamre. (B) Udvikling fra æg til voksen i en 370 x 370 um kammer. (C) Mobilitet af en orm vurderet ved hjælp ramme subtraktion. Vist er den gennemsnitlige intensitet alle billeder af billedet efter rammen subtraktion for en valgt burst film for hver larve stage for wake og lethargus adfærd. (D) en dauer larve i fravær af fødevarer i en 370 x 370 um kammer. (E) Voksen hermafrodit med mange æg lagt ind i en 700 x 700 um kammer. (F) Parring af en mandlig og en hermafrodit inde i en 700 x 700 um kammer. YA betyder unge voksne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Calcium billeddannelse med AMI. (A) Calcium billeddannelse med GCaMP3 i kommandoen interneuron AVA af L1 larver ved hjælp af NMR-1 promotor. Vist er to falske farver. I det venstre billede, aktiviteten af AVA er lav, og ormen ikke laver en baglæns bevægelse. I højre billede aktiviteten af AVA er høj, og ormen bevæger sig baglæns. (B) Calcium transienter over tid for en L1 orm. (C, D) Calcium transienter i et voksent dyr. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Imaging flere orme parallelt ved at zoome ud. (A) Samtidig billeddannelse af 30 L1 orme pr ramme ved hjælp af 190 x 190 um kamre og en 100X forstørrelse (ved hjælp af en 10X mål) og en 16.6 x 14 mm kamera chip. (B) Samtidig billeddannelse af fire L3 orme pr ramme under anvendelse af 370 x 370 um kamre og 100X forstørrelse og et område af interesse af en 16,6 x 14 mm kamera chip.et = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Hardware
Fokus for et mikroskop vil typisk glide under billedoptagelse på lang sigt. For sammensatte mikroskoper, fokus-holde-systemer kan købes fra de store mikroskop producenter. I tilfælde af en forbindelse mikroskop med fokus kontrol er for dyrt, ville en simpel alternativ være at anvende et stereomikroskop. Sammensatte mikroskoper tillade brug af målene med høj numerisk apertur (NA) og kan let automatiseres. 40X olie mål er velegnede. Vand nedsænkning linser er ikke ideel på grund af fordampning under langvarig billeddannelse. Differential kontrast interferens (DIC) genererer en nice kontrast, der hjælper til at følge morfologiske og adfærdsmæssige ændringer, men simpelt lyse felt billeddannelse kan også anvendes. For DIC eller lyse felt billedbehandling, bruge rødt lys ved at placere et rødt lys filter i dia-belysning sti af mikroskopet. Til scanning af flere microchambers er nødvendig en automatiseret scene. Bedste præstation er achieved når et stadium anvendes der har ikke-lineær acceleration og deceleration, og kan indstilles til lav scanningshastighed at forhindre forstyrre dyrene under scanningen. Vi har ikke observeret adfærdsmæssige reaktioner eller calcium stigning i mekanosensitive neuroner (ALM og PLM) under scanning, hvilket tyder på at langsom scanning faktisk aktiverer ikke mekanosensitiv system ormen (data ikke vist). Kommercielle LED systemer kan anvendes. Flere selskaber tilbyder klar til brug løsninger, der omfatter dioderne ved forskellige bølgelængder. LED skal have mulighed for eksternt at udløse LED med en TTL signal. En meget følsomme kamera er behov for calcium billeddannelse af bevægelige dyr. EMCCD kameraer er de mest følsomme kameraer på markedet. Kameraet skal have en TTL output under eksponering (også kaldet "ild" output). Et låg varmeren er påkrævet for at forhindre kondens på låget, hvis du bruger et omvendt mikroskop. På en opretstående mikroskop, vil skålen placeres, så låget will være i bunden og dermed kondensvand forhindres, og ikke låg opvarmning er nødvendig. Låget bør stramt lukke fadet for at forhindre fordampning af vand under langvarig billeddannelse.
PDMS frimærker
Overfladen af PDMS stempel, der indeholder den struktur til støbning af agarose står for væk fra objektglasset, som støtter PDMS stempel. En liste med selskaber, der tilbyder tilpassede mikrofluide chips kan findes på Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Påfyldning nematoderne i deres kamre
Dette er det mest kritiske trin i protokollen og de følgende punkter betragtes: A) moistness af agarose er afgørende for at overføre orme og billeddannelse. Hvis agarose er for fugtigt, dvs. at der er en flydende covering et område med flere microchambers, vil det ikke være muligt at fordele bakteriel mad og orme på en kontrolleret måde, fordi væsken vil gøre bakterierne strømme bort. Hvis agarose er for tør så bakterier og orme kan ikke komme ud af pick nemt, hvilket betyder, at øget kraft skal bruges til at droppe de orme og bakterier, som let forårsager skader på agarose. Ved påfyldning i en masse orm agarosen kan tørre op. I værste fald agarosen vil være så tørt i sidste ende at kamrene vil kollapse. Hvis agarose er for tør, kan rehydratiseres ved at placere en lille dråbe (ca. 2 pi) af S-Basal på siden af chippen, hvor der ingen orme. Derefter dyppes platintråden pick i væsken og endog trække noget af væsken i det område, hvor kamrene er fyldt med orme. B) Mængden af fødevarer er afgørende for en vellykket langsigtet billeddannelse. Hvis der ikke er nok føde, kan ormene køre ud af den. Hvis der er for stor fødevarer hulrummet af kammeretvil ikke opføre sig som en væske, men snarere som en solid og vil tillade orme at undslippe fra kammeret ved at skubbe fra bakterierne. Søge at opnå en bakterieopløsning, der fylder hele kammeret. Ormene er i konstant fysisk kontakt med agaren og glasoverfladen langs det meste af deres længde under forsøget og gennemsøgning adfærd synes at være magen til bevægelse på en plade og ulig prygle i væske. C) Mekanisk beskadigelse af agarosen kan ødelægge eksperimentet. Et fint pick er afgørende. Det bør ikke have skarpe hjørner. En blød øjenvipper fastgjort til en pipettespids kan bruges til at flytte bakterier eller orme ind i kamrene i stedet for at bruge en platin pick. I de fleste tilfælde er det dog overtørret agarose er årsagen til skaden. Pick eller øjenvipper bør ideelt set kun lige røre agarose selv, og vandfilmen på agarose overflade skal trække ud orme og bakterier. Når forsegling kamrene, igen, er væsentlig fugten af agarosen. Der bør ikkevære enhver fri væske på agarose overflade, da dette kan vaske væk bakterier og orme under forsegling. Store bobler kan fjernes ved forsigtigt at løfte et hjørne af agar plade. Små bobler, der er mindre end kammeret ofte bliver fanget inde i kamrene. Disse bobler er ikke et problem og vil forsvinde ved absorption. Efter montering fadet, kontrollere igen, at agarose ikke er for tør eller for vådt. Kamrene bør pænt forseglet og der bør ikke være nogen strøm af væske mellem kamrene. Hvis agarose er for vådt, vil kamrene ikke forsegle korrekt. Orme kan flygte eller deres mad vil blive skyllet væk. Hvis prøven er for fugtigt, simple åbne låget og lad agarose tørre i et minut eller to. Hvis agarose er for tør, kan kamrene kollapse og ormene vil undslippe.
Opskalering ved at zoome ud
Til fluorescens billeddannelse, er zoome ud begrænset af den lave mængde lys opnået ved lavere forstørrelser. Også, EMCCD kameraer er optimeret til følsomhed og ofte har en relativt lav opløsning. Men opskalering billeddiagnostik fire gange er vel muligt. For eksempel kan fire kamre i 190 um x 190 um passe på en ramme, når du bruger 140x forstørrelse (opnået ved hjælp af en 20X Målsætning og en 0,7x kamera mount) og en 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm kamera. En høj opløsning kamera med en stor chip (såsom sCMOS kameraer, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 Megapixel) optimerer optrapning af DIC og lyse felt billeddannelse. For eksempel op til 30 L1 orme i 190 um x 190 um kamre kan passe på hver ramme af dette kamera, når der anvendes en 100 x forstørrelse (se figur 3). I princippet zoome ud og scanning kan også kombineres for at opnå endnu større antal dyr. De fleste neuroner bo ganske godt i fokus, således at kun én fokale plan skal afbildes. Hvis neuroner findes at flytte ud af fokus, AZ scanning ved hjælp af en piezo-drev kan tages på hver gang pFælles.
Tilpasning til forskellige adfærdsmønstre
Denne protokol giver en god idé om adfærden på tværs lange tidshorisonter. Naturligvis skal tilpasses forskellige adfærd og livsstadier timingen af byger.
Begrænsninger af teknikken
Flere faktorer begrænse varigheden af billeddannelse. Det vigtigste er mængden af fødevarer. Når maden er forbrugt, larver stoppe udviklingen. Således i små kamre (190 x 190 um) orme udvikler indtil L3 scenen og derefter arrestere. Hvis der kræves længere tid billeddannelse, større kamre skal anvendes. Den maksimale varighed af langsigtet billeddannelse er i intervallet 2,5-3 dage. Hvis længere billedbehandling er påkrævet, orme skal inddrives, og placeres i nye kamre. Når billeddannelse voksne orme, er en anden begrænsning forårsaget af afkom af disse orme. Voksne orme lægge æg, hvorfra larver udklækkes. Disse larver vil også bo inde i kammeret, Forbruge fødevarer og kan forstyrre billedanalyse. Hvis afkom er et problem, en løsning er at enten bruge sterile voksne eller gentagne gange placere orme i friske kamre. At inddrive orme er agarose plade indeholdende kammeret skåret fri med en skalpel, trækkes af dækglasset, og anbringes på en NGM plade, hvorfra ormene kan udvindes. En anden begrænsning er begrænsningen af ormene til relativt små områder. Dette kan være et problem, hvis langtrækkende bevægelse skal analyseres. Mens dyr i kamrene kan stimuleres mekanisk og optogenetically 21,27,34,35, vil den forseglede arten af kammeret gør det vanskeligt at anvende opløselige eller flygtige stimulanser. Biologisk vigtige gasser, såsom oxygen eller carbondioxid kan diffundere frit i agaren. Den store luft reservoir i skålen bør holde koncentrationerne gas i kamrene konstant over den nødvendige tid til eksperimenter. Imidlertid skal det holdes for øje, at den lokale ilt concentration i kammeret kan ligne mere de forhold, der findes i flydende kultur end kultur på pladen.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Mikrofluidenheder har i høj grad avancerede adfærdsmæssige og udviklingsmæssige undersøgt i C. elegans. Ofte er mikrofluide strukturer fremstillet af PDMS 12. Her beskriver vi en protokol til at generere mikrofluide kultur kamre lavet af agarose. Styrken ved denne teknik er kombinationen af høj billedkvalitet, korrelation af adfærd med fysiologiske målinger, langsigtet billedbehandling og et rimeligt højt gennemløb. Høj billedkvalitet opnås ved billeddannelse gennem dækglas anvendelse af høje NA mål. Som et resultat heraf kan fluorescensimagografi såsom calcium billeddannelse og konfokal billeddannelse af subcellulære strukturer skal udføres. Fordi dyrene ikke immobiliseres ligesom i andre systemer, gør det en korrelation af adfærd med fysiologiske målinger. BecABrug dyrene har rigelig mad, fortsætter de udvikler tillader langsigtet billeddannelse. Dette system kan billede mange orme i et løb, fordi dyrene er begrænset til deres definerede kamre. Således kan denne fremgangsmåde let opskaleres 9,27,34-36.
Fremtidige applikationer
Hidtil har dette system hovedsageligt blevet anvendt til at studere søvn adfærd i C. elegans L1 larver. Tilpasning til alle faser, vil dog gøre det muligt at studere en bred vifte af adfærd også i dauers og voksne. En bred vifte af adfærd kan studeres med denne teknik lige fra parring til æglægning.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Max Planck Society og en Göttingen Graduate School Junior Group stipendium til HB finansierede dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
| Top Vision low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| Stereomicroscope | Leica | M5 | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
| Lid heater | MPI workshop | custom made | |
| Plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
| Double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 25 mm x 33 m | alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |
References
- Brenner, S.
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
- Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).
- Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A.
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208 (2008).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
- Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
- Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
- Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
- Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198 (2008).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
- Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
- Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
- Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
- Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782 (2013).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
- Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
- Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853 (2013).
